抗氧化試驗方法

1、1還原力的測定樣品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.6）和2ml 1%的鐵氤化鉀溶液的混合液 中?；旌衔镌?0C保溫20min,然后在反應混合物中加入2ml 10%的TCA，混合后以3000rpm離心10min,取上清液2ml與2ml蒸儲水以及0.4ml 0.1%氯化鐵在反應試管中反應，10min后測定其在700nm處的吸光值。吸光值越大表明還原力越強。注意：建議蛋白濃度以5mg/ml左右變化，例如2.5, 5之類變化。但具體情況應根據(jù)吸 光值大小而定。0.2mol/L pH6.6的磷酸鹽緩沖液的配制見附表。鐵?；浫芤簯⒀b在棕色瓶中。比色皿的用法：可見光（400nm）

2、用玻璃比色皿（即沒有標字母或者標G的比色皿），紫外光時（400nm）用石英比色皿（即標Q字比色皿）。2 DPPH白由基清除活性的測定將1.5ml樣品液添加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇中，混合，振蕩，在 室溫下放置30min，然后在波長517nm處檢測（Ai）。清除率計算公式為：磯） = 1-（ M - A圳AxlOO%空白為1.5 ml 95%的乙醇加入1.5 ml蒸儲水調(diào)零。式中：Ac對照為1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸儲水在517nm處的吸光值；Aj-1.5ml樣品液加上1.5 ml 95%的乙醇在517nm處的吸光值；Ai 1.5ml樣品液加上1

3、.5 ml DPPH溶液在517nm處的吸光值； 注意：建議酶解液蛋白濃度以2mg/ml左右變化，如0.5,1,2,2.5之類變化，但是具體情況應視清除率而定，最終結(jié)果應有清除率大于50%和小于50%的情況。DPPH樣品有毒，需戴口罩和手套進行操作。而且DPPH試劑很昂貴，用時注意節(jié)約。0.1m mol/L DPPH乙醇溶液的配制：準確稱取0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定 容到100ml。3在卵黃磷脂體系中抗氧化能力的測定以卵黃脂蛋白為底物的LPO模型反應體系包括：體積比為1:25稀釋的卵黃懸液（卵黃用等體積的pH7.45 , 0.lmol/LPBS配成，使用前磁力攪拌10

4、min）0.2 mL、一定濃度的樣品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL,用PBS緩沖液補足至2.0mL。對照管除不加樣液外 其他試劑同前。將上述2種試管同時置37C恒溫水浴鍋中保溫培養(yǎng)1h。取出后，加入20%TCA0.5mL，靜置10 min后，與對照管于3500r/min離心10min,取2.0mL上清液，分 別加入質(zhì)量分數(shù)為0.8%硫代巴比妥酸（TBA）溶液1.0mL,加塞于100C水浴15min,取出冷 卻。 空白管以2.0mLPBS溶液代替，在532nm下測定吸光度，樣品對卵黃脂蛋白LPO的抑制率表示為：SA（%）=（Ac一AS）/A CX 100式中:Ac一

5、不加樣品的吸光度As加入樣品的吸光度注意：卵黃溶液不用時應放置冰箱保存。酶解液蛋白濃度以5mg/ml左右調(diào)整，但具體應視清除率大小而定，對酶解液蛋白濃度進行調(diào)整。硫代巴比妥酸溶液需放置于棕色瓶內(nèi)保存。并以50m mol/L NaOH溶液配制。再在50 C水浴溶解。FeSO4溶液應以棕色瓶盛裝。4過氧化值的測定參照本食品學院林華娟等老師主編的食品分析實驗講義一書。5超氧陰離子白由基清除率的測定鄰苯三酚自氧化速率（V對照）：對照組和空白對照組加入4ml蒸儲水（去離子水）和，0.1 mol/LTris-HCl緩沖溶液（pH8.2）4.5ml， 在25C水浴20min后， 樣品組加入0.2ml（或0.

6、3ml）3m Mol/L鄰苯三酚溶液，空白組以相同體積蒸儲水（去離子水）代替。震勻后馬上在320nm處測定吸光值。迅速混勻并開始計時，每隔30 s讀取吸光值，4 min后結(jié)束，以空白對照管調(diào)零。作吸光度隨時間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率V對照。（V對照在0.05A/min0.065A/min之間，否則應調(diào)整鄰苯三酚加入量）樣品自氧化速率（V樣品）：樣品組和空白組均加入一定濃度的樣品溶液4ml , 0.1mol/LTris-HCl緩沖溶液（pH8.2） 4.5ml ,在25 C水浴20min后，樣品組加入0.2ml（或0.3ml）3m Mol/L鄰苯三酚溶液，空白組以相同體積蒸儲水

7、（去離子水）代替。震勻后馬上在320nm處測定吸光值。迅速混勻并開始計時，每隔30 s讀取吸光值,4 min后結(jié)束，以空白管調(diào)零。作吸光度隨時間變化的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚自氧化速率V樣品，按下式計算樣品對超氧陰離子的抑制率：式中：抑制率（%）=（V對照-V樣品）/V對照X 100V對照一對照組鄰苯三酚自氧化速率（ A/min）V樣品一樣品組鄰苯三酚自氧化速率（ A/min）動物實驗資料：摘自鷹嘴豆：抗氧化劑的抗氧化效果受到多種因素的影響， 只有在生物體內(nèi)具有抗氧化作 用的物質(zhì)才能有效的活除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基， 才能表現(xiàn)出一定的生物活性。由于 體外抗氧化測定方法容易操作，周期短，因此評價一種

8、物質(zhì)的抗氧化效果往往首 先采用體外抗氧化體系。但體外抗氧化體系往往與人體內(nèi)的生理環(huán)境相差太大， 許多研究結(jié)果表明采用體外方法評價有效的抗氧化劑進入人體后卻表現(xiàn)不出應 有的抗氧化效果，因此抗氧化劑的抗氧化效果在采用體外方法進行初步評價后應 采用動物實驗進行體內(nèi)評價。人體在正常生理代謝過程中會產(chǎn)生少量的含氧自由基，如超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等，這些自由基通過自然存在于體內(nèi)的抗氧化酶如超氧化物歧化 酶（SOD）、過氧化氫酶及抗氧化劑如抗壞血酸、維生素E組成的抗氧化系統(tǒng)來消 除。因此，在正常狀態(tài)下，體內(nèi)自由基維持在一定水平并處于動態(tài)平衡中，正常 量的自由基對細胞的生長、分裂、解蠹等具有有益的作用

9、，在殺菌、免疫調(diào)節(jié)等 方面具有積極而重要的意義。然而，隨著增齡或在某些病理狀態(tài)下以及機體受到創(chuàng)傷時， 體內(nèi)抗氧化酶活 性下降，從而導致機體代謝異常而驟然產(chǎn)生大量活性氧自由基； 或由于機體抗氧 化物質(zhì)不足，使促氧化劑與抗氧化劑之間的平衡失常， 致使自由基與機的一些生 物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等發(fā)生反應，生成大量氧化物或過氧化物，并進一步引起細胞死亡和組織損傷。業(yè)已證明，氧化損傷與衰老、腫瘤、糖尿病、 動脈硬化、神經(jīng)退行性病變以及人類免疫缺陷病蠹(HIV)感染等均有密切關系D-半乳糖誘導的業(yè)急性衰老模型是按照衰老的代謝學說建立的，其機制與糖 代謝紊亂6、D-半乳糖醇中蠹7和活性氧自由基過剩有關；眾多研究表明是生 物體內(nèi)含有半乳糖氧化酶，在催化D-半乳糖時可產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2 -)和H2O2;如果長期人為地給予過量D-半乳糖，使機體和細胞內(nèi)自由基產(chǎn)生過量， 除了造成組織細胞直接損傷外，還導致抗氧化酶活力下降和過氧化產(chǎn)物積累，從 而表現(xiàn)出與人類自然衰老相似的生化變化、免疫功能低下、基因表達與調(diào)控異常 細胞繁殖力下降及細胞退化性衰變等。有研究表明，D-半乳糖可降低人胚肺二倍 體成纖維細胞(HBS),從而使該細胞SOD活力降低和過氧化產(chǎn)物MDA增多，從 而起到加速細胞老化的作用。本文在前述章節(jié)已經(jīng)表明，鷹嘴豆蛋白酶解物具有體外抗氧化活性，但其在生物 體內(nèi)的作用效