常用的單克隆抗體檢測方法

1、常用得單克隆抗體檢測方法通過雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，在雜交瘤制備完成 后，需要對抗體進(jìn)行一個(gè)檢測 ,本文介紹了幾種常用得抗體檢 測得方法（ 1）免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)就是將抗原抗體反應(yīng)得 特異性與酶對底物顯色反應(yīng)得高效催化作用有機(jī)結(jié)合而成 得免疫學(xué)技術(shù)。由于它特異性強(qiáng) ,靈敏度高 ,現(xiàn)已廣泛用于篩 選與鑒定單抗。器材與試劑a、包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液：取 0、2mol/L N a 2CO3 8m l,0、2mol/ L NaHC03 17ml 混合，再加75ml蒸餾水，調(diào)P H至9、6。Tr is H C l緩沖液 （PH8> 0,0、02mo 1 /L）:取 0、1 mol/L Tr

2、i s 1 0 0ml,0、 1m ol/ L H C l 5 8、4ml 混合，加蒸餾水至 1 0 00ml °b、洗 滌緩沖液（PH7、2 得 P B S ）: K H2 P O 4 0、2g, KCl 0、2 g, Na2H P 04 l 2H2O 2、9 g,N a C 18、0 g,T ween20 0、5m l，加蒸餾水至10 0 0ml。c、稀釋液與封閉液： 牛血清白蛋白（BSA）0、1g ,加洗滌液至100ml;或用洗滌液 將小牛血清配成 510%使用。d、酶反應(yīng)終止液（2mol/ L H2SO 4 ）:取蒸餾水1 7 8、3ml,滴加濃硫酸（98%） 21、7ml。

3、 e、底物緩沖液（PH5、0,磷酸鹽檸檬酸緩沖液）：取0、 2mol/L Na2 HPO425、 7ml,0、 1ml/L 檸檬酸2 4、 3m1,再加 50ml 蒸餾水檸檬酸溶液及配成得底物緩沖液不穩(wěn)定 , 易形成沉淀，因此一次不宜配制過多。f、底物使用液：OPD 底物使用液（測49 0 nm得OD值）：0 PD 5 m g,底物緩沖液10m 1 ,3% H 202 0、15 ml。T MBS 或 TMB 底物使用液（測 450nm 得 0D值）:TMBS 或 TMB （1mg/m l） 1、0ml,底物 緩沖液1 Om 1,1% H2 O 2 25 u l。AB T S底物使用液 （測4

4、1 0 nm 得 OD值）：A BT S 0、5mg,底物緩沖液1 ml, 3% H2 O 2 2ul o g、抗體對照：以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對 照,以免疫鼠血清作為陽性血清.h、抗原：可溶性抗原：盡量純 化,以獲得高特異性。病毒感染得傳代細(xì)胞或全菌抗原。淋巴細(xì)胞等懸液。i、酶標(biāo)抗鼠抗體或酶標(biāo) SPA或其她類似試劑。j、細(xì)胞固定液:-2 0C丙酮；或丙酮一甲醛固定液：N a2HPO4 10 0 mg,KH2P O 4 500mg,蒸餾水 15 0 m 1,丙酮 225 m l, 甲醛125ml ;或丙酮一甲醛溶液（1 ; 1）;或-20 C甲醇。k、聚 苯乙烯微孔板：4 0 孔、 96

5、 孔、或條孔；硬板或軟板均可使 用.1、酶聯(lián)免疫閱讀儀；或光鏡.m、吸管、加樣器及水浴箱、 離心機(jī)等?？扇苄钥乖妹嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELI SA） a、純化抗原用包被液稀釋至 1-2 0ug/ml ob、以50-100ul/孔量 加入酶標(biāo)板孔中，置4C過夜或3 7C吸附2小時(shí)。c、棄去孔內(nèi)得液體，同時(shí)用洗滌液洗3次，每次3 - 5分鐘，拍干。d、每孔加200ul封閉液4C過夜或37C封閉2小時(shí)；該步驟對 于一些抗原，可省略。e、洗滌液洗3次;此時(shí)包被板可-2 0C 或4C保存?zhèn)溆?。f、每孔加5 0-100UI待檢雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上 清,同時(shí)設(shè)立陽性、陰性對照與空白對照;3 7C孵育1 2小時(shí);洗

6、滌，拍干。g、加酶標(biāo)第二抗體，每孔50-1 0 0ul,3 7C孵育1 2小時(shí)，洗滌，拍干。h、加底物液，每孔加新鮮配制 得底物使用液50 100 u 1, 37C 10- 3 0分鐘。i、以2m ol/L H 2SO4終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取 O D值.j、 結(jié)果判定 :以 P/N2、 1,或 PN+3 D 為陽性。 若陰性對照孔無色 或接近無色 ,陽性對照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結(jié) 果。全菌抗原得 EL I SAS a、新鮮培養(yǎng)得細(xì)菌用蒸餾水 或PB S懸浮，并調(diào)整細(xì)菌濃度至 1X1 08個(gè)/m 1。必須指出， 對于人畜共患病病原體需注意安全操作,最好就是滅活處理。b、每孔中

7、加1 00 u I 5 %戊二醛溶液（0、1mol/L NaHCO39 5m 1+ 25%戊二醛溶液 5m 1 ）, 3 7C作用2小時(shí)，蒸餾水洗滌3次;加上述細(xì)菌懸液5 0ul /孔；37-5 6 C烘干；每孔 加2 0 0ul封閉液4C過夜或37C 2小時(shí)封閉.c、步驟b也 可米用先每孔加5 0 u 1細(xì)菌懸液，37C 5 6C烘干，然后 用一20C預(yù)冷得無水甲醇室溫作用15分鐘,蒸餾水洗滌3次;每孔加20 0 u1封閉液4C過夜或3 7C 2小時(shí)封閉。d、 洗滌液洗3次；此時(shí)包被板可在一2 0C或4 C保存?zhèn)溆?e、以 下步驟同上法。用全細(xì)胞抗原得ELIS A a、按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞 ,

8、接種病毒，收獲感染細(xì)胞與未感染細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用PB S制成適當(dāng)濃度懸液。b、淋巴細(xì)胞懸液得制備 采用新鮮外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴細(xì)胞分離液之 上， 15 00rpm 離心 30分鐘 ,吸取界面細(xì)胞洗滌二次， 即為新 鮮淋巴細(xì)胞懸液 .該細(xì)胞懸液中若仍混有紅細(xì)胞， 離心后加 0、8 3%得氯化銨溶液，室溫1 0分鐘,洗滌一次即可。將該細(xì)胞 懸液稀釋至適當(dāng)濃度。c、每孔加1 OOul上述a或b得細(xì)胞 懸液，使每孔含細(xì)胞5X 104個(gè);1500r/min 15分鐘，甩去上清； 室溫干燥或吹干后用丙酮一甲醇（1:1）4C固定1 0分鐘；可4C或一20C保存?zhèn)溆谩、以下步驟同上法?？贵w捕

9、捉EL I SA試驗(yàn)本法用抗B ALB /c小鼠Ig得多克隆抗體捕 捉待檢樣品中得M cAb，再依次加抗原、酶標(biāo)多克隆抗體及 底物顯色。該法就是常用得ELI S A中較理想得一種；其操作步驟如下：a以適當(dāng)濃度得純化抗鼠Ig抗體包被酶標(biāo)板, 每孔加100u 1, 37C 2小時(shí)或4C過夜。b、洗滌、拍干后 加待測得M cAb樣品，3 7C 1 2小時(shí)。c、洗滌后加適量得 抗原,37C 1-2小時(shí)。d、洗滌后加入酶標(biāo)多克隆抗體，37 C 1-2小時(shí)。洗滌后加底物顯色，判定結(jié)果。ABC-E L I SA試驗(yàn)A BC ELI S A就是在常規(guī)ELIS A原理得基礎(chǔ)上，增加 了生物素（Biotin）與親

10、與素（Av i din）間得放大作用。親與素 有4個(gè)亞單位組成，對生物素有高度得親合力。生物素很易 與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。因此，結(jié)合了酶得親與素與結(jié)合有抗體 得生物素發(fā)生反應(yīng)即起到了多極放大作用。其操作步驟如 下:a、已知抗原得包被及加待檢Me A b樣品，同間接ELISA試驗(yàn)。b、加生物素化抗鼠Ig抗體，每孔100ul, 37 C 1小 時(shí)；洗滌。c、加酶標(biāo)親與素，每孔 1 0 Ou l,3 7C 30分鐘 洗滌；加底物顯色，判定結(jié)果。Dot-EL IS A試驗(yàn)免疫斑點(diǎn) 試驗(yàn)(D ot-ELISA)就是以硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜為固 相載體 ,進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)得免疫檢測手段。 該法采用不溶性

11、底物(如D AB,或4氯萘酚或Ag NO 3等)，其與相應(yīng)標(biāo)記物(HRP、AP、膠體金)作用形成不溶性產(chǎn)物，呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀著色,從而易于判定結(jié)果。 根據(jù)所用得標(biāo)記物不同， 可分為 HRP 免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)、AP免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)與免疫金銀斑點(diǎn)法等。其 操作步驟大致如下:a、將抗原液2-5u 1點(diǎn)加于纖維素膜上，室 溫3 7C干燥.b、將纖維膜浸入封閉液中，37C 30分鐘。c、 用洗滌液洗2次,吸干后加待檢 McAb樣品,3 7C 1小時(shí);用 洗滌液振蕩洗滌三次 ,每次 5 分鐘，加 HRP 或 AP 或膠體金 標(biāo)記得抗鼠Ig抗體，3 7C作用3 0分鐘。d、同法洗滌，吸 干，用新配得相應(yīng)底物溶液顯色 ,然

12、后水洗終止反應(yīng) ,觀察結(jié) 果免疫組化染色法該法主要用于檢測針對細(xì)胞抗原成分 得Me Ab,常用得方法就是間接免疫過氧化物酶試驗(yàn)(IIP,indir e c t i mmunoper o xidase)及 APAAP 技術(shù)。其結(jié)果 用光鏡或倒置顯微鏡檢查.(2)免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù) 可用于多種抗原得雜交瘤抗體檢測 ,如細(xì)胞性抗原 (包括細(xì)菌 與動(dòng)物細(xì)胞) 、感染細(xì)胞中得病毒抗原與膜抗原等。其操作 簡單、敏感性高，可直接觀察抗原定位等優(yōu)點(diǎn)，在M cAb得篩選 與鑒定上具有重要得應(yīng)用價(jià)值。器材與試劑a、供檢測抗體用得抗原制備固定細(xì)胞片或板，活細(xì)胞懸液°b、PBS( PH7、2,0、01

13、 mo l/L)c、待檢得 McAb 樣品。d、冷丙酮e、FITC（異硫氰酸熒光素）或TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹 明熒光素）標(biāo)記得抗鼠I g抗體等f、熒光顯微鏡，磁力攪拌 器，離心機(jī)，水浴箱等。間接免疫熒光法a、固定細(xì)胞片得制備 :生長在蓋片上得細(xì)胞 （接種或未接種病毒） ,可直接收 獲蓋片，在PBS中洗滌，用4C丙酮固定10分鐘，空氣干燥，置密封容器于-20 C保存?zhèn)溆?；單?xì)胞懸液可在蓋片上制成涂 片，固定方法同上。細(xì)胞涂片得制備：將10ul細(xì)菌懸液（1X 1 0 8個(gè)/ ml）涂抹7X2 1mm蓋片上，自然干燥后，用一2 0C 丙酮固定1 015分鐘，于-2 0C保存?zhèn)溆?。b、蓋片在去

14、離 子水中濕潤后置架上滴加 1 0 20ul雜交瘤上清或其她待檢 樣品；設(shè)立陽性、陰性對照；置3 7C水浴孵育0、5- 1小時(shí)。c、取出蓋片置PB S中用磁力攪拌器洗滌 15分鐘。d、蓋片 置架上，滴加工作濃度得抗鼠Ig得熒光抗體10 - 20ul,37 C孵育0、5 1小時(shí)。e、同法洗滌15分鐘;取出蓋片，用延緩 熒光碎滅得封載劑（如緩沖甘油，9份甘油加1份PBS）封于干 凈載玻片上。f、光顯微鏡上觀察，陽性結(jié)果可見特異性熒光 （FI T C為黃綠色熒光，TR ITC為桔紅色熒光）。g、細(xì)胞固 定片得制備 ,也可改在培養(yǎng)板孔中進(jìn)行，其余步驟同上,在觀察結(jié)果時(shí) ,將培養(yǎng)板翻轉(zhuǎn)置于熒光顯微鏡下,

15、判斷標(biāo)準(zhǔn)不變。細(xì)胞得膜熒光染色完整得活細(xì)胞得細(xì)胞膜 ,抗體不能透過。 如果細(xì)胞在4C操作，則熒光染色僅限于細(xì)胞膜。必須注意 死細(xì)胞常以非特異性方式吸附大量熒光抗體，因此試驗(yàn)過程中要保證細(xì)胞得高活力?；罴?xì)胞得膜熒光染色大致步驟如下:a、制備活性較好得細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)濃度至1 0 7個(gè)/ml. b、 在小試管（5X 50mm）中加入1 0 0ul細(xì)胞懸液，再加入100ul 待檢M c Ab得樣品,混勻,4 C作用30- 9 0分鐘。c、用洗滌 液（P BS 900ml，小牛血清 5 0m l, 4%NaN3 5 0m 1 ）洗二 次,每次加洗滌液1-5m 1 , 1 000 r / min離心5分鐘

16、，棄上 清。加入1 0 0 u l熒光抗體，4C作用3 0 9 0分鐘.d、同法 洗滌，將細(xì)胞重新懸于 20- 30 ul 含1 0%甘油與 1 0 -10 0ug苯二胺/ml得溶液中；滴加于載玻片上，加蓋片封載。 立即在熒光顯微鏡上檢查。f、細(xì)胞也可在染色后用 1%多聚 甲醛生理鹽水固定，立即檢查，或至少在4C可保存一周。（3） 間接血凝試驗(yàn)間接血凝試驗(yàn)又稱被動(dòng)血凝試驗(yàn)（PH A）,就是目前應(yīng)用較廣得檢測方法之一 .本試驗(yàn)就是以包被可溶性抗 原得紅細(xì)胞作為指示系統(tǒng)，當(dāng)被檢抗體與包被在紅細(xì)胞上得 抗原產(chǎn)生特異性反應(yīng)時(shí)，導(dǎo)致紅細(xì)胞呈凝集現(xiàn)象.可見 ,該法具有靈敏、快速、容易操作與無需昂貴儀器等優(yōu)

17、點(diǎn)，而且經(jīng) 改用醛化紅細(xì)胞以后，克服原來重復(fù)性差得缺點(diǎn)。器材與 試劑a、綿羊抗凝血，或人“ O”型抗凝血。b、緩沖液:PBS（P H7、2）;醋酸緩沖液。c、甲醛，丙酮醛,NaN 3，抗凝劑等。d、血凝板，振蕩器等。多糖抗原得間接血凝試驗(yàn) a、甲醛化 綿羊紅細(xì)胞得制備：無菌采集綿羊頸靜脈血5 0ml，用枸櫞酸鈉作抗凝劑；用5倍于紅細(xì)胞壓積得 PH 7、2 PBS（N a2HP04 12 H 2 O 3、5 8g,KH2P O 4 0、4 1 g, N a Cl 8、01g, 蒸餾水1 000ml ）充分洗滌 5次，每次1 5 0 0r/ min 5 1 0 分鐘 ,直至上清測定無蛋白質(zhì) （用飽

18、與硫酸銨滴定上清， 觀察 有無白色沉淀 ）,再以相同緩沖液配成2 5%紅細(xì)胞懸液 ;將 25%紅細(xì)胞懸液與2 0%甲醛以2、5: 1得比例混勻，3 7C 水浴作用 2 小時(shí)，每 15 分鐘振蕩一次，紅細(xì)胞顏色逐漸由 鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣?；以PH 7、2 PBS洗滌4次,每次2 000 r/ m i n 10分鐘，再以同樣得PBS制成2 5 %紅細(xì)胞懸液；其后, 重復(fù)醛化一次 ,方法同前 ；最后配成 20%醛化綿羊紅細(xì)胞懸 液，加甲醛至0、3 %防腐，4C保存?zhèn)溆?。b、脂多糖抗原 致敏甲醛化綿羊紅細(xì)胞得制備：取脂多糖（L P S）,以0、2m o1 /L PH8、0 P B液，調(diào)整多糖濃度至120u

19、 g/m I,然后100C水浴處理1小時(shí);將冷卻至3 7C得熱處理L PS與6% 醛化紅細(xì)胞等量混合,37 C攪拌作用45分鐘；取出離心2 000r / m in 1 0分鐘，以 0、01m o 1/L PH7、2 PBS 洗滌4次； 配制成4%致敏血球,分裝,保存于4 C備用,或凍干保存。c、 McA b得篩選：取待測M cAb樣品25 u I,加入V型微量血凝板 孔中,同時(shí)設(shè)立陰性、陽性對照 ;再加入 0、 5-4 %致敏紅血球 懸液2 5 ul,在振蕩器上混勻 3 0秒；置室溫或 37C 3 0-60 分鐘觀察結(jié)果。 陰性對照孔應(yīng)呈緊縮得圓點(diǎn) .可溶性蛋白抗 原得間接血凝試驗(yàn) a紅細(xì)胞醛化：采用雙醛法。采綿羊或人“O”型抗凝血，每次加 10倍于紅細(xì)胞壓積得P BS洗滌46次，然后配成8%紅細(xì)胞懸液；向此 8 %紅細(xì)胞懸液緩慢 加入等量含有3%丙酮醛與3%甲醛得PBS,于室溫緩慢攪拌 17小時(shí)；其后洗滌3次，配成20%雙醛化紅細(xì)胞懸液，加0、 1% NaN3防腐，4C保存?zhèn)溆谩、致敏紅細(xì)胞：取20%雙醛化紅細(xì)胞0、1