以生物大分子互作為基礎(chǔ)的基因克隆方法

1、藍(lán)色海洋書的海洋以生物大分子互作為基礎(chǔ)的基因克隆方法 1酵母雙雜交體系 酵母雙雜交體系主要用于討論蛋白質(zhì)之間的互相作用。該體系用于分析已知蛋白質(zhì)之間的互相作用，或者是用于篩選與已知蛋白質(zhì)互相作用的未知蛋白質(zhì)分子。酵母雙雜交系統(tǒng)的可行性和有用性經(jīng)過多年的用法已經(jīng)非常完美。酵母雙雜交的基本原理：真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活作用是由功能相對自立的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dna binding domain, bd)和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(transcription activation domain, ad)共同完成的。這兩個結(jié)構(gòu)域通過共價或者非共價銜接建立的空間聯(lián)系是導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間互相結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵。利用這個特點

2、，我們就可以舉行蛋白質(zhì)互相作用之間的分析。假定兩個不同的蛋白質(zhì)分子x和y，它們之間存在互相作用。那么，我們可以將x和y分離與酵母轉(zhuǎn)錄因子的兩個結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成融合蛋白質(zhì)，也就是bd-x/ad-y或者bd-y/ad -x。當(dāng)這兩個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(bd-x/ad-y)單獨存在時無轉(zhuǎn)錄激活功能。而當(dāng)兩個不同的蛋白質(zhì)分子x和y之間存在互相作用、bd/ad兩個結(jié)構(gòu)域逼近或者共價結(jié)合時轉(zhuǎn)錄功能復(fù)原。在通常的狀況下，已知的蛋白質(zhì)x與dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域互相融合形成bd-x融合蛋白，而待檢測的蛋白質(zhì)y與轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域互相融合形成ad-y, x-bd融合蛋白稱為誘餌蛋白(bait protein)，而y-ad融合蛋白稱

3、為被誘捕蛋白(prey protein)。含有x, y的蛋白質(zhì)同時在一個中表達(dá)，當(dāng)x與y之間能夠發(fā)生互相作用時，誘餌蛋白和被誘捕蛋白之間能夠在空間上互相逼近，報告基因得以激活。相反，假如x與y之間沒有互相作用，誘餌蛋白和被誘捕蛋白質(zhì)之間就不能夠在空間上互相逼近，報告基因不表達(dá)。按照這個原理可以便利地檢測蛋白質(zhì)之間的互相作用。酵母雙雜交系統(tǒng)充分利用了酵母能夠表達(dá)真核生物基因，不需要分別純化蛋白質(zhì)，囫圇過程只需要對舉行操作，同時酵母的生長速度快、簡單操作等優(yōu)點，使酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用非常廣泛。常用的酵母雙雜交體系包括以gal4為基礎(chǔ)的體系和以lexa為基礎(chǔ)的雙雜交體系(圖8-10)。圖8-10酵母

4、雙雜交暗示圖a轉(zhuǎn)錄激活暗示圖；b.酵母雙雜交暗示圖。ad表示轉(zhuǎn)錄激活位點；bd表示dna結(jié)合位點；reporter gene為報告基因酵母雙雜交系統(tǒng)用法的基本步驟如下所述。(1)鑒別已知蛋白質(zhì)之間是否存在互相作用。鑒定兩個已知蛋白質(zhì)之間是否存在互相作用是酵母雙雜交系統(tǒng)最為有效的辦法。只需要將兩個待討論的蛋白質(zhì)分離與ad和bd互相融合，同時轉(zhuǎn)化同一個，通過檢測報告基因是否表達(dá)來判定x與y之間是否存在互相作用。圖8-11為如何檢測兩個蛋白質(zhì)之間是否存在互相作用的流程圖。圖8-11鑒別已知蛋白質(zhì)之間有無互相作用的流程圖(2)尋覓與某個蛋白質(zhì)互相作用的未知蛋白質(zhì)。討論蛋白質(zhì)之間的互相作用可以鑒定出與已

5、知蛋白質(zhì)發(fā)生作用的新的蛋白質(zhì)分子。尋覓與目的蛋白質(zhì)互相作用的蛋白質(zhì)時，首先構(gòu)建含有目的蛋白質(zhì)基因的表達(dá)質(zhì)粒(bd-x)，鑒定bd表達(dá)質(zhì)粒的自轉(zhuǎn)錄活性。假如蛋白質(zhì)x沒有自轉(zhuǎn)錄活性，那么bd-x就可以用于酵母雙雜交的篩選。然后，將待分析的cdna克隆到ad表達(dá)質(zhì)粒中構(gòu)建酵母雙雜交的cdna文庫(ad-cdna)，將表達(dá)的質(zhì)粒和雜交的文庫共同轉(zhuǎn)化，獲得表達(dá)的陽性克隆。抽提ad表達(dá)質(zhì)粒并對陽性質(zhì)粒的插入片段舉行測序。測序完成以后，逐一分析所得到的候選蛋白與y蛋白之間作用的真切性。假如的確存在互相作用，那么就可以初步認(rèn)定兩個蛋白質(zhì)之間為互作蛋白。結(jié)合分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的手段，我們可以最后找到蛋白質(zhì)x的互

6、作蛋白。這個分析過程8-12所示。2噬菌體展示技術(shù)噬菌體展示技術(shù)是g. p. smith等于1985年提出來的一種利用蛋白質(zhì)互相作用的體外免疫系統(tǒng)，它能夠?qū)⒒蚱闻c蛋白質(zhì)分子有效地聯(lián)系在一起。噬菌體展示技術(shù)的基本原理是，當(dāng)外源dna片段分子插入到絲狀噬菌體基因組中的一個外被蛋白質(zhì)基因中時，假如兩者的讀碼框架保持全都時，外源片段的dna分子所編碼的產(chǎn)物可以與外包被蛋白質(zhì)一起形成一個融合蛋白質(zhì)，這個融合蛋白質(zhì)可以顯示在噬菌體的表面。利用抗此外源基因編碼產(chǎn)物的抗體，通過抗原一抗體的親和作用，就能夠從大量噬菌體中分別出含有所要基因的融合噬菌體。然后，通過基因擴(kuò)增就可以得到大量所要的目的基因片段。圖8

7、-12尋覓與某個已知蛋白質(zhì)互相作用的蛋白質(zhì)噬菌體展示技術(shù)的基本過程如下所述。(1)構(gòu)建噬菌體抗體庫。構(gòu)建一個大容量的噬菌體庫是噬菌體展示技術(shù)的關(guān)鍵所在。通常用于構(gòu)建噬菌體抗體庫的噬菌體包括兩種不同的類型。一種是以m13, fl, fd等為載體的抗體庫；另一種是以上述噬菌體的復(fù)制起始序列為基礎(chǔ)組建的噬菌體質(zhì)粒載體(phagemid)。絲狀噬菌體的外被蛋白基因班和基因珊是常用的與外源dna序列一起產(chǎn)生融合蛋白的基因。基因編碼由406個氨基酸組成的p3蛋白，每個噬菌體由35個不同p3蛋白組成，位于絲狀噬菌體的一端。基因編碼50個組成的p8蛋白，每個噬菌體上大約有2700個p8蛋白質(zhì)分子。這兩種不同蛋

8、白質(zhì)的共同點是蛋白質(zhì)的n端位于噬菌體的外部，而c端位于噬菌體的內(nèi)部。當(dāng)外源dna片段與這兩個基因互相融合時蛋白質(zhì)的片段裸露在噬菌體的表面。對實際用法而言，討論者更偏向用法噬菌體質(zhì)粒載體作為構(gòu)建抗體庫的載體，因為噬菌體質(zhì)粒載體既有質(zhì)粒的復(fù)制起點又有噬菌體的復(fù)制起點，非常簡單操作并且轉(zhuǎn)化效率比較高?？贵w庫的構(gòu)建：首先利用限制性內(nèi)切將噬菌體質(zhì)粒載體酶切，然后與待分析組織的cdna分子舉行銜接，銜接以后的dna分子挺直轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化以后的大腸桿菌在協(xié)助噬菌體(helper phage)的作用下，噬菌體質(zhì)粒被包裝，然后通過噬菌體的獲救辦法構(gòu)建成為噬菌體抗體庫。一個比較典型的噬菌體抗體庫的容量

9、通常在109個以上。隨著抗體庫容量的增強(qiáng)，篩選到特異性抗體片段的可能性就越大。(2)從噬菌體庫中篩選特異抗體。噬菌體抗體庫構(gòu)建完成以后，下一步的工作就是從抗體庫中篩選特異的抗體?？贵w篩選的基本原則是親和捕捉。首先將抗原包被在固相物質(zhì)的表面，如384孔的微孔板上，然后加入噬菌體抗體庫與抗原舉行溫育。溫育一段時光以后，將微孔板放入緩沖液中舉行淘洗。經(jīng)過淘洗以后，表面留下那些能夠與目標(biāo)抗原相結(jié)合的抗體噬菌體。親和捕捉辦法的篩選效率高，特異性比較強(qiáng)，能夠從109個以上克隆的抗體庫中篩選獲得一個特異性的目的基因。(3)陽性抗體克隆的dna序列分析。因為經(jīng)過一次親和捕捉的噬菌體有多個，因此親和捕捉以后的噬菌體舉行繁殖，再次感染。這些再次感染的大腸桿菌又可以形成一個小型的富集的噬菌體抗體庫。這個小型的噬菌體抗體庫再次重復(fù)以上的篩選過程直到獲得少量的克隆為止。(4) dna序列的分析和驗證。將這些有高度親和能力的噬菌體舉行回收。通過質(zhì)粒獲救的辦法就能夠?qū)⑼庠吹钠畏謩e出來。通過測序就能夠獲得基因的所有序列。(5)基因功能的鑒定。通過突變?nèi)笔мk法進(jìn)一步分析基因功能。除了上述的一些基因克隆辦法以外，隨著基因組技術(shù)的進(jìn)展，利用生物信息學(xué)手段來協(xié)助和尋覓新的基因是一種重要手段。因為越來越多基因組的全序列被測定，隨著功能基因組討論和后功能基因組討論時代的到來，基因克隆與分別在技術(shù)上已經(jīng)不存在大的障礙。普通