初次診斷的特發(fā)性間質(zhì)性肺炎患者外周血DcR3含量的檢測精

1、目的檢測初次診斷的間質(zhì)性肺炎(IIP)患者血清中DcR3水平的變化并探討其臨床 價值。方法 采用雙抗體夾心BAS ELISA法和RT PCR分別檢測103例IIP患者和 81例健康對照組血清中DcR3水平和外周血PBMC中DcR3基因相對表達(dá)水平。結(jié)果IIP組血DcR3水平(3.825 2 ±421 8)ng/dl高于正常對照組(1.007 9±).479 3 ng/dl)(Pv0.01); IIP組患者PBMC中DcR3基因的相對表達(dá)水平(0.421 ±.076)高于正常對照組(0.213 ±.067 ) (Pv0.05)。結(jié)論 檢測血清DcR3水平有

2、助于診斷早期IIP?！娟P(guān)鍵詞】間質(zhì)性肺炎；DcR3近年來的研究發(fā)現(xiàn)，多種疾病如否性腫瘤、自身免疫性疾病及移植排斥等均與DcR3具有相關(guān)性。目前對 DcR3表達(dá)研究多采用 Northern blot、Western blot和免 疫組化等方法，對血清DcR3的定量檢測少有報(bào)道。筆者利用本室合成的DcR3抗體和本室建立的雙抗體夾心 BAS ELISA方法對初次診斷的特發(fā)性間質(zhì)性肺炎 (IIP)患者以及健康對照者的血清 DcR3含量進(jìn)行比較，觀察血清 DcR3水平與IIP 的相關(guān)性，從而為IIP的診斷提供一個簡捷方法，為IIP治療提供可參考的途徑。1對象與方法1.1對象我院2007年9月至2008年

3、8月住院的初次診斷(病程v 3個月)IIP的患者103 例，其中男57例，女46例，年齡4571歲，平均54.6歲，均符合2000年美國 胸科學(xué)會(AST)和歐洲呼吸學(xué)會(ERS)共同提出的IIP臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；健康對照81 例，男性48例，女性33例，年齡4268歲，平均53.3歲，為各項(xiàng)檢查正常的 體檢人員。1.2主要試劑和儀器十二烷基肌氨酸鈉、DEPC購自Sigma公司，Oligo d(T)、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑、Taq DNA聚合酶、細(xì)胞分離液等購自Promega公司。引物由上海生 工生物工程公司合成并純化。雙抗體夾心BAS ELISA試劑盒為本研究室提供。高速低溫離心機(jī) H

4、ERMLEZ383K (HERMLE LABOTECHNIK ，GERMANY)，凝 膠電泳成像分析系統(tǒng)Tannon GIS1000( Tannon有限公司，上海)，純水系統(tǒng)MILIPORE(MILIPORE Com，USA)，深低溫冰箱 Formo (Formon Com, USA)， 恒溫水浴箱DK28D(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)，PCR儀FeroTec杭州PCR儀有限公 司)。1.3方法1.3.1密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞(P BMC) 研究對象各取靜脈血5 ml，肝素抗凝；加入含5 ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中， 離心2 000 r/min，20 min，可見血漿與分離液的界面上有

5、一白膜層，此即所需的PBMC。吸出細(xì)胞至另一試管用生理鹽水洗 3遍，離心2 000 r/min, 5 min,棄上 清。1.3.2雙抗體夾心BAS ELISA法檢測血清中DcR3水平取1.3.1步驟中所得血漿作為標(biāo)本，雙抗體夾心 BAS ELISA操作過程參照試劑盒 說明，分別用B10 RAD550型酶標(biāo)儀測定450 nm的A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算 樣品中DcR3含量。1.3.3人PBMC總RNA的提取在上述PBMC標(biāo)本中加入變性裂解液Trizol 1 ml吹打使細(xì)胞充分溶解，置室溫 5 min后加入氯仿200仏1劇烈震蕩15 s,室溫5 min，4 C 12 000 r/min離心15 mi

6、n，取上清加入等體積的異丙醇，混勻后 -20C 1 h，4C 12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入75%乙醇1 ml，4C 7 500 r/min離心5 min，吸去乙醇自然干 燥1020 min,溶于10卩l(xiāng) DEP(水中。此即人外周血總 RNA。1.3.4逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA在上步得到的10卩模板RNA中，加入1卩l(xiāng) DEP(水，1卩引物Oligo d(T)，稍離 心，100C沸水1 min；加入2卩l(xiāng) dNTP 4卩l(xiāng) 5 x buffer,2卩逆轉(zhuǎn)錄酶，稍離心，42C水浴90 min；沸水3 min,滅活A(yù)MV，得到總cDNA。1.3.5聚合酶鏈反應(yīng)PCR擴(kuò)增DcR3基

7、因(214 bp)和p actinS因(570 bp)弓I物序列：DcR3基因弓I物正義鏈為5 TCAATGGCCAGGCTCTTC 3,反義鏈為 5 GCCTCTTGATGGAGATGTCC 3; P actinS因弓I物正義鏈為 5 TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA 3 ，反義鏈為 5 CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATTGGAGGG 3。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理血清中DcR3含量及外周血PBMC DcR3 mRNA水平以x±s表示，兩總體均數(shù)比 較采用t檢驗(yàn)，以簡明統(tǒng)計(jì)軟件(CS10.32)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2結(jié)果2.1血清DcR3含量IIP組血

8、清DcR3含量(3.825 2 1.421 8) ng/d顯著高于健康對照組(1.0079 ±).4793) ng/d(Pv 0.01)。2.2 IIP患者組與健康對照組 DcR3基因mRNA表達(dá)的比較IIP患者與健康人均檢測到 DcR3基因的表達(dá)，DcR3基因電泳條帶顯示在214 bp 處，與預(yù)先設(shè)計(jì)的片段大小一致；內(nèi)參照基因片段570 bp也全部可見條帶。DcR3基因在IIP患者PBMC中高水平表達(dá)(0.421 ±.076),健康人呈低水平表 達(dá)(0.213 ±.067),兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pv 0.05)。3討論近年Wu等1報(bào)道通過ELISA方法檢測

9、了 146例腫瘤患者血清DcR3水平， 結(jié)果顯示56.2%（82/146）腫瘤患者血清DcR3陽性，其中檢測陽性者幾乎（82/83）均 為惡性腫瘤患者，而97.9%正常人和急性感染患者 DcR3陰性。同時，該研究還 發(fā)現(xiàn)在胃癌患者血清DcR3水平與分化程度、TNM分期密切相關(guān)，當(dāng)腫瘤切除治 療后，血清DcR3水平急劇下降，可見DcR3不但有助于惡性腫瘤的診斷，術(shù)后 檢測DcR3水平還有助于判斷腫瘤是否切除完全或有無復(fù)發(fā)。隨后Chen等2同樣利用ELISA方法意外發(fā)現(xiàn)腎功能不全患者血清 DcR3水平顯著增高。除肺癌 外，目前對其他呼吸系統(tǒng)疾病的可溶性 DcR3水平的檢測未見報(bào)道，前期筆者通 過定

10、量RT PCR方法發(fā)現(xiàn)DcR3基因在特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（IPF）患者PBMC中表 達(dá)明顯高于健康人，DcR3基因表達(dá)水平與IPF患者肺限制性通氣功能障礙、彌 散功能障礙呈正相關(guān)3。本文以健康體檢者為對照，通過雙抗體夾心BASELISA方法進(jìn)一步檢測了 IIP血清DcR3含量，結(jié)果表明：IIP患者血清DcR3水 平顯著高于正常對照組（PV0.01）。筆者選擇了病程V 3個月的初次診斷IIP患者， 且樣本量是目前文獻(xiàn)報(bào)道最大的，因此可以說明DcR3的檢測可以早期診斷IIP。7。Monks8根據(jù)IIP是以干咳、進(jìn)行性勞力性氣促為主要臨床表現(xiàn)的一種肺炎。其病理特點(diǎn)為上 皮細(xì)胞損傷、基底膜脫落、間質(zhì)炎癥

11、、成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)增加、膠原 沉積及肺泡氣體交換單位重塑等4。該病發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，一般認(rèn)為 在肺纖維化形成過程中，首先在各種致病因素作用下，肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮 細(xì)胞的損傷，形成肺泡炎的初始階段，隨后病變進(jìn)一步發(fā)展，炎癥細(xì)胞和免疫效 應(yīng)細(xì)胞進(jìn)入肺內(nèi)并激活、釋放各種活性介質(zhì)，在各種免疫細(xì)胞及其介質(zhì)的作用 下，成纖維細(xì)胞的活化增殖，膠原生成增多，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，最終導(dǎo)致肺纖維 化的形成。近年來有學(xué)者認(rèn)為肺泡或支氣管上皮細(xì)胞過度凋亡在肺纖維化的發(fā)生 發(fā)展中起到重要的作用5。研究表明向大鼠支氣管內(nèi)注入 Fas抗體誘導(dǎo)了細(xì)支 氣管和肺泡上皮細(xì)胞的凋亡，1 w后發(fā)現(xiàn)有肺纖維化反應(yīng)6。應(yīng)用

12、血管緊張素 轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑（z VAD fmk）可阻斷肺纖 維化模型中肺泡上皮細(xì)胞的凋亡，減少膠原基質(zhì)沉積IPF時Fas水平增高，推測上調(diào)肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，引起I型上皮細(xì)胞及肺泡毛細(xì)血管膜受損。同時凋亡細(xì)胞刺激周圍的正常細(xì)胞使TGF P及細(xì)胞清除減少可能導(dǎo)致了間質(zhì)性肺疾?。↖LD）發(fā)生發(fā)外基質(zhì)的合成功能紊亂，導(dǎo)致纖維組織增生、膠原沉積，最終導(dǎo)致肺的彌散功能 障礙。由上可見，早期肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過度、修復(fù)增加，而后 期炎癥和免疫活性細(xì)胞凋亡不足、 展。DcR3可與Fas競爭FasL,抑制凋亡，故推測103例初次診斷的病程小于3個

13、月的IIP患者,Fas/FasL是最主要的凋亡途徑，DcR3與IIP相關(guān)。本研究檢測了 其血清DcR3的水平代表了 IIP的早期病變，符合上述推測。但隨著病程的進(jìn) 展，DcR3的水平增高是促進(jìn)IPF的發(fā)生發(fā)展抑或是對機(jī)體的一種保護(hù)性反應(yīng)還 有待于進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1金倩；氯地酊聯(lián)合激光治療座瘡158例療效觀察J;廣東醫(yī)學(xué)；1997年10期2董新亭，李衛(wèi)莉，張隨學(xué)；自擬粉刺消治療座瘡126例J;中國中醫(yī)藥科技;1999年06期3查旭山，陳修飏;尋常座瘡治療體會J;江西中醫(yī)藥;httP：/ 年 05期4張隨學(xué)，譚正輝，孫葉梅，李梅，俞玉芳，韓峰;3003例座瘡患者特征分析與控制對策J；中華醫(yī)

14、學(xué)美學(xué)美容雜志； 年 06 期5劉勇，王冬梅;座瘡的藥物治療J;臨床醫(yī)藥實(shí)踐雜志;2003年09期6高宜云;座瘡從肝論治J;中醫(yī)藥臨床雜志;2004年03期7歐其平，林維山；中西醫(yī)結(jié)合治療座瘡J;中華皮膚科雜志;2004年09期8陳五一;座瘡辨治體會J;世界中醫(yī)藥;httP：/www.xtd- 03 期9雷放;中藥熱敷治療座瘡有效J;新中醫(yī); 年 09 期10李東華;異維生素A酸治療座瘡J;新醫(yī)學(xué) 期11黃燦奇;針刺聯(lián)合中藥內(nèi)服外敷治療青少年座瘡臨床觀察D;南方醫(yī)科大學(xué);2011年12陳志彬；中醫(yī)綜合療法對女性座瘡患者皮膚生理指標(biāo)影響研究D;廣州中醫(yī)藥大學(xué)；2011年13陳傳偉;針刺干預(yù)慢性疲勞綜合征的臨床及作用機(jī)理研究D;廣州中醫(yī)藥大學(xué);2010年14 Hamid Abdi;針刺對伊朗肥胖者的體重及抗熱休克蛋白27、60、65、70的影響D;北京中醫(yī)藥大學(xué); 年15陳玉騏;背俞穴刺絡(luò)放血治療座瘡的臨床研究D;廣州中醫(yī)藥大學(xué);2009年16張隨學(xué);電針鎮(zhèn)痛的腦功能磁共振初步研究D;復(fù)旦大學(xué);2005年17龐瑩;座瘡的流行病學(xué)及與雄激素受體基因多態(tài)