PCR技術(shù)及應(yīng)用JYHppt課件

1、PCR技術(shù)及應(yīng)用分子生物學(xué)診斷組 江楊華 2019年3月25日 星期五l PCR的定義l PCR的原理l PCR反應(yīng)體系的的成分及其作用l PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化l PCR技術(shù)的特點(diǎn)l PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法l PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用 一、PCR的定義lPCRpolymerase chain reaction) ： 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。是近年來發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。l PCR技術(shù)是由美國(guó) 的Kary Mullis 于1985年發(fā)明，用此方法可以將微量目的DNA片段擴(kuò)增一百萬倍以上。由于PCR方法帶來的革命性作用，Kary Mullis 本人因此獲1993

2、年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。二、PCR技術(shù)的原理 PCR技術(shù)，其原理是模擬天然DNA的復(fù)制過程：以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，在DNA聚合酶的作用下，以一對(duì)分別與模板5末端和3末端互補(bǔ)的引物寡核苷酸片段引導(dǎo)下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制合成新的子鏈DNA的過程，重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到不斷的擴(kuò)增。二、PCR技術(shù)的原理 PCR反應(yīng)主要分為三個(gè)步驟：變性、退火、延伸。1.變性 (Denaturation)： 加熱使模板DNA雙鏈堿基間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈的過程。溫度一般為90-95度。2. 退火 (復(fù)性) (Annealling): 溫度降低后，變性后的DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合的過程。溫度

3、一般為Tm-5度。二、PCR技術(shù)的原理 3. 延伸 (Extension): 在適宜溫度下，在DNA聚合酶作用下，以4種 dNTPs等為 原料，從引物的 3 端開始，結(jié)合單核苷酸，形成與模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈的過程。 耐熱DNA聚合酶最適溫度為72 。 上述 3 步為一個(gè)循環(huán)，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量就增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過35個(gè)循環(huán)后，理論上DNA的量可達(dá)到235倍。 PCR 的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟變性變性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C第第n次循環(huán)次循環(huán)二、PCR技術(shù)的原理1. 緩沖液：緩沖液： 10 50 mM Tris- Cl (pH8.

4、4)： 維持維持 Taq 酶作用環(huán)境酶作用環(huán)境的偏堿性的偏堿性 25 50 mM KCl： 促進(jìn)引物退火，促進(jìn)引物退火，50 mM 會(huì)抑制會(huì)抑制 Taq 酶的活性。酶的活性。 100g / ml 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 (BSA)： 對(duì)酶有一定的保護(hù)對(duì)酶有一定的保護(hù)性，如質(zhì)量不好將起相反的作性，如質(zhì)量不好將起相反的作 用，建議使用乙酰化的用，建議使用乙?；?BSA。明膠、。明膠、Tween-20、 二硫蘇糖醇二硫蘇糖醇 (DTT) 也有類也有類似作用。似作用。三、PCR反應(yīng)體系的的成分及其作用 2. MgCl2 ： Taq 酶具有酶具有 Mg2+依賴性，顯著影依賴性，顯著影響反應(yīng)的特異性和

5、擴(kuò)增片段的產(chǎn)量，濃度一響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增片段的產(chǎn)量，濃度一般為般為1.5 2.0 mM，濃度過高能增加非特異，濃度過高能增加非特異擴(kuò)增并影響產(chǎn)率，過低則酶活性顯著下降。擴(kuò)增并影響產(chǎn)率，過低則酶活性顯著下降。 3. dNTPs : dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP。濃度一般為濃度一般為0.05 0.2 mM。 過高能加快反過高能加快反應(yīng)速度，但可增加堿基的錯(cuò)誤摻入應(yīng)速度，但可增加堿基的錯(cuò)誤摻入 率和室驗(yàn)率和室驗(yàn)成本。成本。 過低則反應(yīng)速度下降，但可提高實(shí)驗(yàn)過低則反應(yīng)速度下降，但可提高實(shí)驗(yàn)的精確性。的精確性。三、PCR反應(yīng)體系的的成分及其作用 4. 引物引物 (Primer)：是一段寡

6、核苷酸片段，即：是一段寡核苷酸片段，即預(yù)擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列。濃度一般預(yù)擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列。濃度一般為為0.2 1 uM，偏高：非特異產(chǎn)物擴(kuò)增及錯(cuò)，偏高：非特異產(chǎn)物擴(kuò)增及錯(cuò)配，增加引物之間形成引物二聚體，產(chǎn)量降配，增加引物之間形成引物二聚體，產(chǎn)量降低。低。 偏低：產(chǎn)量降低。偏低：產(chǎn)量降低。 5. Taq DNA 聚合酶：耐高熱，最初從火山口聚合酶：耐高熱，最初從火山口細(xì)菌中提取，具有連接酶活性和細(xì)菌中提取，具有連接酶活性和5 端至端至 3端端的外切酶活性。目前市售的均為克隆表達(dá)產(chǎn)的外切酶活性。目前市售的均為克隆表達(dá)產(chǎn)物。物。三、PCR反應(yīng)體系的的成分及其作用 6. 模板模板DNA

7、 (Template): 可以是可以是DNA，也可以是，也可以是RNA，RNA的擴(kuò)增首的擴(kuò)增首先需逆轉(zhuǎn)錄成先需逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進(jìn)行正常的后才能進(jìn)行正常的PCR循循環(huán)。環(huán)。 待擴(kuò)增的核酸需部分純化，使核酸標(biāo)本中不含待擴(kuò)增的核酸需部分純化，使核酸標(biāo)本中不含蛋白酶、核酸酶、蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑以及能聚合酶抑制劑以及能與與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。結(jié)合的蛋白質(zhì)。 模板的量一般微克水平或模板的量一般微克水平或102 105 拷貝，拷貝， 過過高會(huì)引起非特異產(chǎn)物的增加；高會(huì)引起非特異產(chǎn)物的增加； 過低則產(chǎn)量降過低則產(chǎn)量降低。低。 7. 水：水： 去離子水，補(bǔ)足整個(gè)反應(yīng)體積。去離子水，補(bǔ)足整個(gè)

8、反應(yīng)體積。三、PCR反應(yīng)體系的的成分及其作用 10buffer： 130 / 10 = 3l MgCl2: 1.530 / 25 = 1.8l dNTPs: 0.230 / 10 = 0.6l 引物引物 P： 0.4302 / 10 = 2.4l Taq 酶酶(5U/l)：1 / 5 = 0.2l 模板：模板： 1l 水：水： 30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21lPCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系：30ul 四、四、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：反應(yīng)條件優(yōu)化： 1、溫度、循環(huán)參數(shù)：、溫度、循環(huán)參數(shù)： 變性溫度和時(shí)間：變性溫度和時(shí)間： 保證模板保證模板DNA解鏈完全是保證整個(gè)解鏈完全是保證整個(gè)PCR

9、擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。 加熱加熱9095，30 60 s，再復(fù)雜，再復(fù)雜的的DNA分子也可變性為單鏈。根據(jù)模板分子也可變性為單鏈。根據(jù)模板DNA復(fù)雜程度，可以調(diào)整變性溫度和時(shí)復(fù)雜程度，可以調(diào)整變性溫度和時(shí)間。一般情況下選擇間。一般情況下選擇94 30 ，可使各，可使各種復(fù)雜的種復(fù)雜的DNA分子完全變性。分子完全變性。 溫度過高或高溫持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng)，可溫度過高或高溫持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng)，可對(duì)對(duì)Taq酶活性和酶活性和dNTP分子造成損害。分子造成損害。四、四、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：反應(yīng)條件優(yōu)化： 復(fù)性溫度和時(shí)間：復(fù)性溫度和時(shí)間： PCR擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與擴(kuò)增特異性取決于復(fù)性過程中引物與

10、模板模板 的結(jié)合。的結(jié)合。 復(fù)性溫度的選擇，可根據(jù)引物的長(zhǎng)度和復(fù)性溫度的選擇，可根據(jù)引物的長(zhǎng)度和G+C含量確定，長(zhǎng)度在含量確定，長(zhǎng)度在15 25 bp 之間時(shí)，復(fù)之間時(shí)，復(fù)性溫度性溫度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 計(jì)算得到，一般計(jì)算得到，一般位于位于40 60，30 60 s。 復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性復(fù)性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復(fù)性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。 一般情況下選擇一般情況下選擇55 30，足以使引物與，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。模板之間完全結(jié)合。四、四、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：反應(yīng)條件優(yōu)化： 延伸溫度和時(shí)間：延伸溫度和時(shí)間： 一

11、般位于一般位于Taq酶最適作用溫度酶最適作用溫度70 75 之間。之間。 引物小于引物小于16個(gè)核苷酸時(shí)，過高的延伸溫度不個(gè)核苷酸時(shí)，過高的延伸溫度不利于引利于引 物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70 75 。 延伸反應(yīng)時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)延伸反應(yīng)時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，度而定， 1Kb需加長(zhǎng)延需加長(zhǎng)延伸時(shí)間，伸時(shí)間，10Kb片段延伸時(shí)間可達(dá)片段延伸時(shí)間可達(dá)15分鐘。分鐘。 延伸時(shí)間過長(zhǎng)可出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，常用延伸時(shí)間過長(zhǎng)可出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，常用72 1。 四、四、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：反應(yīng)條件優(yōu)化： 循環(huán)數(shù)：循環(huán)數(shù)： 其他參數(shù)選定后，其他參數(shù)選定后，PC

12、R循環(huán)次數(shù)主要取循環(huán)次數(shù)主要取決于模板決于模板DNA的濃度。的濃度。 理論上說理論上說25 30次循環(huán)后，次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步積累即可達(dá)到最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模，因此不管模板濃度是多少，板濃度是多少，30 35次是比較合理的循次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。環(huán)次數(shù)。 循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴(kuò)增增加。PCR擴(kuò)增的特點(diǎn)基線期、指數(shù)期、平臺(tái)期PCR程序四、四、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化：反應(yīng)條件優(yōu)化：2、PCR反應(yīng)體系成分的優(yōu)化反應(yīng)體系成分的優(yōu)化 MgCl2濃度：濃度： 1.5

13、2.0 mM 模板：模板： dNTP： 0.05 0.2 mM 引物：引物： 0.2 1 M 注：引物設(shè)計(jì)總原則是提高擴(kuò)增的效注：引物設(shè)計(jì)總原則是提高擴(kuò)增的效率和特異性。率和特異性。 引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)原則 長(zhǎng)度長(zhǎng)度1530 b，過短特異性降低，過長(zhǎng)則成，過短特異性降低，過長(zhǎng)則成本增加，產(chǎn)量也下降。本增加，產(chǎn)量也下降。 引物堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、引物堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物嘧啶堆積現(xiàn)象，引物 G+C 含量宜在含量宜在45 55%左右。左右。 引物內(nèi)部不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會(huì)形引物內(nèi)部不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物之間尤其在

14、成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物之間尤其在 3 末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不然會(huì)形成引物二末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不然會(huì)形成引物二聚體。聚體。引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)原則 引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性(70%)或少于連續(xù)或少于連續(xù)8個(gè)的互補(bǔ)堿基。要求在引個(gè)的互補(bǔ)堿基。要求在引物設(shè)計(jì)時(shí)采用計(jì)算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析。物設(shè)計(jì)時(shí)采用計(jì)算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析。 引物的引物的 5 末端堿基：并沒有嚴(yán)格的限制，只末端堿基：并沒有嚴(yán)格的限制，只要與模板要與模板DNA結(jié)合的引物長(zhǎng)度足夠，其結(jié)合的引物長(zhǎng)度足夠，其 5 末末端堿基可以不與模板端堿基可以不與模板DNA匹配呈游離狀態(tài)。匹配呈

15、游離狀態(tài)。最多可游離最多可游離10個(gè)堿基并不影響個(gè)堿基并不影響PCR反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)進(jìn)行。引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)原則 引物的引物的 3 末端堿基：原則上要求引物末端堿基：原則上要求引物的的3末端與模板末端與模板DNA一定要配對(duì)，另外一定要配對(duì)，另外 3末端的末位堿基在很大程度上影響著末端的末位堿基在很大程度上影響著 Taq 酶的延伸效率。酶的延伸效率。 引物引物3末端堿基在末端堿基在錯(cuò)誤配對(duì)時(shí)不同堿基的引發(fā)效率存在很錯(cuò)誤配對(duì)時(shí)不同堿基的引發(fā)效率存在很大差異，最好選大差異，最好選T、G、C，而不選，而不選A。引物設(shè)計(jì)軟件：引物設(shè)計(jì)軟件：Primer7.0、Oligo6.0五、PCR技術(shù)的特點(diǎn)l 高度靈

16、敏l 高特異性l 簡(jiǎn)便快捷1、凝膠電泳分析法： 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳2、分子雜交：基因芯片和原位雜交3、限制性內(nèi)切酶酶切分析：點(diǎn)突變4、測(cè)序5、Real-time PCR：不是對(duì)PCR終產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)六、六、PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法產(chǎn)物的檢測(cè)方法Real-time實(shí)時(shí)熒光定量） PCR原理：所謂實(shí)時(shí)熒光定量原理：所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用 熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知量模板進(jìn)進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知量模板進(jìn) 定量分析的方法。定量分析的方法。檢測(cè)方法

17、：檢測(cè)方法：1.SYBRGreen法法: 在在PCR反應(yīng)體系中，加入過量反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺霟晒馊玖咸禺愋缘負(fù)饺?DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光 信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。產(chǎn)物的增加完全同步。 注：注：PCR產(chǎn)物熔解曲線圖產(chǎn)物熔解曲線圖(單一峰圖表明單一峰圖表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性)2.TaqMan探針法單鏈探針法單鏈DNA探針）探針）: 探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增時(shí)，Taq 酶的酶的5-3外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離， 從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分鏈，就有一個(gè)熒光分子子 形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。產(chǎn)物的