重組PP150抗原用于膠體金免疫斑點(diǎn)技術(shù)檢測(cè)抗HCMV

1、重組PP150抗原用于膠體金免疫斑點(diǎn)技術(shù)檢測(cè)抗HCMV 作者：王清,王錫波,徐龍強(qiáng),于維林,于紅,張文卿【關(guān)鍵詞】 巨細(xì)胞病毒 Recombinant PP150 of human cytomegalovirus as antigene for colloidal gold immunodot assay to detect HCMVIgM in sera【Abstract】 AIM: To use recombinant pp150 of human cytomegalovirus (HCMV) in colloidal gold immunodot assay (CGIDA) for th

2、e detection of HCMVIgM in sera. METHODS: A fragment of gene coding for pp150 antigen epitopes (840-1048aa) was expressed in E. coli and the fusion protein was purified. The results were compared with those of specific antibodies ELISA IgM. RESULTS: Recombinant antigen CGIDA had a good agreement (96.

3、0%) with ELISA kit. The specificity of CGIDA was 100% and the sensitivity was 74.2%. CONCLUSION: Recombinant pp150 is an effective and valuable antigen used in CGIDA for detecting HCMVIgM.【Keywords】 cytomegalovirouses,human;gene pp150;prokaryotic expression; gold colloidal; immunodot assay【摘要】 目的: 探

4、索應(yīng)用重組人巨細(xì)胞病毒(HCMV)PP150抗原用于免疫滴金技術(shù)檢測(cè)血清中抗HCMVIgM的診斷價(jià)值. 方法: PCR擴(kuò)增HCMV pp150抗原決定簇（8401048aa）編碼基因片段，插入原核表探索應(yīng)用重組人巨細(xì)胞病毒(HCMV)PP150抗原用于膠體金免疫斑點(diǎn)技術(shù)（CGIDA）檢測(cè)血清中抗HCMVIgM的診斷價(jià)值. 達(dá)載體pMAlp2，轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli，誘導(dǎo)表達(dá)及純化. 重組抗原CGIDA與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒對(duì)比檢測(cè). 結(jié)果： 重組抗原CGIDA與ELISA試劑盒比較,符合率達(dá)96.0%；CGIDA檢測(cè)HCMVIgM的敏感度為74.2%，特異性為100%. 結(jié)論:

5、 重組抗原pp150用于 CGIDA對(duì)HCMV的早期診斷，具有較好應(yīng)用價(jià)值.【關(guān)鍵詞】 巨細(xì)胞病毒, 人；基因pp150;原核表達(dá)；膠體金;免疫斑點(diǎn)法0引言膠體金免疫斑點(diǎn)法(colloidal gold immunodot assay,CGIDA)快速簡(jiǎn)便，呂貫廷等1成功地建立了CGIDA檢測(cè)HCMVIgG的方法，但國(guó)內(nèi)關(guān)于抗人巨細(xì)胞病毒(HCMV)IgM的臨床檢測(cè)的報(bào)道較少. 我們用基因工程方法合成HCMV pp150（8411084aa）抗原,以膠體金為標(biāo)記手段,建立了檢測(cè)血清抗pp150 IgM抗體的膠體金免疫斑點(diǎn)法.1材料和方法1.1材料HCMV AD169毒種、宿主菌E.coli D

6、H5, 原核表達(dá)質(zhì)粒pMAlp2為山東省分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供. EcoR I, Hind, T4 DNA Ligase, Wizard PCR Preps DNA Purification System, Wizard Plus Minipreps DNA Prurification Systems, IPTG, 硝酸纖維素膜（孔徑0.65 m）等均購(gòu)自Promega公司. 麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)純化樹脂購(gòu)自BioRad公司. 抗人IgM及HCMVIgM ELISA試劑盒由山東省分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供. HCMV IgM陽(yáng)性血清120份經(jīng)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科研究室提供（晶美生物

7、工程有限公司人巨細(xì)胞病毒IgM ELISA試劑盒檢測(cè)）; 266份臨床血清采自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院正常孕婦. 正向引物： 5TGGCGAATTCACCTCTTCCGCTTCTTCGGC3，反向引物：5GTGTTAAGCTTCTATTCCTCCGTGTTCTT3，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為651 bp,產(chǎn)物上游酶切位點(diǎn)為EcoR1，下游酶切位點(diǎn)為Hind.1.2方法1.2.1重組pp150抗原的制備HCMV AD169株接種人胚肺二倍體細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)病變()后，收集細(xì)胞，提取總DNA作為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出HCMV pp150多個(gè)強(qiáng)抗原決定簇區(qū)目的基因. 分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I, Hind酶

8、切上述擴(kuò)增片段和質(zhì)粒pMALp2，回收酶切產(chǎn)物和載體片段，然后進(jìn)行連接反應(yīng). 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主菌E.coli DH5，挑取經(jīng)鑒定的單個(gè)菌落，37培養(yǎng)至A600 nm約為0.5. 加ITPG分別誘導(dǎo)1, 2, 3, 4, 5 h后收集菌體，在50 mmolL TrisHCl（pH 8.0）溶液中超聲波裂解（12 s/次，共3次），將沉淀溶于包涵體溶解緩沖液中(8 molL尿素，100 mmolL NaCl，1 mmolL EDTA，0.1 mmolL PMSF，50 mmolL TrisHCl，pH 80)，4, 6000 g離心10 min，回收上清. 每隔1 h用復(fù)性液(10 mmo

9、lL GSH， 2 mmol/L GSSG，50 mmolL TrisHCl，pH 80),將尿素濃度逐步降低到0.5 mmolL，4復(fù)性過(guò)夜，在透析液(50 mmolL TrisHCl，pH 8.0)中4充分?jǐn)嚢枞コＳ嗄蛩? 4, 6000 g離心10 min，取上清，復(fù)性蛋白15 mL (05 gL)上樣，用麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）純化樹脂純化（具體操作見(jiàn)說(shuō)明書）. 應(yīng)用150 g/L SDSPAGE檢測(cè)表達(dá)及純化情況.1.2.2CGIDA試劑盒的置備及檢測(cè)方法在300 mL雙蒸水中加入10 g/L枸櫞酸鈉4.5 mL，煮沸后迅速加入0.2 g/L氯金酸3.6 mL ，繼續(xù)煮沸1015

10、min，冷卻后用0.1 mol/L碳酸鉀調(diào)pH值至8.5；取已純化抗體作線性稀釋，每管加入制備好的膠體金溶液1 mL，靜置2 h,以保持紅色不變的最小量管為膠體金與待標(biāo)記蛋白的最適比例；取已純化的抗原多肽與水溶性碳化二亞胺活化過(guò)夜，用PBS透析1 d；以3 mL膠體金溶液為基準(zhǔn)，加入抗人IgM迅速混勻，15 min后加入10 g/L穩(wěn)定劑7.5 mL，混勻，以1000 g 10離心40 min，棄上清夜，沉淀重懸于等體積10 g/L穩(wěn)定劑(pH 7.27.4)中，1000 g 10離心30 min，棄上清液，沉淀用1/5體積恢復(fù)液恢復(fù). 用孔徑為0.65 m的硝酸纖維素膜制成1 cm直徑的方片

11、， PP150蛋白、HCMVIgM（陽(yáng)性對(duì)照）、PBS（陰性對(duì)照）3×3的點(diǎn)陣滴定后，將活化抗原稀釋至濃度為0.25 mg/L，直接滴加于載體膜上，室溫干燥后用10 mL/L牛血清白蛋白（BSA）封閉，再用10 mol/L PBS洗滌3次，干燥后于4中保存. 將已涼干的抗原膜片裝入塑料小盒中，盒內(nèi)充滿吸水材料；在膜盒的中央分別滴加血清標(biāo)本,人HCMVIgM, PBS各15 L，待滲入后用10 mol/L PBS洗滌3次，加入膠體金標(biāo)記抗人IgM,觀察結(jié)果，陽(yáng)性者在膜中央出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，陰性者則無(wú)紅色斑點(diǎn)形成. HCMVIgM ELISA的檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書操作. CGIDA檢測(cè)120份

12、HCMVIgM陽(yáng)性血清標(biāo)本，同時(shí)檢測(cè)100例單純皰疹病毒型IgM陽(yáng)性血清標(biāo)本. 免疫斑點(diǎn)檢測(cè)試劑在4下放置6 mo,每月檢測(cè)抗HCMVIgM陽(yáng)性及陰性血清各30份. 于37和4均放置1 wk,然后分別檢測(cè)陽(yáng)性和陰性血清各50例作穩(wěn)定性試驗(yàn).2結(jié)果2.1目的基因的PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為651 bp，其中目的基因?yàn)?24 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物兩端引入限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列、保護(hù)性堿基共27 bp. 核苷酸片段大小與預(yù)期值一致，陰性對(duì)照未增出特異性片段（Fig 1）.2.2原核重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定少量堿裂解法快速提取重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I及Hind雙酶切后電泳見(jiàn)2條帶,分別約為6.7 kb和624

13、 bp，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，證明重組克隆成功（Fig 2）.2.3SDSPAGE蛋白電泳及考馬斯亮藍(lán)染色鑒定重組蛋白的檢測(cè)分析菌體裂解液，表明誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物主要存在包涵體中. SDSPAGE蛋白電泳顯示pMAlP2PP150克隆全菌裂解物在Mr 64 000的位置出現(xiàn)一條蛋白條帶，而未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在相應(yīng)位置的無(wú)蛋白條帶；含質(zhì)粒pMAlP2的誘導(dǎo)菌則在Mr 43 000位置出現(xiàn)一條帶. 電泳結(jié)果與理論預(yù)測(cè)值相一致. 另外，從蛋白帶型來(lái)看，誘導(dǎo)5 h的融合蛋白表達(dá)量最高，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，融合蛋白含量占全菌體的10%. 純化的融合蛋白經(jīng)SDSPAGE及考馬斯亮藍(lán)染色后，融合蛋白Mr 64

14、000位置出現(xiàn)一清晰蛋白條帶，pMALp2轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)表達(dá)的MBP則出現(xiàn)于Mr 43 000位置.2.4重組蛋白的抗原性隨機(jī)挑選15份IgM陽(yáng)性患者血清進(jìn)行Western印跡檢測(cè)，其中12份與表達(dá)的融合蛋白有反應(yīng)，檢測(cè)的20份IgM陰性血清均為陰性，表明此融合蛋白識(shí)別IgM特異性抗體的識(shí)別率為80%. 陽(yáng)性血清與MBP無(wú)反應(yīng).2.5CGIDA檢測(cè)HCMV IgM純化重組抗原CGIDA檢測(cè)正常孕婦血清標(biāo)本266份，其中14份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為5.3%，與ELISA試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性率為6.0%比較，符合率為96.0% （Tab 1）.表1重組抗原CGIDA與ELISA檢測(cè)結(jié)果比較（略）2.6CGIDA檢測(cè)

15、HCMV IgM敏感性與特異性HCMV IgM陽(yáng)性血清標(biāo)本120份中，檢出陽(yáng)性標(biāo)本89例，同時(shí)檢測(cè)100例單純皰疹病毒型IgM陽(yáng)性血清標(biāo)本，結(jié)果均為陰性. 可見(jiàn)，重組抗原CGIDA檢測(cè)HCMV IgM方法的敏感性為74.2%，特異性為100%. 免疫斑點(diǎn)檢測(cè)試劑在4下放置6 mo,每月檢測(cè)抗HCMV IgM陽(yáng)性及陰性血清各30份,其特異性和敏感性非常穩(wěn)定. 于37和4均放置1 wk,然后分別檢測(cè)陽(yáng)性和陰性血清各50例,二者差異沒(méi)有顯著性.3討論血清特異性IgM檢測(cè)是診斷急性或活動(dòng)性HCMV感染的重要方法，但是由于迄今采用的抗原仍是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)獲得的全病毒抗原，而HCMV病毒本身含有與單純皰疹病

16、毒和細(xì)胞膜成份(mp60)等的交叉抗原,病毒雖經(jīng)純化也難以避免由于交叉抗原引起的非特異反應(yīng). 同時(shí)由于HCMV培養(yǎng)周期長(zhǎng)和病毒產(chǎn)量低等原因使HCMV純化困難較大. 我們克服了用感染的人胚肺二倍體細(xì)胞培養(yǎng)物制備全病毒抗原需嚴(yán)格的防護(hù)條件、產(chǎn)量有限、穩(wěn)定性欠佳、與其他皰疹病毒有交叉反應(yīng)等不利因素.DNA重組技術(shù)的發(fā)展使得大量選擇性地制備病毒抗原或抗原性片段成為可能，研究表明,將一種或幾種重組蛋白作為抗原即可檢測(cè)HCMV陽(yáng)性血清. Rolf等2用PCR方法擴(kuò)增HCMV 8種不同開放讀碼框架的DNA片段，并表達(dá)了相應(yīng)的重組蛋白，免疫印跡結(jié)果表明只有病毒蛋白的3種重組多肽對(duì)血清學(xué)診斷是必需的. PP15

17、0 的495691aa片段是確診HCMV既往感染的最適抗原（IgG結(jié)合表位）；而8621048aa片段（IgM結(jié)合表位）是急性感染的最佳血清學(xué)標(biāo)志物之一. 國(guó)內(nèi)周鐵群及王清等研究證實(shí),HCMV主要結(jié)構(gòu)蛋白PP150的羧基末端部分是HCMVIgM的重要結(jié)合表位，在檢測(cè)HCMV原發(fā)及急性期感染中起著極其重要的作用3，4.我們構(gòu)建了含有HCMV特異性強(qiáng)抗原決定簇片段的重組抗原（8411084aa）,用Westernblot檢測(cè)了15份HCMV IgM陽(yáng)性患者的血清，其中12份發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性識(shí)別率為80.0%. 目前國(guó)內(nèi)檢測(cè)血清抗HCMVIgM主要采用間接ELISA法，但該法檢測(cè)所需時(shí)間長(zhǎng)，操作步

18、驟繁瑣、易受類風(fēng)濕因子等的影響，所以結(jié)果不穩(wěn)定. CGIDA與酶聯(lián)免疫分析法比較5具有多方面的優(yōu)點(diǎn):不需要酶標(biāo)檢測(cè)儀等儀器,更適合現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用;實(shí)驗(yàn)結(jié)果和膠體金試紙可長(zhǎng)期保存;省去底物反應(yīng)這一步,加快了檢測(cè)速度;膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)時(shí)金顆粒與蛋白分子之間的結(jié)合屬于物理吸附過(guò)程,所以整個(gè)標(biāo)記過(guò)程對(duì)蛋白質(zhì)的生物活性影響很小,且易獲得較高的標(biāo)記率;膠體金不屬于生物活性物質(zhì),干擾檢測(cè)結(jié)果的因素將大大減少. 本研究比較了CGIDA與商品化ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果,符合率為96.0%，敏感性為74.2%，特異性100%，研究結(jié)果表明重組抗原pp150用于CGIDA對(duì)HCMV的早期診斷，具較好的應(yīng)用價(jià)值.【參考文獻(xiàn)

19、】1 呂貫廷，郭晏海，盧冰，等. 膠體金免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒pp150抗體J.臨床檢驗(yàn)雜志，2002；20（6）：358-359.Lü GT, Guo YH, Lu B, et al. Detection of IgM antibodies to HCMV PP150 by Coloidal Gold Immunodotting AssyJ. Chin J Clin Lab Sci, 2002;20（6）:358-359.2 Rolf V, Vornhagen R, Plachter B, et al. Early serodiagnosis acute human cytomegalovirus infection by enzymelinked immunosorbent assay using recombinant antigensJ. J Clin Microbio,1994;32(4):981-986