基因芯片技術(shù)及臨床應(yīng)用課件VIP

1、府偉靈府偉靈2隨著人類基因組測(cè)序計(jì)劃的逐步實(shí)施以及分隨著人類基因組測(cè)序計(jì)劃的逐步實(shí)施以及分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科的迅猛發(fā)展，越來越多的子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科的迅猛發(fā)展，越來越多的動(dòng)植物、微生物基因組序列得到測(cè)定。動(dòng)植物、微生物基因組序列得到測(cè)定。在在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已含有數(shù)據(jù)庫(kù)中已含有300萬個(gè)序列，總?cè)f個(gè)序列，總數(shù)超過數(shù)超過22億個(gè)堿基對(duì)，其中包括億個(gè)堿基對(duì)，其中包括19種不同生種不同生物體的完整序列、近物體的完整序列、近9 000個(gè)已知功能或已推個(gè)已知功能或已推測(cè)功能的人類基因序列。測(cè)功能的人類基因序列。基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)正在以前所未有的速度迅速基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)正在以前所未有的速度迅速增長(zhǎng)。增長(zhǎng)。3然

2、而如何充分利用新序列信息資源，怎樣然而如何充分利用新序列信息資源，怎樣去研究如此眾多基因的生物信息及其在生去研究如此眾多基因的生物信息及其在生命過程中所擔(dān)負(fù)的功能，成為生命科學(xué)工命過程中所擔(dān)負(fù)的功能，成為生命科學(xué)工作者的共同課題。作者的共同課題。4已建立的諸如已建立的諸如Northern印跡、印跡、RNA酶保酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)、護(hù)實(shí)驗(yàn)、S1核酸酶分析、噬斑雜交以及核酸酶分析、噬斑雜交以及狹線印跡等方法不能提供足夠通量來有狹線印跡等方法不能提供足夠通量來有效地利用新的基因組學(xué)的資源。為此，效地利用新的基因組學(xué)的資源。為此，必須發(fā)展高通量或平行監(jiān)測(cè)基因表達(dá)的必須發(fā)展高通量或平行監(jiān)測(cè)基因表達(dá)的新方法。新方法

3、?；蛐酒夹g(shù)正是在這樣的背景下應(yīng)運(yùn)基因芯片技術(shù)正是在這樣的背景下應(yīng)運(yùn)而生。而生。5早在早在80年代初期，有人就曾設(shè)想利用年代初期，有人就曾設(shè)想利用計(jì)算機(jī)半導(dǎo)體技術(shù)生產(chǎn)基因芯片以對(duì)計(jì)算機(jī)半導(dǎo)體技術(shù)生產(chǎn)基因芯片以對(duì)人類基因大量的遺傳信息進(jìn)行分析和人類基因大量的遺傳信息進(jìn)行分析和檢查。檢查。6但直到但直到1994 年年P(guān)ease等人創(chuàng)造的光導(dǎo)原位合成高等人創(chuàng)造的光導(dǎo)原位合成高密、微化的寡核苷酸陣列密、微化的寡核苷酸陣列(ODTA)的制作技術(shù)問的制作技術(shù)問世之后，才使該設(shè)想逐步成為現(xiàn)實(shí)。世之后，才使該設(shè)想逐步成為現(xiàn)實(shí)。因此可以說光導(dǎo)因此可以說光導(dǎo)ODTA化學(xué)合成法，為基因芯化學(xué)合成法，為基因芯片技術(shù)

4、奠定了基礎(chǔ)。片技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。7現(xiàn)在全世界已有十多家公司從事基因芯片現(xiàn)在全世界已有十多家公司從事基因芯片研究和開發(fā)工作，而且已有較為成型的產(chǎn)研究和開發(fā)工作，而且已有較為成型的產(chǎn)品和設(shè)備問世。這些公司主要以美國(guó)的品和設(shè)備問世。這些公司主要以美國(guó)的Affymetrix公司為代表。公司為代表。圖片來自益來基因網(wǎng)圖片來自益來基因網(wǎng): 美國(guó)美國(guó)“Fortune”雜志在雜志在1997年年3月對(duì)基因芯片技月對(duì)基因芯片技術(shù)未來產(chǎn)業(yè)化的前景進(jìn)行了重點(diǎn)介紹。術(shù)未來產(chǎn)業(yè)化的前景進(jìn)行了重點(diǎn)介紹。8又稱又稱DNA芯片，是指將許多特定的寡核苷酸片段或基芯片，是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定

5、于支持物上，然后因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測(cè)的標(biāo)記樣品的基因按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再與待測(cè)的標(biāo)記樣品的基因按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配通過激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出比較和檢測(cè)，以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出比較和檢測(cè)，從而迅速得出所要的信息。從而迅速得出所要的信息。9基因芯片制備技術(shù)基因芯片制備技術(shù)靶基因的制備靶基因的制備雜交和檢測(cè)雜交和檢測(cè)基因芯片設(shè)計(jì)基因芯片設(shè)計(jì)雜交圖像分析雜交圖像分析PCR擴(kuò)增擴(kuò)增靶基因標(biāo)記靶基因標(biāo)記原位合成原位合成合成點(diǎn)樣合成點(diǎn)樣芯片

6、雜交芯片雜交雜交檢測(cè)雜交檢測(cè)數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析實(shí)際應(yīng)用實(shí)際應(yīng)用提出問題提出問題芯片設(shè)計(jì)芯片設(shè)計(jì)芯片制作芯片制作試樣處理試樣處理表達(dá)差異分析表達(dá)差異分析多態(tài)性分析多態(tài)性分析再測(cè)序再測(cè)序生物信息學(xué)生物信息學(xué)數(shù)學(xué)優(yōu)化數(shù)學(xué)優(yōu)化數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)化1011基因芯片視分類方法不同可分為不同類型基因芯片視分類方法不同可分為不同類型探針陣列形式探針陣列形式原位合成原位合成合成點(diǎn)樣合成點(diǎn)樣光引導(dǎo)聚合法光引導(dǎo)聚合法噴墨打印合成法（壓電打印法）噴墨打印合成法（壓電打印法）片基或支持物片基或支持物無機(jī)芯片無機(jī)芯片有機(jī)合成物芯片有機(jī)合成物芯片12基因芯片的主要類型及其簡(jiǎn)要特點(diǎn)基因芯片的主要類型及其簡(jiǎn)要特點(diǎn)13基因芯片

7、的實(shí)質(zhì)是高度集成的寡核苷酸基因芯片的實(shí)質(zhì)是高度集成的寡核苷酸陣列陣列制造基因芯片首先要解決的技術(shù)問題就制造基因芯片首先要解決的技術(shù)問題就是如何在芯片片基上定位合成高密度的是如何在芯片片基上定位合成高密度的核酸探針核酸探針14原位合成原位合成 直接在芯片上用四種核苷酸合成所需的探針直接在芯片上用四種核苷酸合成所需的探針合成點(diǎn)樣合成點(diǎn)樣 將已經(jīng)合成好的探針定位在芯片上將已經(jīng)合成好的探針定位在芯片上基因芯片制備的兩種基本方法基因芯片制備的兩種基本方法15由美國(guó)由美國(guó)Affymetrix公司開發(fā)公司開發(fā)Affymetrix Website: Picture from UKBF: 16 把玻璃基片上的活

8、性羥基修飾上光保把玻璃基片上的活性羥基修飾上光保護(hù)基團(tuán)，此光保護(hù)基團(tuán)可被一定波長(zhǎng)護(hù)基團(tuán)，此光保護(hù)基團(tuán)可被一定波長(zhǎng)的光激活并脫保護(hù)。的光激活并脫保護(hù)。 根據(jù)所要制作的陣列的需要設(shè)計(jì)光刻根據(jù)所要制作的陣列的需要設(shè)計(jì)光刻掩膜。將掩膜（掩膜。將掩膜（M1）覆蓋在修飾過的）覆蓋在修飾過的基片上，用光照射使曝光區(qū)域的基片基片上，用光照射使曝光區(qū)域的基片表面脫除保護(hù)基團(tuán)而形成活性羥基表面脫除保護(hù)基團(tuán)而形成活性羥基（1-2）。）。步驟步驟17引入引入5端被端被X基團(tuán)保護(hù)、基團(tuán)保護(hù)、3端被活化的單核苷酸端被活化的單核苷酸dNTP，使，使dNTP的的3端與基片上的活性羥基縮合，端與基片上的活性羥基縮合，洗去未有效

9、結(jié)合的洗去未有效結(jié)合的dNTP（3）。）。更換掩膜更換掩膜M2，重復(fù)，重復(fù)1-2，直到所需要的探針陣列合，直到所需要的探針陣列合成完畢（成完畢（4-6）。）。18 使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長(zhǎng)。數(shù)增長(zhǎng)。 某一含個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸，通過某一含個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸，通過4n個(gè)化學(xué)步驟能合成出個(gè)化學(xué)步驟能合成出4n個(gè)可能結(jié)構(gòu)。個(gè)可能結(jié)構(gòu)。例如：一個(gè)完整的十核苷酸通例如：一個(gè)完整的十核苷酸通過過32個(gè)化學(xué)步驟，個(gè)化學(xué)步驟，8個(gè)小時(shí)可能個(gè)小時(shí)可能合成合成65,536（即（即

10、216）個(gè)探針。）個(gè)探針。Picture From BROWN LAB /pbrown/19芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過芯片噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒中裝的不過芯片噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。是四種堿基等液體而不是碳粉。采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的的DNA固相合成一致，因固相合成一致，因此不需要特殊制備的化學(xué)此不需要特殊制備的化學(xué)試劑。試劑。Picture from BioDot: 20根據(jù)所需微陣列，設(shè)計(jì)有凹根據(jù)所需微陣列，設(shè)計(jì)有凹凸的微印章，然后根據(jù)預(yù)先設(shè)

11、凸的微印章，然后根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)在制備的各級(jí)印章上涂上對(duì)計(jì)在制備的各級(jí)印章上涂上對(duì)應(yīng)的單核苷酸。應(yīng)的單核苷酸。按照設(shè)計(jì)的順序?qū)⒉煌奈凑赵O(shè)計(jì)的順序?qū)⒉煌奈⒂≌轮饌€(gè)依次壓印在同一基印章逐個(gè)依次壓印在同一基片上，得到片上，得到256256陣列的陣列的高密度基因芯片。高密度基因芯片。 圖片來自益來基因網(wǎng)圖片來自益來基因網(wǎng): 21256*256分子印章陣列顯微圖分子印章陣列顯微圖 （0.18%) 高密度芯片高密度芯片DNA陣列顯微圖（陣列顯微圖（0.16%）高密度芯片高密度芯片DNA陣列熒光雜交圖（陣列熒光雜交圖（0.09%） 圖片來自益來基因網(wǎng)圖片來自益來基因網(wǎng): 分子印章多次壓印合成法點(diǎn)樣機(jī)分子印

12、章多次壓印合成法點(diǎn)樣機(jī)22采用了平面微細(xì)加工技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)大批量采用了平面微細(xì)加工技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)大批量生產(chǎn)。通過提高集成度，降低單個(gè)芯片的生產(chǎn)。通過提高集成度，降低單個(gè)芯片的成本成本可組裝大量的（可組裝大量的（104-106種）生物分子探種）生物分子探針，獲取信息量大，效率高，特別適合于針，獲取信息量大，效率高，特別適合于基因信息的采集?；蛐畔⒌牟杉＝Y(jié)合微機(jī)械技術(shù)（結(jié)合微機(jī)械技術(shù)（MEMS），可把生物樣），可把生物樣品的預(yù)處理，基因物質(zhì)的提取，擴(kuò)增，以品的預(yù)處理，基因物質(zhì)的提取，擴(kuò)增，以及雜交后的信息檢測(cè)相集成，制備成微物及雜交后的信息檢測(cè)相集成，制備成微物芯片。芯片。優(yōu)勢(shì)與特點(diǎn)優(yōu)勢(shì)與特點(diǎn)23

13、高密度高密度分辨率高分辨率高準(zhǔn)確性準(zhǔn)確性合成產(chǎn)率高合成產(chǎn)率高一致性一致性工藝最優(yōu)化工藝最優(yōu)化批量化批量化平面印刷法平面印刷法24合成點(diǎn)樣技術(shù)在基因芯片尚處于實(shí)驗(yàn)合成點(diǎn)樣技術(shù)在基因芯片尚處于實(shí)驗(yàn)研究階段時(shí)是唯一的芯片制造手段，研究階段時(shí)是唯一的芯片制造手段，曾一度被原位合成技術(shù)的光芒所掩蓋。曾一度被原位合成技術(shù)的光芒所掩蓋。隨著原位合成技術(shù)缺點(diǎn)的暴露和自動(dòng)隨著原位合成技術(shù)缺點(diǎn)的暴露和自動(dòng)化技術(shù)的進(jìn)步，合成點(diǎn)樣技術(shù)又重現(xiàn)化技術(shù)的進(jìn)步，合成點(diǎn)樣技術(shù)又重現(xiàn)生機(jī)。生機(jī)。25 是將合成好的探針、是將合成好的探針、cDNA或基因組或基因組DNA通過特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直通過特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上

14、。接點(diǎn)在芯片上。 目前，除目前，除Affymetrix等研究和生產(chǎn)基等研究和生產(chǎn)基因芯片的少數(shù)大公司使用原位合成因芯片的少數(shù)大公司使用原位合成外，其他中小型公司和實(shí)驗(yàn)室研究外，其他中小型公司和實(shí)驗(yàn)室研究中仍然普遍采用合成點(diǎn)樣法。中仍然普遍采用合成點(diǎn)樣法。 26該技術(shù)由該技術(shù)由Shalon和和Brown于于1995年發(fā)展年發(fā)展起來的另一類具有生命力的基因芯片制起來的另一類具有生命力的基因芯片制備技術(shù)。備技術(shù)。美國(guó)美國(guó)Synteni公司最終發(fā)展出商品儀器，公司最終發(fā)展出商品儀器，完成其商品化。完成其商品化。27 通過毛細(xì)作用使用點(diǎn)樣針將生化物質(zhì)轉(zhuǎn)移通過毛細(xì)作用使用點(diǎn)樣針將生化物質(zhì)轉(zhuǎn)移到固體基底表面

15、（點(diǎn)樣針與基底表面接到固體基底表面（點(diǎn)樣針與基底表面接觸）。觸）。 第一輪結(jié)束后，清洗點(diǎn)樣針進(jìn)行下一輪操第一輪結(jié)束后，清洗點(diǎn)樣針進(jìn)行下一輪操作。作。 機(jī)器人控制系統(tǒng)可使其實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化生產(chǎn)。機(jī)器人控制系統(tǒng)可使其實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化生產(chǎn)。方法與步驟方法與步驟28此種方法先進(jìn)之處在于采用了壓電和其此種方法先進(jìn)之處在于采用了壓電和其他推動(dòng)方式從微型噴嘴向固體表面轉(zhuǎn)移他推動(dòng)方式從微型噴嘴向固體表面轉(zhuǎn)移生化成分。生化成分。該技術(shù)正由該技術(shù)正由Incyte Pharmaceuticals (Palo Alto, CA, USA)和和Protogene (Palo Alto, CA, USA)等幾處中心進(jìn)行發(fā)展。等幾處中

16、心進(jìn)行發(fā)展。29 用與壓電接口（方型）相連的微型用與壓電接口（方型）相連的微型噴嘴將生化物質(zhì)噴向基底，通過電噴嘴將生化物質(zhì)噴向基底，通過電流控制使樣品體積得到精確控制。流控制使樣品體積得到精確控制。 第一輪結(jié)束后，清洗噴嘴進(jìn)行下一第一輪結(jié)束后，清洗噴嘴進(jìn)行下一步。步。方法與步驟方法與步驟301980年年Bains等將預(yù)先合成的短等將預(yù)先合成的短DNA片片段固定在固相支持物上進(jìn)行的雜交測(cè)序段固定在固相支持物上進(jìn)行的雜交測(cè)序?qū)嶒?yàn)是基因芯片的最原始模型，所以合實(shí)驗(yàn)是基因芯片的最原始模型，所以合成點(diǎn)樣是基因芯片制作的最原始的方法成點(diǎn)樣是基因芯片制作的最原始的方法由由Affymetrix公司發(fā)展起來的光

17、導(dǎo)公司發(fā)展起來的光導(dǎo)ODTA合成照相平板印刷術(shù)將基因芯片合成照相平板印刷術(shù)將基因芯片引入了工業(yè)化生產(chǎn)的階段。引入了工業(yè)化生產(chǎn)的階段。31將樣品處理、芯片雜交和信號(hào)檢測(cè)集于一將樣品處理、芯片雜交和信號(hào)檢測(cè)集于一體的所謂體的所謂“縮微實(shí)驗(yàn)室縮微實(shí)驗(yàn)室”逐漸成為基因芯逐漸成為基因芯片發(fā)展的新趨勢(shì)。在這方面主要有以下技片發(fā)展的新趨勢(shì)。在這方面主要有以下技術(shù)較為成功：術(shù)較為成功：電子芯片電子芯片三維芯片三維芯片流過式芯片流過式芯片石英諧振芯片石英諧振芯片32片基為帶有正電荷的硅片，硅片經(jīng)熱氧化，片基為帶有正電荷的硅片，硅片經(jīng)熱氧化，制成制成1mm2的陣列，每個(gè)陣列含多個(gè)微電極，的陣列，每個(gè)陣列含多個(gè)微電

18、極，在每個(gè)電極上通過氮化硅沉積和蝕刻制備出在每個(gè)電極上通過氮化硅沉積和蝕刻制備出樣品池。樣品池。將鏈連有親和素的瓊脂糖覆蓋在電極上，在將鏈連有親和素的瓊脂糖覆蓋在電極上，在電場(chǎng)作用下預(yù)先合成的生物素標(biāo)記的探針即電場(chǎng)作用下預(yù)先合成的生物素標(biāo)記的探針即可結(jié)合在特定電極上?？山Y(jié)合在特定電極上。AVI from Nanogen:33Picture from Nanogne website: 最早由美國(guó)最早由美國(guó)Nanogen公司開發(fā)，目前國(guó)內(nèi)清公司開發(fā)，目前國(guó)內(nèi)清華大學(xué)和復(fù)旦大學(xué)也在開發(fā)這一技術(shù)。華大學(xué)和復(fù)旦大學(xué)也在開發(fā)這一技術(shù)。最大特點(diǎn)：最大特點(diǎn)：雜交速度快，可大大縮短分析時(shí)間。雜交速度快，可大大縮

19、短分析時(shí)間。最大不足：最大不足：芯片制備復(fù)雜、成本較高。芯片制備復(fù)雜、成本較高。34片基上為大量的微小聚乙烯酰胺凝膠條，每片基上為大量的微小聚乙烯酰胺凝膠條，每個(gè)凝膠條可用個(gè)凝膠條可用DNA分析。分析。先把已知化合物加在凝膠條上，用先把已知化合物加在凝膠條上，用3cm長(zhǎng)的微長(zhǎng)的微型玻璃毛細(xì)管將待測(cè)樣品加到凝膠條上。型玻璃毛細(xì)管將待測(cè)樣品加到凝膠條上。35凝膠條的三維化能加進(jìn)更多的已知物質(zhì)，凝膠條的三維化能加進(jìn)更多的已知物質(zhì)，增加了敏感性。增加了敏感性。可以在芯片上同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增與檢測(cè)?？梢栽谛酒贤瑫r(shí)進(jìn)行擴(kuò)增與檢測(cè)。是該技術(shù)不僅可以用于基因芯片，也可是該技術(shù)不僅可以用于基因芯片，也可以制作蛋白芯

20、片。以制作蛋白芯片。美國(guó)的美國(guó)的Packard、摩托羅拉、摩托羅拉、Argonne國(guó)家實(shí)驗(yàn)室三家國(guó)家實(shí)驗(yàn)室三家機(jī)構(gòu)與俄羅斯機(jī)構(gòu)與俄羅斯Engelhardt分子生物學(xué)研究所合作開發(fā)。分子生物學(xué)研究所合作開發(fā)。應(yīng)用優(yōu)勢(shì)應(yīng)用優(yōu)勢(shì)36在芯片片基上制成格柵狀微通道，將預(yù)在芯片片基上制成格柵狀微通道，將預(yù)先設(shè)計(jì)及合成的特定寡核苷酸探針結(jié)合先設(shè)計(jì)及合成的特定寡核苷酸探針結(jié)合于芯片上微通道內(nèi)的特定區(qū)域。于芯片上微通道內(nèi)的特定區(qū)域。Picutre from UKMSTS Suimmit Conference:37從待測(cè)樣品中分離從待測(cè)樣品中分離DNA或或RNA并對(duì)其并對(duì)其進(jìn)行熒光標(biāo)記。進(jìn)行熒光標(biāo)記。將標(biāo)記的靶核

21、酸樣品流過芯片，固定在將標(biāo)記的靶核酸樣品流過芯片，固定在芯片上微通道內(nèi)的寡核苷酸探針捕獲與芯片上微通道內(nèi)的寡核苷酸探針捕獲與之相互補(bǔ)的靶核酸。之相互補(bǔ)的靶核酸。Picutre from UKMSTS Suimmit Conference:38特點(diǎn)特點(diǎn)敏感性高，由于寡核苷酸吸咐表面的增大，敏感性高，由于寡核苷酸吸咐表面的增大，流過式芯片可監(jiān)測(cè)稀有基因表達(dá)的變化。流過式芯片可監(jiān)測(cè)稀有基因表達(dá)的變化。速度快，微通道加速了雜交反應(yīng)，減少了每速度快，微通道加速了雜交反應(yīng)，減少了每次檢測(cè)所需時(shí)間。次檢測(cè)所需時(shí)間。價(jià)格降低，由于采用了特殊的共價(jià)化學(xué)技術(shù)價(jià)格降低，由于采用了特殊的共價(jià)化學(xué)技術(shù)將寡核苷酸吸咐于微

22、通道內(nèi)，使每一種流過將寡核苷酸吸咐于微通道內(nèi)，使每一種流過式芯片可反復(fù)使用多次，從而使其成本降低。式芯片可反復(fù)使用多次，從而使其成本降低。Gene Logic 正在開發(fā)正在開發(fā) 39靶基因的制備需要運(yùn)用常規(guī)手段從細(xì)胞和靶基因的制備需要運(yùn)用常規(guī)手段從細(xì)胞和組織中提取模板分子，進(jìn)行模板的擴(kuò)增和組織中提取模板分子，進(jìn)行模板的擴(kuò)增和標(biāo)記。標(biāo)記。靶基因樣品的制備方法將根據(jù)基因芯片的靶基因樣品的制備方法將根據(jù)基因芯片的類型和所研究的對(duì)象（如類型和所研究的對(duì)象（如mRNA、DNA等）等）而決定。而決定。40核酸樣品制備是基因芯片分析的必須步核酸樣品制備是基因芯片分析的必須步驟，傳統(tǒng)的化學(xué)提取法比較費(fèi)時(shí)，不能

23、驟，傳統(tǒng)的化學(xué)提取法比較費(fèi)時(shí)，不能滿足基因芯片對(duì)快速高效的要求。因而，滿足基因芯片對(duì)快速高效的要求。因而，人們發(fā)明了與芯片相結(jié)合的核酸提取方人們發(fā)明了與芯片相結(jié)合的核酸提取方法。法。 芯片微過濾法芯片微過濾法 生物電子芯片法生物電子芯片法41賓夕法尼亞大學(xué)的研究小組針對(duì)人白細(xì)賓夕法尼亞大學(xué)的研究小組針對(duì)人白細(xì)胞的分離設(shè)計(jì)的一種核酸樣品制備方法。胞的分離設(shè)計(jì)的一種核酸樣品制備方法。微過濾芯片是通過在硅片上刻出幾個(gè)微微過濾芯片是通過在硅片上刻出幾個(gè)微米大小的各種形狀的過濾微通道，再在米大小的各種形狀的過濾微通道，再在硅芯片上加上一塊玻璃蓋片而成。硅芯片上加上一塊玻璃蓋片而成。 發(fā)展經(jīng)歷了豎式發(fā)展經(jīng)

24、歷了豎式Z型結(jié)構(gòu)、豎式條狀梳式型結(jié)構(gòu)、豎式條狀梳式結(jié)構(gòu)到最終的橫壩式結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)到最終的橫壩式結(jié)構(gòu)。 芯片微過濾法芯片微過濾法42為了把不同的癌細(xì)胞、為了把不同的癌細(xì)胞、細(xì)菌或病毒從血清、細(xì)菌或病毒從血清、水樣或其他液體樣品水樣或其他液體樣品中分離而設(shè)計(jì)的用作中分離而設(shè)計(jì)的用作介電電泳的細(xì)胞分離介電電泳的細(xì)胞分離方法。方法。通過在硅芯片上制作通過在硅芯片上制作一系列各種排列的金一系列各種排列的金屬電極和在這些電極屬電極和在這些電極上施加高頻電場(chǎng)，使上施加高頻電場(chǎng)，使不同的細(xì)胞內(nèi)感應(yīng)出不同的細(xì)胞內(nèi)感應(yīng)出偶電極。偶電極的出偶電極。偶電極的出現(xiàn)反過來使細(xì)胞承受現(xiàn)反過來使細(xì)胞承受正介電力或負(fù)介電力，正介

25、電力或負(fù)介電力，從而使細(xì)胞從各種液從而使細(xì)胞從各種液體樣品中分離出來。體樣品中分離出來。生物電子芯片法生物電子芯片法Picture from Nanogen website: 43美國(guó)的美國(guó)的Nanogen公司通公司通過在微過濾芯片的電極過在微過濾芯片的電極上施加一系列高壓脈沖上施加一系列高壓脈沖對(duì)電極上分離得到的大對(duì)電極上分離得到的大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)行電腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)行電子胞解，獲得了大腸桿子胞解，獲得了大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的各種菌細(xì)胞內(nèi)的各種RNA和和DNA。Picture from Nanogen website: 44主要采用熒光分子標(biāo)記：主要采用熒光分子標(biāo)記：常規(guī)標(biāo)記常規(guī)標(biāo)記在擴(kuò)增過程中

26、加入含有熒在擴(kuò)增過程中加入含有熒光標(biāo)記的光標(biāo)記的dNTP（至少一種為熒光標(biāo)記）。（至少一種為熒光標(biāo)記）。末端標(biāo)記末端標(biāo)記直接在引物上標(biāo)記熒光。直接在引物上標(biāo)記熒光。45熒光顯影法熒光顯影法質(zhì)譜法質(zhì)譜法化學(xué)發(fā)光法化學(xué)發(fā)光法光導(dǎo)纖維法光導(dǎo)纖維法壓電石英諧振法壓電石英諧振法ScanningmRNALabelingHybridizationCellAVI from Nanogen:46用熒光素標(biāo)記擴(kuò)增后的用熒光素標(biāo)記擴(kuò)增后的待測(cè)核酸樣品，將熒光素待測(cè)核酸樣品，將熒光素標(biāo)記的待測(cè)核酸樣品與芯標(biāo)記的待測(cè)核酸樣品與芯片進(jìn)行雜交，再洗去未雜片進(jìn)行雜交，再洗去未雜交的標(biāo)記樣品，然后用熒交的標(biāo)記樣品，然后用熒光顯

27、微鏡或熒光掃描儀對(duì)光顯微鏡或熒光掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描以采集每點(diǎn)芯片進(jìn)行掃描以采集每點(diǎn)的熒光強(qiáng)度并用電腦進(jìn)行的熒光強(qiáng)度并用電腦進(jìn)行分析比較。分析比較。47目前應(yīng)用最廣泛的熒光檢測(cè)系統(tǒng)。目前應(yīng)用最廣泛的熒光檢測(cè)系統(tǒng)。芯片倒扣在盛有待檢核酸的儲(chǔ)液器上，芯片的探針與芯片倒扣在盛有待檢核酸的儲(chǔ)液器上，芯片的探針與液面相接觸并進(jìn)行雜交反應(yīng)，能與靶核酸互補(bǔ)的探針液面相接觸并進(jìn)行雜交反應(yīng)，能與靶核酸互補(bǔ)的探針對(duì)標(biāo)記有熒光素的待檢核酸起捕獲作用。對(duì)標(biāo)記有熒光素的待檢核酸起捕獲作用。當(dāng)激光從芯片的背面聚焦于芯片與靶當(dāng)激光從芯片的背面聚焦于芯片與靶DNA的接觸面的接觸面時(shí)，與待檢核酸雜交了的位點(diǎn)就被激發(fā)熒光，熒光信

28、時(shí)，與待檢核酸雜交了的位點(diǎn)就被激發(fā)熒光，熒光信號(hào)經(jīng)棱鏡后聚焦于空間共聚焦小孔，并通過小孔而被號(hào)經(jīng)棱鏡后聚焦于空間共聚焦小孔，并通過小孔而被檢測(cè)器捕獲。檢測(cè)器捕獲。48雖然激光同時(shí)也會(huì)激發(fā)儲(chǔ)液器里未與芯片雜雖然激光同時(shí)也會(huì)激發(fā)儲(chǔ)液器里未與芯片雜交的標(biāo)記靶核酸，但由于它們不在共聚焦小交的標(biāo)記靶核酸，但由于它們不在共聚焦小孔的焦平面，故這種熒光被小孔阻擋而不能孔的焦平面，故這種熒光被小孔阻擋而不能到達(dá)檢測(cè)器。到達(dá)檢測(cè)器。應(yīng)用激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)在數(shù)分鐘內(nèi)即應(yīng)用激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)在數(shù)分鐘內(nèi)即可得到一個(gè)二維的雜交模式，通過改變溫度可得到一個(gè)二維的雜交模式，通過改變溫度還可以得到雜交的熱動(dòng)力學(xué)信息。

29、還可以得到雜交的熱動(dòng)力學(xué)信息。49熱力學(xué)穩(wěn)定性熱力學(xué)穩(wěn)定性 完全正常的完全正常的 Watson-Crick配對(duì)雙鏈配對(duì)雙鏈 錯(cuò)配錯(cuò)配堿基的雙鏈堿基的雙鏈熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度 完全正常的完全正常的 Watson-Crick配對(duì)雙鏈配對(duì)雙鏈 錯(cuò)配錯(cuò)配堿基的雙鏈（堿基的雙鏈（5-35%）50電荷偶合裝置電荷偶合裝置CCD（charge-coupled devices）光電倍增管光電倍增管PMT（photomultiplier tube）51圖片來自益來基因網(wǎng)圖片來自益來基因網(wǎng): CCD成像技術(shù)：主要用于中、高密度基因芯片的檢測(cè)成像技術(shù)：主要用于中、高密度基因芯片的檢測(cè)52Genomic Solution

30、s公司公司Packard公司公司GSI公司公司Beecher Instruments公司公司Molecular DynamicsGenetic Microsystems公司公司Axon Instruments公司公司53化學(xué)發(fā)光與熒光法的基本原理類似，但化學(xué)發(fā)光與熒光法的基本原理類似，但標(biāo)記物不是熒光素而是魯米諾之類具有標(biāo)記物不是熒光素而是魯米諾之類具有化學(xué)發(fā)光特性的物質(zhì)。化學(xué)發(fā)光特性的物質(zhì)?；瘜W(xué)發(fā)光比熒光法的靈敏度更高。化學(xué)發(fā)光比熒光法的靈敏度更高。 54將合成的氰脲酰氯活化的寡核苷酸探針固定將合成的氰脲酰氯活化的寡核苷酸探針固定在直徑在直徑200m的光纖末端，然后固定有不同的光纖末端，然后

31、固定有不同探針的光纖按特定位置組合成束，形成一個(gè)探針的光纖按特定位置組合成束，形成一個(gè)微陣列的傳感裝置即光纖微陣列的傳感裝置即光纖DNA生物傳感器微生物傳感器微陣列。陣列。其探針末端可以伸入樣品溶液中，雜交的熒其探針末端可以伸入樣品溶液中，雜交的熒光信號(hào)由光纖另一端偶聯(lián)的光信號(hào)由光纖另一端偶聯(lián)的CCD相機(jī)接受。相機(jī)接受。整個(gè)分析操作可在整個(gè)分析操作可在5分鐘內(nèi)完成。分鐘內(nèi)完成。 55光纖光纖DNA生物傳感器微陣列的探針敏感膜生物傳感器微陣列的探針敏感膜可以再生使用，因而成本得以降低?？梢栽偕褂?，因而成本得以降低。這種將傳感器與微陣列結(jié)合起來的方法特這種將傳感器與微陣列結(jié)合起來的方法特別適用于

32、操作雜交分析不方便的環(huán)境和不別適用于操作雜交分析不方便的環(huán)境和不具備激光共聚焦顯微鏡這種昂貴設(shè)備的實(shí)具備激光共聚焦顯微鏡這種昂貴設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室（如臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室），對(duì)推廣基因驗(yàn)室（如臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室），對(duì)推廣基因芯片的應(yīng)用有重要意義。芯片的應(yīng)用有重要意義。 56傳感裝置采用壓電石英諧振晶體傳感裝置采用壓電石英諧振晶體目前正在開發(fā)之中目前正在開發(fā)之中57石英諧振石英諧振DNA生物傳感器微陣列比光纖生物傳感器微陣列比光纖DNA生物傳感器微陣列更具優(yōu)越性生物傳感器微陣列更具優(yōu)越性石英諧振傳感器具有微天平之稱，敏感性很高（理石英諧振傳感器具有微天平之稱，敏感性很高（理論上可達(dá)到論上可達(dá)到fg級(jí)水平），有望

33、省略雜交前的擴(kuò)增步驟。級(jí)水平），有望省略雜交前的擴(kuò)增步驟。石英諧振傳感器的響應(yīng)機(jī)制是石英諧振傳感器的響應(yīng)機(jī)制是“壓電效應(yīng)壓電效應(yīng)”，即對(duì)，即對(duì)質(zhì)量敏感，所以無須對(duì)探針或靶核酸進(jìn)行標(biāo)記。質(zhì)量敏感，所以無須對(duì)探針或靶核酸進(jìn)行標(biāo)記。 581998年底美國(guó)科學(xué)促進(jìn)會(huì)將基因芯片列年底美國(guó)科學(xué)促進(jìn)會(huì)將基因芯片列為為1998年度自然科學(xué)領(lǐng)域十大進(jìn)展之一年度自然科學(xué)領(lǐng)域十大進(jìn)展之一 59雜交測(cè)序技術(shù)（雜交測(cè)序技術(shù)（SBH）鄰堆雜交技術(shù)（鄰堆雜交技術(shù)（CSH）毛細(xì)管電泳芯片測(cè)序技術(shù)毛細(xì)管電泳芯片測(cè)序技術(shù)60基因芯片發(fā)展和應(yīng)用的基礎(chǔ)?；蛐酒l(fā)展和應(yīng)用的基礎(chǔ)。任何線性任何線性DNA或或RNA單鏈均可分解為一系列堿

34、單鏈均可分解為一系列堿基數(shù)固定、錯(cuò)落重疊的寡核苷酸片段（基數(shù)固定、錯(cuò)落重疊的寡核苷酸片段（ODT），），或稱為亞序列（或稱為亞序列（subsequence） 61 將所有將所有n體亞序列探針都固定在一個(gè)固相支持物上，體亞序列探針都固定在一個(gè)固相支持物上，n體亞體亞序列探針的序列與其在固相支持物上的位點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)形成序列探針的序列與其在固相支持物上的位點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)形成探針陣列。探針陣列。 被標(biāo)記的靶序列與芯片進(jìn)行雜交后，芯片上所有雜交信號(hào)被標(biāo)記的靶序列與芯片進(jìn)行雜交后，芯片上所有雜交信號(hào)的位點(diǎn)組成一個(gè)的位點(diǎn)組成一個(gè)“雜交模式雜交模式”，該，該“雜交模式雜交模式”實(shí)際上反實(shí)際上反應(yīng)的是靶序列的所有應(yīng)的

35、是靶序列的所有n體亞序列信息，計(jì)算機(jī)通過對(duì)該體亞序列信息，計(jì)算機(jī)通過對(duì)該“雜交模式雜交模式”的分析就可以確定靶核酸的序列。的分析就可以確定靶核酸的序列。 方法與步驟方法與步驟62采用采用SBH技術(shù)，用含技術(shù)，用含65,536個(gè)個(gè)8聚寡核苷聚寡核苷酸的微陣列，可測(cè)定酸的微陣列，可測(cè)定200bp長(zhǎng)長(zhǎng)DNA序列，序列，采用采用67,108,864個(gè)個(gè)13聚寡核苷酸探針的微聚寡核苷酸探針的微陣列，可對(duì)數(shù)千個(gè)堿基長(zhǎng)的陣列，可對(duì)數(shù)千個(gè)堿基長(zhǎng)的DNA測(cè)序。測(cè)序。 63SBH技術(shù)的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量技術(shù)的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長(zhǎng)度的增加而提高，但微陣列中寡核苷酸與長(zhǎng)度的增加而提高，但微陣列中

36、寡核苷酸數(shù)量與長(zhǎng)度的增加則提高了微陣列的復(fù)雜性，數(shù)量與長(zhǎng)度的增加則提高了微陣列的復(fù)雜性，降低了雜交準(zhǔn)確性。降低了雜交準(zhǔn)確性。 CSH技術(shù)彌補(bǔ)了技術(shù)彌補(bǔ)了SBH技術(shù)存在的弊端，技術(shù)存在的弊端，CSH技術(shù)的應(yīng)用增加了微陣列中寡核苷酸的有效技術(shù)的應(yīng)用增加了微陣列中寡核苷酸的有效長(zhǎng)度，加強(qiáng)了序列準(zhǔn)確性，可進(jìn)行較長(zhǎng)的長(zhǎng)度，加強(qiáng)了序列準(zhǔn)確性，可進(jìn)行較長(zhǎng)的DNA測(cè)序。測(cè)序。 64CSH雜交測(cè)序原理示意圖（點(diǎn)擊此處觀看雜交測(cè)序原理示意圖（點(diǎn)擊此處觀看Flash動(dòng)畫）動(dòng)畫）65Mathies等成功地應(yīng)用通過光刻加工出等成功地應(yīng)用通過光刻加工出的毛細(xì)管長(zhǎng)的毛細(xì)管長(zhǎng)3.5厘米、橫切面厘米、橫切面50微米微米8微米的

37、毛細(xì)管電泳測(cè)序芯片在微米的毛細(xì)管電泳測(cè)序芯片在10分鐘內(nèi)分鐘內(nèi)完成了含完成了含433堿基對(duì)的堿基對(duì)的DNA序列測(cè)定。序列測(cè)定。美國(guó)的美國(guó)的CuraGen公司和普林斯頓大學(xué)也公司和普林斯頓大學(xué)也正在從事這類芯片的研究開發(fā)工作。正在從事這類芯片的研究開發(fā)工作。 66隨著人類基因組計(jì)劃的順利進(jìn)行，基因組研隨著人類基因組計(jì)劃的順利進(jìn)行，基因組研究的重心轉(zhuǎn)了功能基因組學(xué)，研究基因的功究的重心轉(zhuǎn)了功能基因組學(xué)，研究基因的功能，特別是研究疾病相關(guān)基因已成了生物科能，特別是研究疾病相關(guān)基因已成了生物科技界的熱點(diǎn)。基因表達(dá)芯片為此提供了最好技界的熱點(diǎn)?；虮磉_(dá)芯片為此提供了最好的技術(shù)平臺(tái)。的技術(shù)平臺(tái)。67對(duì)大多

38、數(shù)基因而言，對(duì)大多數(shù)基因而言，mRNA表達(dá)水平與表達(dá)水平與其蛋白質(zhì)的水平相對(duì)應(yīng)。其蛋白質(zhì)的水平相對(duì)應(yīng)。Picture from IIR: .inet.uni2.dk/iirrh/IIRhome.htm68一般以一般以O(shè)ligo-dT作引物進(jìn)行作引物進(jìn)行RT-PCR制備靶基制備靶基因，對(duì)細(xì)胞內(nèi)大量基因的因，對(duì)細(xì)胞內(nèi)大量基因的mRNA表達(dá)差異進(jìn)表達(dá)差異進(jìn)行檢測(cè)，從而了解細(xì)胞的性質(zhì)與狀態(tài)。行檢測(cè)，從而了解細(xì)胞的性質(zhì)與狀態(tài)?；蛐酒夹g(shù)可清楚地直接快速地檢測(cè)出以基因芯片技術(shù)可清楚地直接快速地檢測(cè)出以1:300,000水平出現(xiàn)的水平出現(xiàn)的mRNA，且易于同時(shí)監(jiān)，且易于同時(shí)監(jiān)測(cè)成千上萬的基因。測(cè)成千上萬的

39、基因。 69RRRRGG: AB: A=B: ABSample ASample Bpreparation of mRNAlabeled cDNAmixinghybridizationpreparation of mRNAlabeled cDNA基因表達(dá)分析示意圖基因表達(dá)分析示意圖70由于生物芯片技術(shù)可直接測(cè)到由于生物芯片技術(shù)可直接測(cè)到mRNA的的種類及豐度，所以它是研究基因表達(dá)的種類及豐度，所以它是研究基因表達(dá)的有力工具。有力工具?；蛐酒N包含了幾萬種人工合成的寡基因芯片種包含了幾萬種人工合成的寡核苷酸探針或核苷酸探針或cDNA，可檢測(cè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可檢測(cè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從幾個(gè)數(shù)量級(jí)到每個(gè)細(xì)胞的幾個(gè)拷貝

40、，從幾個(gè)數(shù)量級(jí)到每個(gè)細(xì)胞的幾個(gè)拷貝，均能被定量研究，被檢測(cè)目的基因可多均能被定量研究，被檢測(cè)目的基因可多達(dá)達(dá)10,000個(gè)。個(gè)。71系統(tǒng)微型化，樣品需量極小系統(tǒng)微型化，樣品需量極小 同時(shí)研究上萬個(gè)基因的表達(dá)變化，同時(shí)研究上萬個(gè)基因的表達(dá)變化，研究效率明顯提高研究效率明顯提高 能更多地揭示基因之間表達(dá)變化能更多地揭示基因之間表達(dá)變化的相互關(guān)系，從而研究基因與基的相互關(guān)系，從而研究基因與基因之間內(nèi)在的作用關(guān)系因之間內(nèi)在的作用關(guān)系 檢測(cè)基因表達(dá)變化的靈敏度高，檢測(cè)基因表達(dá)變化的靈敏度高，可檢測(cè)豐度相差幾個(gè)數(shù)量級(jí)的表可檢測(cè)豐度相差幾個(gè)數(shù)量級(jí)的表達(dá)情況達(dá)情況 節(jié)約費(fèi)用和時(shí)間節(jié)約費(fèi)用和時(shí)間 表達(dá)譜基因芯片

41、研究基因表達(dá)與傳統(tǒng)的表達(dá)譜基因芯片研究基因表達(dá)與傳統(tǒng)的Northern Blot相比有許多重要的優(yōu)點(diǎn)相比有許多重要的優(yōu)點(diǎn)72定量檢測(cè)大量基因表達(dá)水平在闡述基因定量檢測(cè)大量基因表達(dá)水平在闡述基因功能、探索疾病原因及機(jī)理、發(fā)現(xiàn)可能功能、探索疾病原因及機(jī)理、發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療等方面是很有價(jià)值的。的診斷及治療等方面是很有價(jià)值的?；蛐酒夹g(shù)在發(fā)現(xiàn)新基因及分析各個(gè)基因芯片技術(shù)在發(fā)現(xiàn)新基因及分析各個(gè)基因在不同時(shí)空表達(dá)方面時(shí)一項(xiàng)十分有基因在不同時(shí)空表達(dá)方面時(shí)一項(xiàng)十分有用的技術(shù)，它具有樣品用量極少，自動(dòng)用的技術(shù)，它具有樣品用量極少，自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，便于大量篩選新基因?；潭雀叩葍?yōu)點(diǎn)，便于大量篩選新基因。

42、73目前，大量人類目前，大量人類ESTs給給cDNA微陣列提供微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫(kù)中了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫(kù)中400,000個(gè)個(gè)ESTs代表了所有人類基因，成千上萬的代表了所有人類基因，成千上萬的ESTs微陣列將為人類基因表達(dá)研究提供強(qiáng)有力微陣列將為人類基因表達(dá)研究提供強(qiáng)有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析。的功能分析。74腫瘤和遺傳性疾病發(fā)生的根本原因是由于腫瘤和遺傳性疾病發(fā)生的根本原因是由于遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變。遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變。檢測(cè)基因突變對(duì)于闡明腫瘤與遺傳病的分檢測(cè)基因突變對(duì)于闡明腫瘤與遺傳病的分子機(jī)制、疾病的早期診斷具有重要意義

43、。子機(jī)制、疾病的早期診斷具有重要意義。75以往研究突變和多態(tài)時(shí)多采用以往研究突變和多態(tài)時(shí)多采用PCR-SS-CP、手工或自動(dòng)測(cè)序、異源雙鏈分析、手工或自動(dòng)測(cè)序、異源雙鏈分析、蛋白截短檢測(cè)等方法，所有這些都需經(jīng)蛋白截短檢測(cè)等方法，所有這些都需經(jīng)過電泳環(huán)節(jié)，不能滿足大規(guī)模、低消耗過電泳環(huán)節(jié)，不能滿足大規(guī)模、低消耗和自動(dòng)化的要求。和自動(dòng)化的要求。應(yīng)用基因芯片方法檢測(cè)時(shí)可克服上述不應(yīng)用基因芯片方法檢測(cè)時(shí)可克服上述不足，且與足，且與DNA聚合酶或連接酶結(jié)合檢測(cè)聚合酶或連接酶結(jié)合檢測(cè)時(shí)可獲得更高的分辨率時(shí)可獲得更高的分辨率76Hacia等用含有等用含有96,000個(gè)寡核苷酸探針的基因個(gè)寡核苷酸探針的基因芯

44、片來檢測(cè)遺傳性乳腺癌基因芯片來檢測(cè)遺傳性乳腺癌基因BRCA1第第11外外顯子顯子3.45kb長(zhǎng)度內(nèi)的所有可能的雜合性突變，長(zhǎng)度內(nèi)的所有可能的雜合性突變，包括堿基替換及小的插入、缺失等，并借此包括堿基替換及小的插入、缺失等，并借此確定發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。確定發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)?；蛐酒部捎糜诜伟?、卵巢癌、前列腺癌、基因芯片也可用于肺癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的研究中，為腫瘤基因組結(jié)腸癌等多種腫瘤的研究中，為腫瘤基因組解剖計(jì)劃（解剖計(jì)劃（CGAP）的完成提供重要的技術(shù)）的完成提供重要的技術(shù)支持。支持。77Lipshutz等證明基因芯片可用來篩查等證明基因芯片可用來篩查HIV病毒的蛋白酶基因和反轉(zhuǎn)錄酶基因

45、病毒的蛋白酶基因和反轉(zhuǎn)錄酶基因的突變。這些突變能引起對(duì)抗生素，如的突變。這些突變能引起對(duì)抗生素，如AZT等的抗性。等的抗性。Affymetrix公司已制造出商用公司已制造出商用HIV芯片，芯片，包括包括1,040個(gè)蛋白酶和反轉(zhuǎn)錄酶基因，個(gè)蛋白酶和反轉(zhuǎn)錄酶基因，用來研究病毒抗性發(fā)展過程中的堿基突用來研究病毒抗性發(fā)展過程中的堿基突變。變。78Chee等制造了含有等制造了含有135,000個(gè)個(gè)25-mer探針的基探針的基因芯片來探測(cè)因芯片來探測(cè)16.6kb的人線粒體基因組。共的人線粒體基因組。共分析了分析了10個(gè)樣本，檢出個(gè)樣本，檢出505個(gè)多態(tài)。每個(gè)樣本個(gè)多態(tài)。每個(gè)樣本可在可在12min內(nèi)閱讀完畢

46、，正確率達(dá)內(nèi)閱讀完畢，正確率達(dá)99%。據(jù)。據(jù)估測(cè)，每一工作日可閱讀估測(cè)，每一工作日可閱讀40個(gè)線粒體基因組，個(gè)線粒體基因組，大大高于現(xiàn)在凝膠測(cè)序儀可達(dá)到的每日大大高于現(xiàn)在凝膠測(cè)序儀可達(dá)到的每日2個(gè)基個(gè)基因組水平。因組水平。基因芯片除可用于研究基因芯片除可用于研究mtDNA基因突變以及基因突變以及民族內(nèi)和民族間民族內(nèi)和民族間mtDNA的多態(tài)性外，還可用的多態(tài)性外，還可用來揭示來揭示mtDNA基因的表達(dá)與神經(jīng)性疾病和長(zhǎng)基因的表達(dá)與神經(jīng)性疾病和長(zhǎng)壽等關(guān)系。壽等關(guān)系。79SBH技術(shù)可大規(guī)模地檢測(cè)和分析技術(shù)可大規(guī)模地檢測(cè)和分析DNA的變異及的變異及多態(tài)性。多態(tài)性。Picture from NCBI we

47、bsite.突變突變80基因芯片技術(shù)是一項(xiàng)高效、準(zhǔn)確的基因芯片技術(shù)是一項(xiàng)高效、準(zhǔn)確的DNA序列分析技術(shù)，將基因芯片技術(shù)用于檢序列分析技術(shù)，將基因芯片技術(shù)用于檢測(cè)分子突變，不僅可準(zhǔn)確地確定突變位測(cè)分子突變，不僅可準(zhǔn)確地確定突變位置和類型，更可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，及置和類型，更可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，及至整個(gè)基因組的突變，其快速高效是其至整個(gè)基因組的突變，其快速高效是其它方法無法比擬的。它方法無法比擬的。81基因芯片技術(shù)用于基因組研究可創(chuàng)造第基因芯片技術(shù)用于基因組研究可創(chuàng)造第三代遺傳圖，即將遺傳病表型于三代遺傳圖，即將遺傳病表型于DNA上上特定的基因序列聯(lián)系起來。特定的基因序列聯(lián)系起來。以單核苷酸多態(tài)性

48、（以單核苷酸多態(tài)性（SNPs) 為標(biāo)記可幫為標(biāo)記可幫助區(qū)分兩個(gè)個(gè)體遺傳物質(zhì)的差異，若能助區(qū)分兩個(gè)個(gè)體遺傳物質(zhì)的差異，若能將所有將所有SNPs全部信息裝入生物芯片則全部信息裝入生物芯片則可檢測(cè)到與之相關(guān)的基因間差異。可檢測(cè)到與之相關(guān)的基因間差異。多態(tài)性分析多態(tài)性分析82基因組測(cè)序完成后，未知基因的功能研基因組測(cè)序完成后，未知基因的功能研究是一個(gè)十分誘人的后基因組研究課題。究是一個(gè)十分誘人的后基因組研究課題。 斯坦福大學(xué)的斯坦福大學(xué)的Davis研究小組的研究提示研究小組的研究提示DNA芯片技術(shù)將來可能應(yīng)用于人類基因芯片技術(shù)將來可能應(yīng)用于人類基因組測(cè)序完成后未明開放讀碼框架組測(cè)序完成后未明開放讀碼框

49、架ORF生生物學(xué)功能的研究，可能會(huì)對(duì)深刻認(rèn)識(shí)生物學(xué)功能的研究，可能會(huì)對(duì)深刻認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象及藥物設(shè)計(jì)帶來重大影響。命現(xiàn)象及藥物設(shè)計(jì)帶來重大影響。83Davis研究小組利用研究小組利用DNA芯片技術(shù)對(duì)酵母缺失芯片技術(shù)對(duì)酵母缺失突變株進(jìn)行定量分析以確定酵母全序列測(cè)定突變株進(jìn)行定量分析以確定酵母全序列測(cè)定完成后新發(fā)現(xiàn)的完成后新發(fā)現(xiàn)的ORF的生物學(xué)功能。他們應(yīng)的生物學(xué)功能。他們應(yīng)用基因打靶技術(shù)產(chǎn)生多個(gè)用基因打靶技術(shù)產(chǎn)生多個(gè)ORF缺失的酵母突缺失的酵母突變株，并在缺失變株，并在缺失ORF旁引入旁引入20個(gè)核苷酸的標(biāo)個(gè)核苷酸的標(biāo)志序列作為缺失志序列作為缺失ORF的身份標(biāo)志，謂之的身份標(biāo)志，謂之分分子條形碼子條

50、形碼（molecular bar codes），分子條），分子條形碼可與基因芯片上的探針進(jìn)行雜交以便于形碼可與基因芯片上的探針進(jìn)行雜交以便于篩選。這樣，篩選。這樣，ORF的功能測(cè)試可通過一次雜的功能測(cè)試可通過一次雜交及用同一生長(zhǎng)選擇條件完成，大大提高了交及用同一生長(zhǎng)選擇條件完成，大大提高了效率和準(zhǔn)確性。效率和準(zhǔn)確性。84遺傳病相關(guān)基因的定位遺傳病相關(guān)基因的定位腫瘤疾病的診斷腫瘤疾病的診斷感染性疾病的診斷感染性疾病的診斷85隨著隨著HGP的發(fā)展，各種方法相繼創(chuàng)立，的發(fā)展，各種方法相繼創(chuàng)立，并應(yīng)用到基因定位中。并應(yīng)用到基因定位中。基因芯片技術(shù)已成為一種基因定位的高基因芯片技術(shù)已成為一種基因定位的高

51、效工具。效工具。配合使用多重配合使用多重PCR/基因芯片，可一次基因芯片，可一次篩查多種遺傳病，既經(jīng)濟(jì)又敏感可靠。篩查多種遺傳病，既經(jīng)濟(jì)又敏感可靠。86HIV-1基因組中的基因組中的rt與與pro在疾病過程中易發(fā)在疾病過程中易發(fā)生多種變異，從而導(dǎo)致對(duì)多種藥物的抗藥性，生多種變異，從而導(dǎo)致對(duì)多種藥物的抗藥性，因此，檢測(cè)和分析其變異性與多態(tài)性具有重因此，檢測(cè)和分析其變異性與多態(tài)性具有重要臨床意義。要臨床意義?？梢灶A(yù)測(cè)，在不久的將來，人們可望在一張可以預(yù)測(cè)，在不久的將來，人們可望在一張基因芯片上檢測(cè)幾乎所有的病原微生物基因。基因芯片上檢測(cè)幾乎所有的病原微生物基因。87通過確定重復(fù)基因的程度，基因芯片

52、已通過確定重復(fù)基因的程度，基因芯片已用來對(duì)基因組文庫(kù)進(jìn)行圖譜繪制。用來對(duì)基因組文庫(kù)進(jìn)行圖譜繪制?；蚍綆?kù)中的每個(gè)克隆的所有化學(xué)反應(yīng)基因方庫(kù)中的每個(gè)克隆的所有化學(xué)反應(yīng)均一個(gè)反應(yīng)管，可以快速平行地對(duì)多克均一個(gè)反應(yīng)管，可以快速平行地對(duì)多克隆進(jìn)行圖譜繪制。隆進(jìn)行圖譜繪制。每人每天可對(duì)幾百個(gè)克隆進(jìn)行基因圖譜每人每天可對(duì)幾百個(gè)克隆進(jìn)行基因圖譜繪制。繪制。88藥物篩選藥物篩選藥物作用機(jī)制研究藥物作用機(jī)制研究毒理學(xué)研究毒理學(xué)研究基因掃描基因掃描環(huán)境化學(xué)毒物的篩選環(huán)境化學(xué)毒物的篩選耐藥菌株和藥敏檢測(cè)耐藥菌株和藥敏檢測(cè)89 基因芯片上核酸探針的選擇和基因芯片上核酸探針的選擇和序列設(shè)計(jì)，以及基因芯片雜交序列設(shè)計(jì)，以及基因芯片雜交后信息的分析、處理和建庫(kù)。后信息的分析、處理和建庫(kù)。兩個(gè)方面的內(nèi)容：兩個(gè)方面的內(nèi)容：90 基因芯片所獲大量的基因及其基因相基因芯片所獲大量的基因及其基因相互作用信息，為生物信息學(xué)研究和生互作用信息，為生物信息學(xué)研究和生物數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘提供了高效、快速和物數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘提供了高效、快速和方便的實(shí)驗(yàn)工具，拓寬了生物信息學(xué)方便的實(shí)驗(yàn)工具，拓寬了生物信