分子生物學試驗常用工具酶總結

1、分子生物學實驗常用工具酶總 結作者:日期:現(xiàn)代分子生物學實驗手冊工具酶基因工程：在人工可以控制條件下，將基因剪切或重新組合，再導入另一生 物體內，使這些基因在其中表達并遺傳下去的一門技術。核心:對基因進行人工切割、連接和重新組合，構建重組D NA。工具酶:在基因工程的重組DNA過程中，所需要用到的酶的統(tǒng)稱。一、限制性內切酶（restri c t ion endonuclease）主要功能：對外源性的雙鏈D NA進行切割、水解，不允許外源性D NA存在 于細菌自身細胞內。 （這種酶能對在自身細胞內存在的 DNA種類給予限制一 限制性內切酶）限制-修飾系統(tǒng)：合成限制性內切酶的細胞，其自身的D NA

2、不受酶的切割，這 是因為細菌細胞還會合成一種修飾酶，可以對自身DNA進行修飾，即改變D NA 原來具有的可以被限制性內切酶識別的核酸順序結構，從而不被限制性內切酶識別及切割、水解。保護自身遺傳物質穩(wěn)定的機制。限制性內切酶：從原核生物中發(fā)現(xiàn)的，約60 0種，可識別108種不同的特定 DNA順序。以內切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵， 產生DNA片段的5'端為 P,3端為-?OH。命名：獲得該酶的細菌屬名的第一個字母（大寫 ）+該菌種名的前兩個字母 （小寫）+株系的字母（小寫）或數字+羅馬數字（同一株菌種不同內切酶的編號） 例：細菌屬名細菌種名菌株名稱限制酶名稱Arthrob a cterl

3、u t eu sA 1 u IEsch erich i acoliRY13EcoR iB a c i 1 lusamy 1 o 1 iqu e f acie nsHH a mH IHaemop h ilusinflue n zaeRdHind III（一）三種常用內切酶1. I型限制性內切酶同時兼有切割DNA的功能和修飾酶的修飾功能。在酶的識別位點上，若DNA兩條鏈菌沒有發(fā)生甲基化，則行使內切酶的功能 對DNA進行切割，同時轉變成 ATP酶。若DNA雙鏈中有一條鏈已發(fā)生甲基 化，則此類酶顯示修飾酶的作用，對另一條 DNA進行甲基化修飾，然后在行切割 功能。 （實際上，有內切酶、修飾酶、ATP酶

4、及解旋酶四種功能）I型限制性內切酶在DNA鏈上的識別位點和切割位點不一致，也不固定。 沒有時間應用價值。DNA甲基化：DN A化學修飾的一種形式，能在不改變 DNA序列的前提下，改 變遺傳表現(xiàn)（外遺傳機制）。多發(fā)生于CpG二核昔序列上（在甲基轉移酶的催化下，DN A的CG兩個核甘酸中的胞喀呢被選擇性添加甲基 ，形成5-甲基胞喀 噬）。甲基化位點可隨DNA的復制而遺傳（D NA復制后，甲基化酶可將新和成的未甲基化的位點進行甲基化）。 DNA甲基化可引起基因組中相應區(qū)域染色質結構變化，使DNA 失去限制性內切酶的切割位點，以及DNA酶的 敏感位點,使染色質高度螺旋化，凝縮成團，失去轉錄活性?！?2

5、. III型限制性內切酶具有內切酶和甲基化修飾酶作用。具有專一的識別順序，其切割位點在識別順序旁邊的幾個核甘酸對的固定位 置上。（可識別短的不對稱序列，切割位點與識別序列約距2426bp） 3.II型限制性內切酶也具有限制-修飾系統(tǒng)，但由限制酶和修飾酶這兩種不同的酶共同來執(zhí)行 這一系統(tǒng)的功能。即I I型限制性內切酶有在識別位點的切割功能，而不具備甲基 化修飾活性，修飾作用由相應的修飾酶完成。兩種酶識別同一DN A特定序列，卻發(fā)揮不同作用。能識別雙鏈D NA的特異順序，并在該順序內的固定位置上進行切割，產 生特異的DNA片段。II型限制性內切酶的識別位點和切割位點是專一和固定的，對相同的基因片段

6、的切割，總是得到同樣核甘酸順序的小 DNA片段。這些切割后的不同大小的 DNA片段，可以與統(tǒng)一內切酶切割后的來源不同的其他DN A片段實行連接，而構建重組DNA。一一基因工程技術的核心II型限制性內切酶識別的專一核甘酸順序，最常見的是4 6個堿基對。II型限制性內切酶的識別順序是一個回文對稱順序（反轉重復順序），具有1800的旋轉對稱性。識別順序有一個中心對稱軸，從這個軸朝兩個方面讀序都是 相同的。這類酶切割DN A可有兩種形式。交錯切割方式：如:5'YAATTC 3，31- CTCGA G- y3"G AGCTC*-5*每種酶切割后個產生兩個DNA片段，每一個片段個含有一個

7、單鏈末端， 單鏈末 端是互補的，可以通過形成“氫鍵”而黏合。不同來源的兩條DNA片段經同一種酶切割后，產生互補的黏性末端，通過選 擇合適的DNA鏈接，可將兩條異源性 DNA片段組合在一起。 一一重組DNA 的最基本原理用選擇專一性不同而產生相同黏性末端的兩種酶切割兩條不同的- CTTAAG tEtoR. I |柱 爐鈣±i0t5T-G AATTC-35 CTTAA又如：i51- CTCGAG- 313、G4GCTC 5' DNA片的JI注 4個加醺蜩的3段,可使重組后的DNA片段不再被原來的酶所切割如：Sal I酶切割后產生的黏性末端3 cagct , X h oI酶切割后產

8、生的黏性TCGAG-313,YACCTCT» ,既不被S al I酶切割,末端 （:兩者經連接酶連接產生的序列 也不被Xho I酶切割。在質粒改造上很有用 在同一位置上切割DNW鏈，產生平頭末端。如：TG"C3 3n CCGG 5n,蜂IIW5- GG CC - X3n CC GG 5,（二）其他類型內切酶1 .同工酶（B o s c h i zomer）:來源不同的兩種II型內切酶，它們識別核甘酸 順序及切割位點都相同，差別只在于當識別核甘酸序列中有甲基化的核甘酸時 一種內切酶可以切割，而另一種不能。如：H pa II和Msp I識別順序者B是 5' -CCGG羽

9、',若其中有5 甲基胞喀咤，則只有 Msp酶可切割（GGmCC）。2 .Su bset酶： 識別順序及切割位點相互有關的酶，互稱 Subset酶。如:Sam I酶所識別的6個核甘酸順序中含有Hpa I I酶識別的4個核甘酸順序。 所以這兩個酶可以相互代替使用，它們所切割的DN A片段可以相互連接。3 .可變酶（特殊的）:識別核甘酸順序一般都大于 6個，但其中一個或幾個核甘酸 時可以變化的。4 .遠距離切割酶：識別核甘酸順序的位置與切割的位點不一致，一般切割位點與指 標核甘酸順序的位置之間有1 0個左右核甘酸的距離。 與I型內切酶相似，不 過I型內切酶識別位點與切割位點的距離更遠一些。（

10、三）甲基化酶（不屬于內切酶）使識別順序中的某個核甘酸發(fā)生甲基化，保護DNA不被限制性內切酶切:M5C（5-甲基胞喀噬）大多數以M5CpG的形式存在，即CpG島中的C最容易 是甲基化的底物，而甲基化又與受之調控的基因的表達程度有關。因此 ，研究C pG島的甲基化是研究基因調控的一個重要方向。當甲基化酶和限制性內切酶共同使用時，常常可以使有多個識別位點的內切酶只 對其中一個識別位點有切割效果，其他位點因被甲基化酶修飾而不能被切割。5, C P%CGPu_G3 .如：限制性內切酶A v al的識別順序是'心Py可以是任何一種喀呢，pu可以是任何一種喋吟。因此可以有 4種識別順序。 如果同時使

11、用甲基化酶 Ta q I和甲基化酶HpaH,則A v a I的識別順序將只是5'CC CGAG3'o-AGCTCtLtC AGATTTTtl CUbt A<r*l'2 - TL&AuLTLCCOC?心口.亡了C-4RAtLZL- -43 As I，屬H那步6C5GY WK方FTOG1L0丁中子E司缸由癡¥ r- -Cc-cg i(i*GC TC«K；CGG*C tC&AGATTTTC CCGGCAG-T I-TCCXGCT CCGCCTCWCT CTA.fAGMQC CTC'VCH,附.'"*CCTFG

12、KCCCGC*Ct Cli AG ATI TTCCCGCG AGh -1'1.h-TG*3TCmCr TG"TC T 4"R AGGGCCC TX>，TECH>如上圖，一個基因片段被 Ava I酶切割時，片段中有三個 Ava I酶識別順序，該片段被 切割成4個片段。 但若先用Ta q I甲基化酶和H paII甲基化酶作用該片段時，片段中某些核甘酸發(fā)生甲基化修飾而不能被切割，再用Ava I酶切割時，只能被切割成兩個片段?！疽患谆笇?DN A的某位點進行甲基化修飾 ，進而抵御內切酶的切割一一構建重組質?！浚ㄋ模┡c 內切酶相關的幾個概念1 .酶活性單位及標

13、準反應體系酶活性單位：在一定溫度、PH及離子強度下，1h內完全酶解（切割）特定 底物DNA,所需限制內切酶的量。（底物DNA:多用人噬菌體DNA。又是可以用某一種酶在入噬菌體D NA上的切割位點，來推算用這種酶切割這種 DNA寸 所需的活性單位。）標準反應體系：在5 0 （J反應體系及指定溫度下，使用特定的緩沖體系，用1個活性單位的限制內切酶，酶解1解底物DNA反應1個小時。（若底物比1四多或少，可參照標準體系比例增加或減少酶用量。但增加酶用量時 ，需注 進不可加量過多一一內切酶中通常含有甘油防凍劑，加入酶量過多 ，其中的甘油 會降低內切酶識別順序的特異性。 也可通過延長反應時間來保證完全的酶

14、切。） 2.星號活力限制性內切酶在非標準反應條件下，切割一些與特異性識別順序相類似的順 序活性（該酶的第二活性）。（產生許多不想得到的片段；內切酶的識別切割能力下降，識別特異性下降。）引起星號活力的因素：過高的甘油含量（ 5%）;低鹽離子強度（25 mmol/L）;高PH伯：（8.0）;含有有機溶劑；含有非 Mg二價離子；酶量 過大（酶解1閨底物D NA用的內切酶大于1 00個活性單位）。3 .限制性內切酶底物位點優(yōu)勢效應限制性內切酶對同一 DNRt段切割時，在對其可以識別的位點上表現(xiàn)出不同 的切割速率的現(xiàn)象。4 .限制性內切酶質量有良好的酶活性；不存在任何其他核酸內切酶和外切酶的污染；長時間

15、的酶切反應不發(fā)生識別順序特異性的降低；被某一酶切割后的DNA經重新連接后，仍能被同一酶再次識別并再次切割。 內切酶質量的鑒定：5 0 d反應體系中以等量內切酶分別以 1h和12h（過夜）時間來切割底物D NA,用凝膠電泳檢查酶切結果。若不出現(xiàn)條帶數目的差別，則內切酶質量好。在T4DNA連接酶作用下，重新連接被內切酶切割后的 DNA片段，再用同一 酶切割，若所產生的DNA片段的大小和數目和第一次切割的結果完全一樣，則說明酶的質量好。一一可鑒定是否混有其他內切酶和磷酸脂酶（D NA被內切酶切割后，只有各個片段的3OH和5 'P基團完好才能再次連接，連接的D NA仍能提供同一酶的相同切割位點

16、，才會出現(xiàn)上面所說的兩個完全相同的結 果。）二、DNA重組常用的其他酶類（一）D NA 聚合酶（DN A pol y m era s e）將一個脫氧三磷酸核甘酸加到引物（primer）的3-OH上，再釋放出一個焦 磷酸分子（pp i ）。1 . 大腸桿菌 DNA 聚合酶（E c ol i DNApolym c rase ） 聚合酶 I、II > I I i聚合酶I、II主要參與DNA修復，I II主要參與DNA復制。三種都有沿模 板按5'令方向合成互補D N A鏈的活性和按3 ' 5'向的外切酶活性。聚合酶I 還有5'令'向的外切酶活性。5'

17、; 一 3'聚合酶活性：填補 DNA鏈上的缺口，或參與修復DNA合成過程中切 除RN用|物后留下的空缺部分。3' -5'外切酶活性：消除在聚合作用中摻入的錯誤核甘酸。dANIP dTRIP 心工 Mg'451- CGCAICI5T -CGC5' 一3'外切酶活性：切除受損的DNAB分Mg*5T- CGCATCTAG5， CATCTAG T . dOdP里GCGTAGATt寸- GCGTAGATC -5T 搬照聚合豳IK 1 6 now酶：大腸桿菌DNA聚合酶I（10900O Da）經舒替蘭酶（枯草桿菌 蛋白酶）水解獲得的76O00Da片段。具有5

18、' 3 '聚合酶活性和3'5'外切酶活 性。可用于填補 DNA單鏈末端成為雙鏈?？捎糜诤铣蒫 DNA第二鏈。（若將單核甘酸標記放射性核素，則可是合成的DNA雙鏈上帶上放射性核素標記?？捎么嗣竿ㄟ^切口平移來進行探針的放射性核素標記 >【切口平移：切口產生3 '羥基和5'磷酸基團，DNA延伸合成3 '端，5'端被 小片段降解缺口位點沿著雙鏈向3 '端移動，是在體外向DNA分子引入放射性 標記核甘酸的技術?！慨旊p鏈DNA分 子的一條鏈上 產生切口時， E.coli 聚合酶 I就可以將核昔 酸連接到切口 的3' -O

19、H末2 .噬菌體DNA合酶T4 DNA聚合酶，也具有5' -3'聚合酶活性和外挪I活性。外切酶活性比大腸桿菌DN4聚合酶外切酶活性強2 00倍?？捎糜谔结樀姆派湫院怂貥擞?。3 .噬熱水生菌DN A聚合酶從噬熱水生菌Th emus a q u a ti c us YT-1菌株中分離得到。耐熱其中T a q D NA聚合酶使用最多。7075 C生物活性最高。在7 580c條件下，每個酶蛋白分子每秒可以延長 15 0個核甘酸一一被廣泛應用于體外擴 增特異性DNAt段的技術（聚合酶鏈式反應，PCR（二）RNA®合酶能利用DNA乍為模板，催化四種核糖核甘三磷酸（NTP底物合成R

20、NAI I:核仁中，轉錄r RNA順序II：細胞質中，轉錄大多數基因（蛋白質基因和部分核內小 RRANA 因），轉錄是需要“TATA框（酶開始結合的位置，啟動子， 聚合II型轉錄單位特有的）。III：細胞核質中，轉錄tRNA 5SrRNAS因等少數幾個基因。（核質：由單一密閉環(huán)狀D NA分子反復回旋卷曲盤繞組成的 松散網狀結構。無核膜、核仁）（三）DN A連接酶一一基因工程比用的工具酶T4 DN A連接酶（T 4 DNA ligas e ）M g 2+依賴性酶催化雙鏈DNA±具有相鄰的3'羥基和5'磷酸末端單鏈缺口的修復，以 及具有黏性末端或平端的DN4片段的端端連接

21、的酶。DNA!接既可發(fā)生在D NA分子之間，也可發(fā)生在分子內部。高濃度的DNA末端有利于分子間連接，低濃度則有利于環(huán)狀DN A分子的形成。DN4連接酶只能連接雙鏈 DNAW不能連接單鏈D NA（四）反轉錄酶（逆轉錄酶，reve r se tr a n scr i pt a s e）以RNAJ模板指導三磷酸脫氧核甘酸合成互補 DNA（cDNA的酶 需要Mg+、Mn2 +作為輔助因子。1反轉果誨S5 CDNA 1反轉錄誨、也聚合Bl以RNA為模板時，在反轉錄酶作 用下，先合成單鏈 DNA（ss DNA。再在反轉錄酶和DN咪合酶I作 用下，以單鏈DN,模板合成“發(fā) 夾”型的雙鏈DNA（ds DNA）

22、ods eDMA y*VAAA. AVWvMW jF1核酸-sidsDNAVUA.最后在核酸酶S1作用下，切割成 兩條單鏈DNA反轉錄酶可用來把任何基因的 mRNA反轉錄成cDNA拷貝，然后可大量擴 增插入載體后的DNA。 可用來標記cDNA作為放射性的分子探針。（五）核糖核甘酸A （R Nase A,ri b nucleas e A）核酸內切酶。 特異的攻擊RNA上喀呢殘基的3'端，切割與相鄰核甘酸 形成的磷酸二酯鍵，產生3'-磷酸喀噬核甘酸和以3'磷酸愚'核甘酸結尾的寡核 甘酸（一類只有2 0個以下堿基的短鏈核甘酸的總稱。寡核甘酸可以很容易地與它們的互補對鏈

23、接，所以常用作探針確定 DNA或RNA的結構）。高濃度時，可對單鏈RNA的任何位點進行切割；低濃度時,只切割C和U的位 點。一一檢測寡核甘酸片段中是否含有 C和U。有顯著的細胞毒性。RNase A可用于檢測基因突變：利用R NA探針與突變基因形成 RNA-DNA雜 交體時，突變點處不能產生堿基互補（局部單鏈）這一特點，用RNase A進行切割， 切割產物可通過跑變性膠得到分離，可用放射自顯影等其他方法檢查片段數目及 大小,從而推知發(fā)生突變的位點。RNA探針可通過將相應的DNA片段克隆至含有S P6或T7啟動子的載體中得到。在操作RNA的實驗時一定要戴口罩和手套（RNase A存在非常廣泛，人

24、唾液、汗液中均含有），以避免有RNase的污染，所用的容器及蒸儲水也都必須 經去RNase處理?！居肈 E PC處理：0.1?100比例加DEP C ,3 7c 12h,高溫5min 除去DE PC殘留。含Tr i s的溶液不能用0 . 1%DEPC理（DEPC會和Tri s的氨 基反應而降解，失去滅活 RNase的能力），通?？筛挠肈 EP C處理過的水來配 DEPC已配好的可用1%DEPCb理（不過會有DEPC1留）?！浚┖颂呛怂崦窽1 （RNase T1）核酸內切酶。特異地攻擊鳥甘酸 3'側的磷酸基團，切割與其相鄰核甘酸的5' 磷酯鍵，產生3'-磷酸鳥音和以3

25、'磷酸鳥喋吟核甘酸結尾的寡核甘酸。主要用于RNA測序和指紋圖譜分析/也可和RNase合用，以除去樣品中RN A;除去DN A-RNA雜交體中雜交體的 RNA區(qū)。（七）核糖核酸酶 H（RNa s e H）核酸內切酶。 水解RNA DN A雜交體中的 RNA鏈,產生5'-磷酸寡核 甘酸和5'磷酸核糖核甘。J使RNA被切割后成為DNA聚合酶合成第二條cD NA的引物，形成cDN A。（八）脫氧核糖核酸酶 I （ DNase I,de oxyribo n u c 1 ea se I）核酸內切酶。M g 2+條件下,隨機切割單、雙鏈DNA,產生5'磷酸末端的單脫氧核甘酸和

26、 寡脫氧核甘酸。Mn2+存在下能將雙鏈DNA同時切斷，是DNA片段化。其活性依賴于Ca2+ （輔因子），活化劑：Mg2+,抑制劑:螯合劑（EDTA等）DNas e污染：用具要高溫處理，樣品中加 EDTA,抑制酶活性；或冰水中滅 活。、用途：除去RNA樣品中污染的基因組 DNA;轉錄反應后DNA模板的降 解。（九）核酸酶 S1（nuclease S1）內切酶（高度單鏈特異）。酶解單鏈D NA、單鏈RNA,產生5'-磷酸的單核 甘酸或寡核甘酸。對雙鏈 DNA、雙鏈RN A和DN A-RNA雜交體相對不敏感。需要低水平的Z n 2 +激活，PH4. 04. 3抑制劑:螯合劑（EDT A、檸檬

27、酸等卜 磷酸緩沖液、和0.6%左右的SDS溶液。S1核酸酶的水解功能可以作用于雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)，并從單戀部分切 斷核酸分子，且這種單鏈區(qū)可以小刀只有一個堿基對的程度。一一去除 DNA片 段中突出的單鏈末端；切開合成 d s DNA時形成的“發(fā)火”結構。（十）核酸酶Bal 31水解超螺旋DN A成開環(huán)狀，進而成為線狀DNA。有外切酶活性，在Mg2+、C a2+參與下，能從DN A雙鏈兩端連續(xù)向中間切割水可用于DNA鏈的限制性內切酶切割位點分析（繪制DNA限制圖譜）；縮短 D NA片段。（H一）核酸外切酶（exonu c lease）是具有從DNA分子鏈的末端順次水解磷酸二酯鍵而生成單核甘酸作用的兩種：水解磷酸二酯鍵的5'端生成3'-單核甘酸的酶；水解磷酸二酯 鍵的3'端生成5'-單核甘酸的酶（大腸桿菌核酸外切酶 I、II和I I I）。核酸外切酶II I :從雙鏈DNA3 ' O H逐一降解切除5'單核甘酸。不降解單鏈DW或3'突出的雙鏈DNA具有多種酶活性：對無喋吟DNA特異的 核酸內切酶活性、3'磷酸酶活性、3'外切酶活性、RNase H活性。