人神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書

1、人神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供體外研究使用產(chǎn)品編號：E0068h預(yù)期應(yīng)用ELISA法定量測定人血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)含量。實(shí)驗(yàn)原理用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗GFAP抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗GFAP抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的GFAP呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。 試劑盒組成及試劑配制 1. 酶聯(lián)板

2、：一塊（96孔） 2. 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為50 ng/ml，做系列倍比稀釋(注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋)后，分別稀釋50 ng/ml，25 ng/ml，12.5 ng/ml，6.25 ng/ml，3.12 ng/ml，1.56 ng/ml，0.78 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制25 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）50 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此

3、類推。3. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。4. 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。5. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。6. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul），實(shí)際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。7. 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。8. 底物溶液：1×10ml/瓶。

4、 9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。11. 覆膜：1×5張 標(biāo)本的采集及保存 1. 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?/p>

5、標(biāo)本放于-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。注：以上標(biāo)本置4保存應(yīng)小于1周，-20或-80均應(yīng)密封保存，-20不應(yīng)超過3個月，-80不應(yīng)超過6個月；標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測；高血脂的標(biāo)本不需進(jìn)行特殊處理，可直接檢測。操作步驟實(shí)驗(yàn)開始前，請?zhí)崆芭渲坪盟性噭?；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時，均應(yīng)用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。建議各實(shí)驗(yàn)室在操作前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以建立最佳稀釋倍數(shù)。1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100

6、ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（在使用前一小時內(nèi)配制），37,60分鐘。3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。 4. 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37，60分鐘。5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）

7、。6. 依序每孔加底物溶液90ul，37避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后立即進(jìn)行檢測。注：1. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔（不同于空白孔），該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。 2. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所

8、有試劑都必須在使用前達(dá)到室 溫。使用后立即冷藏保存試劑。3. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，避免酶標(biāo)板長時間處于干燥狀態(tài)。4. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。5. 在儲存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射。6. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8保存。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用，請精確配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10ul），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造

9、成的濃度誤差；檢測液A、B，以及底物溶液在使用前，應(yīng)置于37溫育30分鐘；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。7. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。特異性 本試劑盒可同時檢測重組或天然的人神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。計算 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）

10、，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線（推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如curve expert 1.3），根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。 注意事項(xiàng)1. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。2. 一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣。3. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。4. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請最后乘以稀釋倍數(shù)。5. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢

11、測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。6. 底物請避光保存。檢測范圍：0.78 ng/ml - 50 ng/ml最低檢測限： ng/ml說明 1. 只有全部使用USCNLIFE試劑才能保證檢測效果，因?yàn)樗性噭┒际怯嘘P(guān)聯(lián)的，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守USCNLIFE試劑的試驗(yàn)說明才會得到最佳的檢測結(jié)果。2. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。3. 小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品，酶結(jié)合物或底物時，第一個孔與最后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。而且，洗滌不充分將影響試驗(yàn)結(jié)果。4. 試劑盒保存：短期