基因分型技術(shù)

1、 個體化診斷的內(nèi)容個體化診斷的內(nèi)容 個體化診斷的技術(shù)簡介個體化診斷的技術(shù)簡介 技術(shù)原理技術(shù)原理年齡年齡老年人老年人兒童兒童新生兒新生兒 性別性別身高身高/體重體重 并發(fā)癥并發(fā)癥病程病程 什么是個體化分子診斷臟器功能臟器功能肝肝, 腎腎, 心心環(huán)境因素環(huán)境因素飲食飲食 / 吸煙吸煙/ 合并用藥合并用藥藥物反應(yīng)個體差異藥物反應(yīng)個體差異基因基因個體化基因檢測方向 突變 （mutation） 表達(dá)水平（level of expression)o甲基化修飾（methylation)基因突變檢測技術(shù) 測序； 探針；o質(zhì)譜；基因突變檢測技術(shù)測序測序探針探針質(zhì)譜質(zhì)譜原始信號原始信號光光光一級信息一級信息探針結(jié)

2、合分子量二級信息二級信息序列是否改變分子大小是否改變推論推論推論推論最終信息最終信息 堿基序列是否改變堿基序列是否改變PPiATPLightlighttimeSignal45%E ES SGGT TC CT TGG5T TC CGGT TA A10GGT TC CGGC C15T TGGA AT TC C20GGT TA AGGT T25C CGGA A0200400600800100012001400Sequence to analyze: YGYGGTGYGTATYGTTTGYGATSequence to analyze: YGYGGTGYGTATYGTTTGYGATDispensatio

3、nDispensationOrder:Order:48%47%45%45%探針技術(shù)的常見應(yīng)用ARMs液相芯片基因芯片熒光PCR引物數(shù)量2222探針SybGreen引物固定于磁珠的探針固定于玻片探針熒光探針信號捕捉CCDCCD掃描儀或肉眼CCD判讀光信號的有無光信號的有無探針技術(shù)Taqman 野生型的序列為 TTGTGGTAGTTGGAGCTGG 12ASP突變型（ARMS）引物P1 TTGTGGTAGTTGGAGCTGA 12ASP突變型（ARMS）引物P2 TTGTGGTAGTTGGAGCTCA 12ASP突變型（ARMS）引物P3 TTGTGGTAGTTGGAGCAGA探針法的案例探針法的

4、案例ARMS圖1 3條ARMS引物的擴(kuò)增曲線（模板為3*108 copies/ul野生型質(zhì)粒）圖2 3條ARMS引物的擴(kuò)增曲線（模板為3*108 copies/ul突變型質(zhì)粒）基因突變檢測技術(shù)對比基因突變檢測技術(shù)對比性能性能測序技測序技術(shù)術(shù)探針探針DHPLC熒光熒光PCR基因芯基因芯片片 懸液芯片懸液芯片ARMS檢測通量檢測通量高高低低高高高高低低高高靈敏、準(zhǔn)確度靈敏、準(zhǔn)確度高高高高一般一般高高一般一般高高重復(fù)性重復(fù)性好好好好一般一般好好好好好好可否定量可否定量是是否否是是是是否否否否技術(shù)可靠性技術(shù)可靠性金標(biāo)準(zhǔn)金標(biāo)準(zhǔn)/基因突變檢測技術(shù)對比 金標(biāo)準(zhǔn)（Golden standard）在檢測中的作用

5、： 現(xiàn)有技術(shù)所能達(dá)到的最先進(jìn)水平，最接近客觀事實(shí)，或者反映的就是客觀事實(shí)本身； 如同病理診斷；為什么測序是金標(biāo)準(zhǔn)？ 人類基因組計劃（human genome project, HGP ）； 1990年正式啟動人類基因組測序計劃, 2003年完成。 識別人類基因組的所有大約3萬個DNA 測定組成人類基因組DNA的約30億對核苷酸的序列 基因測序技術(shù)的進(jìn)展基因測序技術(shù)的進(jìn)展Sanger法第一代測序1977年簡單、快捷現(xiàn)代測序法第二代測序?qū)崟r檢測費(fèi)用更低通量更高速度更快第二代測序技術(shù)第二代測序技術(shù)o第二代測序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的第二代測序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測序，即通

6、過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定末端的標(biāo)記來確定DNADNA的序列，現(xiàn)有的技術(shù)平臺的序列，現(xiàn)有的技術(shù)平臺: :第二代測序技術(shù)Roche/454 FLXIllumina AB SOLID system測序片段比較長，高質(zhì)量的讀長能達(dá)到400bp測序性價比最高，不僅機(jī)器的售價比其他兩種低，而且運(yùn)行成本也低測序的準(zhǔn)確度高，原始堿基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%測序應(yīng)用的新高度 對定性檢測（Qualitative test ）進(jìn)行定量分析（Quantitative Test ）；突變定量檢測的必要性 突變負(fù)荷（mutational load ）； 疾病不同階段（stage of disease）； 對應(yīng)的

7、策略不同； 準(zhǔn)確度高準(zhǔn)確度高 靈敏度高靈敏度高 相對定量判讀相對定量判讀可檢測3%的突變野生型突變型302060501010040908070基因所占比例靈敏度：3%靈敏度：靈敏度：30%30%PCR擴(kuò)增PCR amplification2h測序樣本準(zhǔn)備Sample preparation15minDNA提取DNA purification2hPyro測序Pyrosequencing10-100min結(jié)果分析Genotyping and identification收取樣本：血樣或組織基因表達(dá)水平的檢測 檢測mRNA的水平；基因表達(dá)水平的檢測技術(shù) mRNA的降解； 20時，Y=0.62-0.0

8、04X（R=-0.981，P0.001）； 15時，Y =0.965-0.001X（R=-0.709，P0.001）； Y：18sRNA含量 X：離體時間 對標(biāo)本位置的要求； mRNA表達(dá)水平是相對定量mRNAmRNA差異表達(dá)的相對定量分析差異表達(dá)的相對定量分析兩種相對定量的分析方法：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法和Delta-delta Ct法。基因修飾的檢測DNA甲基化修飾： 基因甲基化的檢測意義基因甲基化檢測的意義 目前腫瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。這是因?yàn)槿藗儼l(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生與抑癌基因啟動子區(qū)的CpG島甲基化造成抑癌基因關(guān)閉非常可能有關(guān)。o甲基化的診斷可以用于腫瘤發(fā)生的早期預(yù)測o腫瘤的分級o甚至可以作為患病風(fēng)險預(yù)測、臨床病程監(jiān)控和療效評估的指標(biāo)。焦磷酸檢測基因甲基化甲基化程度的量化無法定量的甲基化檢測基因突變檢測技術(shù)測序測序探針探針質(zhì)譜質(zhì)譜原始信號原始信號光光光一級信息一級信息探針結(jié)合分子量二級信息二級信息序列是否改變分子大小是否改變推論推論推論推論最終信息最終信息 堿基序列是否改變堿基序列是否改變