常用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量

1、* *6 種方法測定蛋白質(zhì)含量一、微量凱氏(kjeldahl)定氮法樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨(消化)，氨又與硫酸作用， 變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液 被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：nh2ch2cooh+3h2so4 - 2co2+3so2+4h2o+nh32n h3+h2so4- (n h4)2so4 (2)(n h4)2so4+2 naoh- 2h2o+na2so4+2 nh3 (3)反應(yīng)(1 )、(2)在凱氏瓶內(nèi)完成，反應(yīng)(3)在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行。為了加速消化，可以加入 cuso4 作催化劑，k2

2、so4 以提高溶液的沸點。收 集氨可用硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)酸。實驗和計算方法這里從略。計算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以 6.25 即得。二、雙縮脲法(biuret法)(一)實驗原理雙縮脲(nh3conhconh3 )是兩個分子脲經(jīng) 180 C 左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與cuso4 形成紫色絡(luò)合物，稱為* *雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比， 而與蛋

3、白質(zhì)分子量及氨基酸成 分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為 1-10mg 蛋白質(zhì)。干擾這一測 定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、tris 緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì) 少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精 確的蛋白質(zhì)測定。（二） 試劑與器材1試劑：（1） 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（bsa）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白， 配制成 10mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液， 可用 bsa 濃度 1mg/ml 的 a280 為 0.66 來 校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量， 計算出其

4、純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用h2o 或 0.9%nacl 配制，酪蛋白用 0. 05n naoh 配制。（2） 雙縮脲試劑：稱以 1.50 克硫酸銅（cuso4?5h2o ）和 6.0 克酒石酸鉀 鈉（knac4h4o6 ?4h2o ），用 500 毫升水溶解，在攪拌下加入 300 毫升 10% naoh 溶液，用水稀釋到 1 升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可 長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。2.器材：* *可見光分光光度計、大試管 15 支、旋渦混合器等。（三） 操作方法1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取 12 支試管分兩組，分別

5、加入 0 , 0.2 , 0.4 , 0.6 ,0.8 , 1.0 毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到1 毫升，然后加入 4 毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（2025C）下放置 30 分鐘，于 540nm 處進(jìn)行比 色測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，光吸收值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、 樣品的測定：取 23 個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋 白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過 10mg/ml。三、folin酚試劑法（lowry法）（一）實驗原理這種蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一。 過去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法， 由于其試劑乙

6、的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法 所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即 folin 酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色 反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。 folin 酚試劑中的磷鉬酸鹽一磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還 原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的 量成正比。folin 酚試劑法最早由 lowry 確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在 生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏 得多，缺點

7、* *是費時間較長，要精確控制操作時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形 式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾 lowry 反應(yīng)。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris 緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5% ），硫酸納（1%），硝酸納（1% ），三氯乙酸（0.5% ），乙醇（5%），乙醚（5%）， 丙酮（0.5% ）等溶液對顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉一氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度 較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉一氫氧化鈉溶液的濃度12 倍。進(jìn)行測定

8、時，加 folin 酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性ph 條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在 ph=10 的情況下發(fā)生，故當(dāng) folin 一酚試劑加 到堿性的銅一蛋白質(zhì)溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸一磷鎢酸試劑被 破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達(dá) 5mg。通常測定范圍是 20250mg。（二）試劑與器材1試劑（1 ）試劑甲：（a） 10 克 na2co3 ,2 克 naoh 和 0.25 克酒石酸鉀鈉（knac4h4o6 ?4h2o ）。溶解于 500 毫升蒸餾水中。（b） 0.5 克硫酸銅（cuso4 ?5h2o ）溶解于

9、100 毫升蒸餾水中，每次使用* *前，將 50 份（a）與 1 份（b）混合，即為試劑甲。（2） 試劑乙： 在 2 升磨口回流瓶中， 加入 100 克鎢酸鈉 （na2wo4 ?2h2o ） ,25 克鉬酸鈉（na2moo4 ?2h2o ）及 700 毫升蒸餾水，再加 50 毫升 85%磷酸，100 毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流 10 小時，回流結(jié)束時，加入150 克硫酸 鋰（Ii2so4 ）, 50 毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰 15 分 鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴 的步驟）。稀釋至 1 升,過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。

10、使用時用標(biāo)準(zhǔn) naoh 滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水 1 倍，使最終的酸濃度為 1n 左右。（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白或 g球蛋白，溶于蒸 餾水，濃度為 250mg/ml 左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用 0.9%nacl 溶液。2.器材（1） 可見光分光光度計（2） 旋渦混合器（3） 秒表（4） 試管 16 支（三）操作方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取 16 支大試管，1 支作空白，3 支留作未知樣品，其 余試管分成兩組，分別加入 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) 溶液（濃度為 250mg/ml ）。用水補(bǔ)足到 1.0 毫升，

11、然后每支試管加入 5 毫升 試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（2025C）放置 10 分鐘。再逐管 加入 0.5 毫升試劑乙（folin 酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度* *要快， 否則會使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30 分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于 700nm 處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量 為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線* *注意：因 lowry 反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時 間，即第 1 支試管加入 5 毫升試劑甲后，開始計時，1 分鐘后，第 2 支試管加入 5 毫升試劑甲，2 分鐘后加第 3 支試管，

12、余此類推。全部試管加完試劑甲后若已 超過 10 分鐘，則第 1 支試管可立即加入 0.5 毫升試劑乙，1 分鐘后第 2 支試管 加入 0.5 毫升試劑乙，2分鐘后加第 3 支試管，余此類推。待最后一支試管加完 試劑后，再放置 30 分鐘，然后開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。進(jìn)行多試管操作時，為了防止出錯，每位學(xué)生都必須在實驗記錄本上預(yù)先畫 好下面的表格。表中是每個試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下 的順序，逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和測得的 吸光度值。folin 酚試劑法實驗表5.05.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

13、0.50.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白質(zhì)的量（mg）吸光度值（a700）管號123標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)00.145670.2 0.4 0.6 0.8 1.010（250mg/ml ）未知蛋白質(zhì)0.2 0.4 0.6(約 250mg/ml )蒸餾水1.00.9 0.8 0.6 0.4 0.200.8 0.6 0.4試劑甲試劑乙* *2. 樣品的測定：取 1 毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì) 20250 微克），按 上述方法進(jìn)行操作，取 1 毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。 通常樣品的測定也 可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定放在一起，同時進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的各試管后面，再

14、增加 3 個試管。如上表中的 & 9、10 試管。根據(jù)所測樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量， 從而計算出 樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。注意:由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度（相對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。四、改良的簡易folin酚試劑法（一） 試劑1.試劑甲：堿性銅試劑溶液中，含 0.5n naoh、10%na2co3、0.1%酒石 酸鉀和0.05%硫酸銅，配制時注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解后， 最后加入。2試 劑乙：與前面的基本法相同。臨用時加蒸餾水稀釋 8 倍。3. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：同基本法。（

15、二） 操作步驟測定標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品溶液的操作方法與基本法相同。 只是試劑甲改為 1 毫升, 室溫放置 10 分鐘后，試劑乙改為 4 毫升。在 55C恒溫水浴中保溫 5 分鐘。用流動水冷卻后，在 660nm 下測定其吸光度值。* *改良的快速簡易法，可獲得與 folin 酚試劑法（即 lowry 基本法）相接近 的結(jié)果。五、考馬斯亮蘭法（bradford法）（一）實驗原理雙縮脲法（biuret 法）和 folin 酚試劑法（lowry 法）的明顯缺點和許多 限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測定的方法。1976 年由 bradford 建立的考馬斯亮蘭法（bradford 法），是根據(jù)蛋白質(zhì)

16、 與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu) 點，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法?？捡R斯亮蘭 g-250 染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收 峰的位置（Imax），由 465nm 變?yōu)?595nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸 （特別是精氨酸）和芳香族氨 基酸殘基相結(jié)合。在 595nm 下測定的吸光度值 A595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。bradford 法的突出優(yōu)點是：（1）靈敏度高，據(jù)估計比 lowry 法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá) 1mg 這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)

17、生的顏色變化很大， 蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高 的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比 lowry 法要大的多。（2 ）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要 5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要 2 分鐘即可完成，其顏色可 以在1 小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在 5 分鐘至 20 分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而 完全不用像lowry 法那樣費時和嚴(yán)格地控制時間。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾 lowry 法的 k+、na+、mg2+離子、tris 緩沖液、 糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、edta 等均不干擾此測定法。* *此法的缺點是：（1） 由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香

18、族氨基酸的含量不同，因此 bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差， 在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用 g球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2 ）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、tritonx-100、十二烷基硫酸鈉（sds）和 0.1 n 的 naoh。（如同 0.1 n 的酸干擾 lowary 法一樣）。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用beer 定律進(jìn)行計算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。（二）試劑與器材1. 試劑：（1 ） 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液， 用 g 球蛋白或 牛血清清蛋白（bsa） ， 配制成 1.0mg/ml和 0.1mg/ml 的標(biāo)

19、準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。（2） 考馬斯亮蘭 g 250 染料試劑：稱 100mg 考馬斯亮蘭 g 250，溶 于50ml 95%的乙醇后，再加入 120ml 85%的磷酸，用水稀釋至 1 升。2. 器材：（1） 可見光分光光度計（2） 旋渦混合器(3)試管 16 支(三)操作方法1.標(biāo)準(zhǔn)方法* *(1 )取 16 支試管，1 支作空白，3 支留作未知樣品，其余試管分為兩組按 表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無離子水 補(bǔ)充到0.1ml。最后各試管中分別加入 5.0ml 考馬斯亮

20、蘭 g 250 試劑，每加完 一管，立即在旋渦混合器上混合(注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消 除)。未知樣品的加樣量見下表中的第 8、9、10 管。(2 )加完試劑 2-5 分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣 品在595nm 處的光吸收值 a595，空白對照為第 1 號試管，即 0.1mlh2o 力卩 5.0mlg 250試劑。注意：不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿， 使用后立即用少量 95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或 丙酮長時間浸泡?？捡R斯亮蘭法實驗表管號 12345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)0 0.01 0.02 0.04

21、0.06 0.08 0.10(1.0mg/ml)未知蛋白質(zhì)0.02 0.04 0.06(約 1.0mg/ml)蒸餾水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.0200.08 0.06 0.04考馬斯亮藍(lán)g 250 試劑 5.05.05.0 5.05.05.05.05.0* *5.05.0每管中的蛋白質(zhì)量（mg ）光吸收值（a595）（3）用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg ）為橫座標(biāo)，用吸光度值 a595 為縱座標(biāo)，作圖，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的未知樣品的 a595 值，即可查 出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。0.5mg 牛血清蛋白/ml 溶液的 a595 約為 0.50。2.微量法

22、當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時（10 100mg/ml ），可將取樣量（包括補(bǔ)加的 水）加大到 0.5ml 或 1.0ml,空白對照則分別為 0.5ml 或 1.0ml h2o,考馬斯亮 藍(lán) g 250 試劑仍加 5.0ml,同時作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定 595nm 的光吸收值。0.05mg 牛血清蛋白/ml 溶液的 a595 約為 0.29。六、紫外吸收法蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm 處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在 238nm 的光吸收值與肽鍵含量成正 比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液

23、的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度 的鹽，* *例如生化制備中常用的（nh4）2so4 等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特 別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化， 而不需知道其絕對值。此法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)， 有一定的誤差。故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)， 會出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干 擾可以通過查

24、校正表，再進(jìn)行計算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ５且驗椴煌牡?白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的 誤差。此外，進(jìn)行紫外吸收法測定時，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因 ph 的改變而有變 化，因此要注意溶液的 ph 值，測定樣品時的 ph 要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的 ph 相一 致。下面介紹四種紫外吸收法：1.280nm 的光吸收法因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在 280nm 處具有最大吸收， 且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在 280nm 處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。測定時，將待測蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水

25、 或緩沖液）作空白對照，在紫外分光度計上直接讀取 280nm 的吸光度值 a280。 蛋白質(zhì)濃度可控制在 0.11.0mg/ml 左右。通常用 1cm 光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿， 盛有濃度為1mg/ml 的蛋白質(zhì)溶液時，a280 約為 1.0 左右。由此可立即計算出 蛋白質(zhì)的大致濃度。許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長下的光吸收值(al % 1cm )有文獻(xiàn)數(shù)據(jù) 可查，根* *據(jù)此光吸收值可以較準(zhǔn)確地計算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與(al % 1cm )值(即蛋白質(zhì)溶液濃度為 1%，光徑為 1cm 時的光吸收值)的關(guān) 系。文獻(xiàn)值 a1 % 1cm,?稱為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。蛋白質(zhì)濃度 =(

26、a280 10 )/ a1 % 1cm,280nm (mg/ml)(q 1% 濃度?10mg/ml)例：牛血清清蛋白 ：a1 % 1cm=6.3 (280nm)溶菌酶： a1 % 1cm=22.8 (280nm)若查不到待測蛋白質(zhì)的 a1 % 1cm 值，則可選用一種與待測蛋白質(zhì)的酪氨酸 和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測定。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制的濃度為 1.0mg/ml。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白(bsa)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取 6 支試管，按下表編號并加入試劑：管號123456bsa (1.0mg/ml)01.02.03.04.05.0h2o5.04.03.02.0

27、1.00a280用第 1 管為空白對照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計上測定吸光度a280，以 a280 為縱座標(biāo)，各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量(mg )為橫座標(biāo)作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)為直線，利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的未知樣品的a280 值，即可查 出未知樣品的蛋白質(zhì)含量，也可以用 2 至 6 管 a280 值與相應(yīng)的試管中的蛋白質(zhì)* *濃度計算出該蛋白質(zhì)的 al % 1cm,280nm2. 280nm 和 260nm 的吸收差法核酸對紫外光有很強(qiáng)的吸收，在 280nm 處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng) 10 倍（每克）， 但核酸在 260nm 處的吸收更強(qiáng)，其吸收高峰在 260nm 附近。核酸 260nm 處 的

28、消光系數(shù)是 280nm 處的 2 倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm 紫外吸收值大于 260nm 的吸收值。通常：純蛋白質(zhì)的光吸收比值：a280/a260 ? 1.8純核酸的光吸收比值： a280/a260 ? 0.5含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測定其 a280 和 a260，由此吸收差值，用 下面的經(jīng)驗公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45Xa280 0.74Xa260此經(jīng)驗公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì) （酵母烯醇化酶） 和核 酸 （酵母核酸）的混合液所測定的數(shù)據(jù)來建立的。3. 215nm 與 225nm 的吸收差法蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用 280nm 的光吸收測定時，可用215nm 與 225nm 吸收值之差，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)， 配制成 20100 mg/ml 的一系列 5.0ml 的蛋白 質(zhì)溶液，分別測定 215nm 和 225nm 的吸光度值，并計算出吸收差：吸收差 d= a215 a225以吸收差 d 為縱座標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。再測出未