常溫組織RNA提取創(chuàng)新

1、常溫組織RNA提取注意事項(xiàng)背景知識(shí)高濃度蛋白質(zhì)變性劑(如GIT、GuHCl等)的裂解方法，是抽提RNA的首選?？俁NA的抽提，最重要的是快速裂解細(xì)胞膜，至于與基因組DNA相連接的蛋白質(zhì)的裂解以及基因組與蛋白質(zhì)“纏”住的問(wèn)題，因?yàn)槎疾粫?huì)對(duì)以后的純化產(chǎn)生大的影響，可以不考慮。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而迅速抑制住細(xì)胞內(nèi)的RNA酶，確保了RNA的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品主要是植物，其它絕大部分樣品的RNA的抽提，都可以以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎(chǔ)的。RNA抽提的問(wèn)題，簡(jiǎn)單可歸納為三個(gè)：降解、純度、得率。判斷這三個(gè)指標(biāo)的基本手段是：電泳和紫外分光光度儀。降解只能通過(guò)電泳判斷；純

2、度和得率主要使用紫外分光光度儀檢測(cè)，但電泳也可以提供簡(jiǎn)單參考。要正確解讀電泳或者紫外分光光度儀的結(jié)果，首先就要對(duì)這兩個(gè)方法有基礎(chǔ)的了解。如果抽提基因組DNA的最大問(wèn)題是純度，那么，抽提總RNA的最大問(wèn)題是降解。降解主要來(lái)自兩個(gè)方面：樣品的內(nèi)源酶的作用和最后溶解用水及離心管的不干凈。對(duì)大部分實(shí)驗(yàn)人員來(lái)說(shuō)，RNA抽提比基因組DNA抽提要困難得多。事實(shí)上，現(xiàn)有的 RNA抽提方法/試劑，如果用于從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提RNA，比抽提基因組DNA更方便，成功率也更高。那為什么同樣的方法用于組織RNA的抽提，總會(huì)碰到問(wèn)題呢？ 組織RNA抽提失敗的兩大現(xiàn)象是：RNA降解和組織內(nèi)雜質(zhì)的殘留。關(guān)于降解問(wèn)題，首先看一下為

3、什么從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提RNA不容易降解?，F(xiàn)有的RNA抽提試劑，都含有快速抑制Rnase的成分。在培養(yǎng)細(xì)胞中加入裂解液，簡(jiǎn)單的混勻，即可使所有的細(xì)胞與裂解液充分混勻，細(xì)胞被徹底裂解。細(xì)胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住細(xì)胞內(nèi)的Rnase，所以RNA得以保持完整。也就是說(shuō)，培養(yǎng)細(xì)胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸并被及時(shí)裂解，所以其RNA不容易被降解；反過(guò)來(lái)講，組織中的RNA之所以容易被降解，是因?yàn)榻M織中的細(xì)胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。因此，假定有一種辦法，在抑制RNA活性的同時(shí)能使組織變成單個(gè)細(xì)胞，降解問(wèn)題也就可以徹底解決了。液氮碾磨就是最有效的這樣一種辦法。但是，液氮碾磨方法非常麻煩，

4、如果碰到樣品數(shù)比較多的時(shí)候更加會(huì)有此感覺(jué)。這樣就產(chǎn)生了退而求其次的方法：勻漿器。勻漿器方法沒(méi)有考慮細(xì)胞與裂解液接觸前如何抑制 Rnase活性這個(gè)問(wèn)題，而是祈禱破碎組織的速度比細(xì)胞內(nèi)的Rnase降解RNA的速度快。電動(dòng)勻漿器效果較好，玻璃勻漿器效果較差，但總的來(lái)說(shuō)，勻漿器方法是不能杜絕降解現(xiàn)象的。因此，如果抽提出現(xiàn)降解，原來(lái)用電動(dòng)勻漿器的，改用液氮碾磨；原來(lái)用玻璃勻漿器的，改用電動(dòng)勻漿器或者直接用液氮碾磨，問(wèn)題幾乎100%能獲得解決。影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的雜質(zhì)殘留問(wèn)題，其原因比降解更多樣，解決方法相應(yīng)也不同。總之，如果出現(xiàn)降解現(xiàn)象或者組織內(nèi)雜質(zhì)殘留現(xiàn)象，則必須對(duì)具體實(shí)驗(yàn)材料的抽提方法/試劑進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化

5、大可不必使用您的寶貴樣品：可以從市場(chǎng)上購(gòu)買一些魚/雞之類的小動(dòng)物，取相應(yīng)部分的材料用于RNA抽提，其它部分用于抽提蛋白質(zhì)用嘴碾磨，腸胃抽提。 基因組DNA殘留，是一個(gè)容易被廠家糊弄的概念。如果你判斷基因組 DNA是否殘留的標(biāo)準(zhǔn)是電泳，那么，許多產(chǎn)品都可以做到“無(wú)基因組 DNA殘留”。這時(shí)，你需要問(wèn)一下：基因組 DNA殘留影響的后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要是什么？是 PCR。理論上，PCR的靈敏度是一個(gè)分子，也就是 pg級(jí)的 DNA殘留；電泳可以看見(jiàn) DNA條帶的極限，則不小于 ng級(jí)。電泳看不見(jiàn) DNA殘留的意義是，DNA殘留少。實(shí)踐證明，無(wú)論是 TRIzol方法、柱離心式方法、甚至包括柱內(nèi) DNase I消

6、化 DNA的方法，都無(wú)法確保徹底去除 DNA；真正能徹底去除 DNA殘留的方法，只有液體體系下 DNase I的消化。實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備究竟怎樣才能確保RNA抽提的成功率呢？實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備是非常重要的。首先，要了解你的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，了解你的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中可能存在的隱患：是否有同事在進(jìn)行DNA抽提？是否實(shí)驗(yàn)室人員眾多？第二，要了解你可以使用的設(shè)備：離心機(jī)是否可以低溫操作？破碎、勻漿的條件怎樣？第三，要了解抽提RNA的目的。第四，要了解樣品的采集、制備、保存的條件，了解樣品的特點(diǎn)。在對(duì)上面四點(diǎn)有了充分的了解后，才能正確選擇合適的方法/試劑，提高抽提的成功率。選擇合適的方法/試劑，這是非常重要的一步；好的方法/試

7、劑在確保成功的同時(shí)，操作方便，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。0：抽提RNA的目的RNA用于不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其質(zhì)量要求不盡相同。cDNA文庫(kù)構(gòu)建要求RNA完整而無(wú)酶反應(yīng)抑制物殘留；Northern對(duì)RNA完整性要求較高，對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RT-PCR對(duì)RNA完整性要求不太高，但對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。投入決定產(chǎn)出；每次都以獲得最高純度的RNA為目的，勞民傷財(cái)。1：樣品的收集/保存影響降解的因素樣品離開活體/或者原來(lái)的生長(zhǎng)環(huán)境后，樣品中的內(nèi)源酶即會(huì)開始降解RNA，降解速度與內(nèi)源酶含量及溫度有關(guān)。傳統(tǒng)上，只有兩個(gè)辦法可以徹底抑制內(nèi)源酶活性：立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿；切成小塊后立即投入液氮冷凍。這

8、兩個(gè)辦法都要求操作快速。后者適合所有的樣品，而前者只適合細(xì)胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。液氮碾磨是杜絕內(nèi)源酶作用的好方法；但如果在碾磨過(guò)程中；因?yàn)闆](méi)有及時(shí)補(bǔ)充液氮導(dǎo)致樣品融化，則總RNA被降解得更快。具體地講，植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等最好都先用液氮冷凍起來(lái)，再往下做。 樣品勻漿后的保存，在-20C可以保存一個(gè)月左右，但最好使用更低溫度保存。新鮮樣品的保存，則首先使用液氮速凍，再轉(zhuǎn)移到-70C以下溫度保存。新鮮樣品直接保存還要注意一點(diǎn)，就是先將樣品分割成小塊后再保存，而不是大塊保存，用前再分割。采集的組織也可以放入RNAguard中保存，-20C一年不會(huì)

9、降解。2：樣品的破碎及勻漿影響降解和得率的因素樣品的粉碎是為了徹底勻漿，勻漿是為了使細(xì)胞破裂，使總RNA徹底完整地釋放出來(lái)。一般講來(lái)，細(xì)胞無(wú)須粉碎即可直接勻漿，組織需要破碎后才能勻漿，酵母菌和細(xì)菌需要先用相應(yīng)的酶破壁后才能勻漿。內(nèi)源酶含量較低并且較容易勻漿的組織可以在裂解液中通過(guò)勻漿器一次完成破碎和勻漿過(guò)程；植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等樣品，它們不是內(nèi)源酶含量高，就是不容易勻漿，所以必須將組織的粉碎和勻漿分開操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的勻漿方法是使用電動(dòng)勻漿器。使用液氮碾磨要特別注意一點(diǎn)：在整個(gè)碾磨過(guò)程中，樣品不得融化，因?yàn)槔鋬鲞^(guò)的樣品

10、內(nèi)必定形成冰晶，破壞了細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，使其內(nèi)源酶更容易起作用。帶針頭的一次性注射器是一個(gè)非常有用的工具。與玻璃允漿器相比，它有三大優(yōu)點(diǎn)：非常方便；允漿更徹底；可以更好地打斷基因組DNA，從而降低裂解液黏度。強(qiáng)烈建議在抽提總RNA前準(zhǔn)備一些一次性注射器，以便在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，一旦發(fā)現(xiàn)裂解液體系較為粘稠，可以及時(shí)解決。3：裂解液的選擇影響操作方便程度，內(nèi)源雜質(zhì)殘留的因素常用的裂解液幾乎都能抑制Rnase活性，因此，選擇裂解液的重點(diǎn)是要結(jié)合純化方法一起考慮。只有兩個(gè)例外：高內(nèi)源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂解液，以增加滅活內(nèi)源酶的能力；部分樣品(主要是植物)不能使用含苯酚的裂解液/或者只能使用某些特別的

11、裂解液。4：純化方法的選擇影響內(nèi)源雜質(zhì)殘留，抽提速度的因素對(duì)于干凈的樣品，如細(xì)胞，手邊的幾乎任何純化方法都可以獲得滿意的結(jié)果。但對(duì)于許多其它樣品，尤其是植物，肝臟，細(xì)菌等雜質(zhì)含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關(guān)重要的。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響RNA后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，且重復(fù)性高，但價(jià)格較貴；使用經(jīng)濟(jì)而經(jīng)典的純化方法，如LiCl沉淀等，也可以獲得滿意的結(jié)果，但操作時(shí)間長(zhǎng)，重復(fù)性較低。抽提操作中的注意事項(xiàng)抽提操作中的主要事項(xiàng)，首先要參考試劑供應(yīng)商的建議。無(wú)論使用的是柱離心式抽提方法，還是經(jīng)典抽提方法，下面幾點(diǎn)注意事項(xiàng)都是通用的。1：操作快速。主要指從樣品脫離其正常生長(zhǎng)條件到徹底

12、勻漿之間的時(shí)間要盡可能短。樣品被徹底勻漿后，RNA是相對(duì)穩(wěn)定的；此時(shí)保持正常的操作速度就可以了。2：樣品要一個(gè)一個(gè)裂解。在同時(shí)抽提多個(gè)樣品時(shí)，操作應(yīng)該是：取出一個(gè)樣品，加入裂解液，徹底勻漿，置于冰上；再取出第二個(gè)樣品同樣處理，直到樣品全部處理完畢。再同步繼續(xù)后面的操作。絕對(duì)不能在所有樣品中加入裂解液后再一個(gè)一個(gè)勻漿。3：樣品不要過(guò)量。RNA抽提如果出現(xiàn)了問(wèn)題，除了沒(méi)有獲得RNA外，全部都可以由樣品過(guò)量引起。換一個(gè)講法，如果你的起始樣品量比較大，而抽提又出現(xiàn)了問(wèn)題，你就不容易直觀找到原因。樣品凍融的影響實(shí)驗(yàn)表明，冷凍組織在融化過(guò)程中比新鮮組織更容易發(fā)生RNA的降解。可能的原因是：凍融過(guò)程破壞了細(xì)

13、胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)，使內(nèi)源酶更容易與RNA直接接觸。下面是發(fā)生凍融的幾種常見(jiàn)情況：1：冷凍保存的樣品，抽提前的切割。2：冷凍保存樣品，抽提前稱重。3：液氮碾磨過(guò)程中沒(méi)有及時(shí)補(bǔ)充液氮。4：冷凍樣品不經(jīng)過(guò)液氮碾磨直接加入裂解液勻漿。如果操作中存在樣品凍融的可能，而所獲得的RNA也出現(xiàn)了比較強(qiáng)烈的降解，就一定要去除/降低凍融的影響。RNAguard保存的樣品沒(méi)有凍融問(wèn)題。RNAguard：抑制組織/細(xì)胞內(nèi)源酶的試劑確保RNA不降解的傳統(tǒng)做法是：在取組織前將含液氮的容器放在手邊，一旦取出所需組織，立即切割小后投入液氮中。抽提前先在碾缽中加入適量的液氮，再將組織從液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾缽中碾磨。碾磨過(guò)

14、程中要及時(shí)補(bǔ)充液氮以防止組織融化。待組織徹底碾磨碎后，等待剩余液氮恰好揮發(fā)完時(shí)，立即將碾磨碎的組織移入裂解液中快速勻漿.安全的稱重幾乎不可能。這么嚴(yán)格的操作，是沒(méi)有多少實(shí)驗(yàn)人員去認(rèn)真執(zhí)行的。RNAguard能快速抑制樣品中的內(nèi)源酶活性，確保動(dòng)物組織/細(xì)胞中的RNA在37C一天不降解，25C一周不降解，4C一個(gè)月不降解，-20C一年以上不降解。RNAguard適用的樣品包括：動(dòng)物組織，培養(yǎng)細(xì)胞，昆蟲，及部分植物組織。經(jīng)過(guò)RNAguard處理的樣品可以用幾乎所有常用的RNA方法/試劑抽提RNA，所有的操作與用新鮮組織沒(méi)有什么不同。使用RNAguard的操作非常簡(jiǎn)單：在取組織前預(yù)先估計(jì)組織的重量，在

15、一個(gè)容器中加入5-10倍體積的RNAguard，放在手邊。取出所需組織后，立即切割成厚度小于0.5厘米，放入含 RNAguard的容器中即可。抽提前先用鑷子將組織從RNAguard中取出，在室溫進(jìn)行切割和稱重后，移入裂解液中快速勻漿。如果您面臨下面的情況之一，您一定會(huì)發(fā)現(xiàn)使用RNAguard的好處： 1：實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有液氮罐或者70C冰箱保存樣品。2：易降解樣品的RNA抽提或者抽提RNA經(jīng)常碰到降解問(wèn)題。3：樣品必須準(zhǔn)確稱重。4：大規(guī)模RNA的抽提。5：樣品的采集手術(shù)室，野外等。67：樣品的郵寄。 RNA抽提的“三大紀(jì)律八項(xiàng)注意”紀(jì)律一：杜絕外源酶的污染。 注意一：嚴(yán)格戴好口罩，手套。 注意二：認(rèn)

16、真處理實(shí)驗(yàn)所涉及到的試劑、耗材、環(huán)境。：阻止內(nèi)源酶的活性 注意三：選擇合適的勻漿方法。 注意四：選擇合適的裂解液。 注意五：控制好樣品的起始量。 注意六：勻漿操作快速而徹底。紀(jì)律三：明確自己的抽提目的 注意七：任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時(shí)，抽提成功率急劇下降。 注意八：RNA抽提成功的唯一經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的一次成功，而不是得率。Rnase污染的10大來(lái)源1：手指頭手指頭是外源酶的第一來(lái)源，所以必需戴手套并且頻繁更換。另外，口罩也必需戴，因?yàn)楹粑彩且粋€(gè)重要的酶來(lái)源。戴手套口罩的另外的好處是保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員。2：槍頭，離心管，移液器單純的滅菌是不能滅活Rnase的，所以槍頭和離心管要用D

17、EPC處理，即使是標(biāo)明為DEPC處理過(guò)的。移液器最好是專用的，用前用75%的酒精棉球搽拭干凈，尤其是桿子；另外，一定不要使用褪頭器。3：水/緩沖液一定要確保無(wú)Rnase污染。4：實(shí)驗(yàn)臺(tái)面最起碼要用75%的酒精棉球搽拭干凈。5：內(nèi)源Rnase 所有組織均含內(nèi)源酶，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。液氮保存/碾磨方法的確不方便，但對(duì)有一些內(nèi)源酶含量很高的組織，卻是唯一的辦法。6：RNA樣品 RNA抽提產(chǎn)物可能都會(huì)含痕量的Rnase污染。7：質(zhì)粒抽提質(zhì)粒抽提往往用到Rnase降解RNA，殘留的Rnase要用Proteinase K消化，PCI抽提。8：RNA保存即使低溫保存，痕量的Rnase亦會(huì)

18、導(dǎo)致RNA降解。長(zhǎng)期保存RNA的最好辦法是鹽/醇懸液，因?yàn)榇荚诘蜏貢r(shí)抑制所有的酶活性。9：陽(yáng)離子(Ca, Mg) 在含這些離子時(shí)，80C加熱5分鐘會(huì)導(dǎo)致RNA被剪切，故如果RNA需要被加熱，保存液需要含螯合劑(1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。10：后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的酶酶均有可能被Rnase污染。RNA抽提的10大竅門1：快速阻止Rnase活性樣品收集后快速冷凍，裂解時(shí)快速操作滅活Rnase。2：選擇合適的抽提方法高核酶含量的組織，脂肪組織最好用含苯酚的方法。3：預(yù)判質(zhì)量要求 Northern，cDNA文庫(kù)構(gòu)建對(duì)完整性要求高，RT-PCR, RPA (Ribonuclease

19、 protection assay)對(duì)完整性要求不是很高。RT-PCR對(duì)純度(酶抑制物殘留)要求很高。4：徹底勻漿是提高得率和降低降解的關(guān)鍵。5：檢查 RNA的完整性電泳檢測(cè)，28S:18S =2:1是完整的標(biāo)志，1:1對(duì)大部分實(shí)驗(yàn)也是可以接受的。6：去除DNA 用于RT-PCR, array analysis最好用Dnase I去除DNA。7：降低外源酶的污染不能從外面又導(dǎo)入酶。8：低濃度的核酸濃縮時(shí)，要加入助沉淀試劑。但要防止助沉淀劑含酶及DNA污染。9：徹底溶解RNA，必要時(shí)可以65C加熱5分鐘。10：合適的保存方法短時(shí)間可以20C保存，長(zhǎng)期請(qǐng)保存于80C。提高RNA得率的方法首先要知道

20、，不同的樣品其RNA含量差別很大。高豐度(2-4ug/mg)的如肝臟、胰腺、心臟，中豐度(0.05-2ug/mg)的如腦、胚胎、腎臟、肺、胸腺、卵巢，低豐度( 12,000x g)離心10分鐘。棄沉淀。3： 在上清中加入異丙醇；徹底混勻后，室溫放置1 - 5分鐘。7,500x g離心5分鐘，小心棄上清。4： 在沉淀中加入室溫的75乙醇，來(lái)回顛倒離心管使沉淀懸浮后，7,500x g離心5分鐘。小心棄上清。同樣再洗滌一次。5： 室溫靜置使沉淀恰好干燥。用水溶解RNA后，保存于70oC以下。不同抽提總RNA方法的比較柱離心式TRIzol ReagentRNAex Reagent是否使用苯酚否是否操作操作簡(jiǎn)單、速度快。取上清比較復(fù)雜、速度慢。操作簡(jiǎn)單、速度快。基因組DNA殘留有，比較少，但電泳可能可以看見(jiàn)。有，非常少，電泳可能看不見(jiàn)。有，比較少，但電泳可能可以看見(jiàn)。如何徹底去除基因組DNA殘留DNase I消化DNase