細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白1SIRT1活性比色法定量檢測(cè)試劑盒中文

1、細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白1 （ SIRT1 ）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒（中文版）主要用途細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白1 （SIRT1）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)比色探針對(duì)硝基苯胺標(biāo)記人工合成的乙?；痯53 多肽底物，經(jīng)過(guò)SIRT1 脫乙酰基后，被位點(diǎn)特異性氨基肽酶水解，釋放黃色對(duì)硝基苯胺，即采用比色法來(lái)測(cè)定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。 其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、核蛋白樣品、 部分或完全純化酶樣品中SIRT1的活性定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。技術(shù)背景人體組蛋白脫乙?；福?his

2、tone deacetylase；HDAC ）家屬分成三類共 20多個(gè)蛋白：種類 I（class I）與酵母Rpd3蛋白同源，包括 HDAC1 、2、3、 8，存在于細(xì)胞核中；種類 II （class II ）與酵母 Hda1蛋白同源，包括HDAC4 、5、6、7、 9a、 9b、10和HDRP/MITR ，存在于細(xì)胞核和細(xì)胞漿里；上述兩大種類的蛋白分子催化結(jié)構(gòu)域含有鋅，且曲古菌素A （ trichostatin A ； TSA ）敏感。種類 III （class III ）為 NAD +輔助因子必需，又稱為 sirtuins ，與酵母 Sir2（ Silent Information Reg

3、ulator 2 ）同源，包括 SIRT1至7等，為曲古菌素 A（ trichostatin A ；TSA ）不敏感型賴氨酸脫乙?；福?lysyl-deacetylase）。催化賴氨酸脫乙酰基反應(yīng)，以及由 NAD +和乙酰（ acetyl）基團(tuán)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的煙酰胺（ nicotinamide ）和 O-乙酰 ADP 核糖（ O-acetyl-ADP-ribose ）。SIRT1位于細(xì)胞核內(nèi)，與酵母 Sir2同源性最高。 其功能在于調(diào)節(jié) p53 活性和抑制細(xì)胞凋亡。 基于人工合成的乙?；?p53（ 379至382 氨基酸位點(diǎn)）多肽底物 Ac-Arg-His-Lys-Lys （Ac ）具有抗氨基肽酶

4、切離的功能，首先使用比色染料對(duì)硝基苯胺（ p- Nitroaniline ；p-NA ）來(lái)標(biāo)記乙酰化 p53多肽底物，其次進(jìn)行脫乙?；?，最后底物進(jìn)一步在氨基肽酶的催化酶解，釋放出具有強(qiáng)烈吸光值的黃色對(duì)硝基苯胺（波長(zhǎng)405nm），由此來(lái)定量測(cè)定沉默調(diào)節(jié)蛋白1的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：Sirt1Ac-Arg-His-Lys-Lys （Ac ）- p-NA+NAD Ac-Arg-His-Lys-Lys- p-NA+nicotinamide+O-acetyl-ADP-ribose氨基肽酶Ac-Arg-His-Lys-Lys- p-NAAc-Arg-His-Lys-Lys+p-NA產(chǎn)品內(nèi)容裂解液（ Reag

5、ent A）20 毫升分離液（ Reagent B）80 毫升清理液（ Reagent C）80 毫升萃取液（ Reagent D）5 毫升緩沖液（ Reagent E）3毫升底物液（ Reagent F）100微升終止液（ Reagent G）200微升酶解液（ Reagent H）200微升補(bǔ)充液（ Reagent I）500微升產(chǎn)品說(shuō)明書1 份保存方式保存緩沖液（Reagent E）、 底物液（Reagent F）、 終止液（Reagent G）和酶解液（Reagent H）在 20冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保證6 月用戶自備磷

6、酸鹽緩沖溶液（PBS）：用于清洗細(xì)胞樣品15 毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器1.5 毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育96 孔板或 100 微升厘米光徑比色皿：用于反應(yīng)和比色的容器酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于比色分析實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)開始前，將20冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。一、樣品準(zhǔn)備1 準(zhǔn)備好 75cm2 細(xì)胞培養(yǎng)瓶或 100mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1 至 5 X 107細(xì)胞）2 小心抽去培養(yǎng)液3 小心加入 10 毫升用戶自備的磷酸鹽緩沖溶液（PBS），覆蓋生長(zhǎng)表面4 小心抽去清理液5 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞

7、（注意：避免使用胰酶消化 ）6 加入 1 毫升 裂解液（ Reagent A），混勻細(xì)胞7 移入到預(yù)冷的 15毫升錐形離心管8 強(qiáng)力渦旋震蕩 10秒9 置于冰槽里孵育 15 分鐘10加入 4 毫升預(yù)冷的分離液（ Reagent B），混勻11放進(jìn) 4臺(tái)式離心機(jī)離心10 分鐘，速度為 1300g12小心抽去上清液13加入 4 毫升預(yù)冷的清理液（ Reagent C）14放進(jìn) 4臺(tái)式離心機(jī)離心10 分鐘，速度為 1300g15小心抽去上清液16小心加入 100 微升預(yù)冷的萃取液（ Reagent D），混勻17轉(zhuǎn)移到新的預(yù)冷的1.5 毫升離心管18超聲處理 30 秒19置于冰槽里孵育 30 分鐘2

8、0放進(jìn) 4微型臺(tái)式離心機(jī)離心10 分鐘，速度為16000g（或 13000RPM ，例如 EPPENDORF 5415 ）21小心移取上清液到新的預(yù)冷的1.5 毫升離心管22移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 HL 30030.1）23即刻放進(jìn) 70保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作二、 測(cè)定準(zhǔn)備1 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如核蛋白或純化酶樣品等），置于冰槽里2 設(shè)定好酶標(biāo)儀或分光光度儀（溫度為30）： 波長(zhǎng) 405nm，并置零3緩沖液（ Reagent E）置于室溫下均衡溫度三、活性測(cè)定（一）終點(diǎn)法活性測(cè)定1 在 96 孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景空對(duì)照和

9、待測(cè)樣品2 分別移取 55 微升緩沖液（ Reagent E）到相應(yīng)孔里3 分別加入 5 微升底物液（ Reagent F）4 分別加入 20 微升補(bǔ)充液（ Reagent I）或待測(cè)樣品（ 50 微克核蛋白或200 微克細(xì)胞裂解萃取液總蛋白）（注意： 樣品須清澈 ）5 輕輕搖動(dòng) 96 孔板 30 秒6 放進(jìn) 30培養(yǎng)箱里，孵育60 分鐘，避免光照7 分別加入 10 微升終止液（ Reagent G）8 分別加入 10 微升酶解液（ Reagent H ）9 輕輕搖動(dòng) 96 孔板 30 秒10在 30培養(yǎng)箱里，孵育30 分鐘11即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀或轉(zhuǎn)移到100 微升 1 厘米光徑比色皿，在分光光度

10、儀里檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)12活性計(jì)算：（1）酶標(biāo)儀檢測(cè)（樣品讀數(shù)背景讀數(shù)）X 樣品稀釋倍數(shù)摩爾吸光系數(shù)）X 1 （反應(yīng)時(shí)間；小時(shí)）毫升單位 /毫克X 0.10（體系容量；毫升）X 0.6（光徑距離；厘米） ÷0.02（樣品容量；毫升）X 10.5 （毫單位 /毫升 ÷（樣品蛋白濃度）毫克/單位微摩爾對(duì)硝基苯酚/小時(shí)（2）比色皿檢測(cè) （樣品讀數(shù)背景讀數(shù)）（毫摩爾吸光系數(shù)）X 1X 樣品稀釋倍數(shù)X 0.10（體系容量；毫升） ÷0.020 （樣品容量；毫升）X 10.5（反應(yīng)時(shí)間；小時(shí)） 單位 /毫升 ÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升單位 /毫克單位微摩爾對(duì)硝基苯

11、酚/小時(shí)（二）酶動(dòng)法活性測(cè)定1. 在 96 孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景空對(duì)照和待測(cè)樣品2 分別移取 65 微升緩沖液（ Reagent E）到相應(yīng)孔里3 分別加入 5 微升底物液（ Reagent F）4 分別加入 20 微升補(bǔ)充液（ Reagent I）或待測(cè)樣品（ 50 微克核蛋白或200 微克細(xì)胞裂解萃取液總蛋白）（注意： 樣品須清澈 ）5 輕輕搖動(dòng) 96 孔板 30 秒6 放進(jìn) 30培養(yǎng)箱里，孵育2 分鐘，避免光照7 分別加入 10 微升酶解液（ Reagent H ）8 輕輕搖動(dòng) 96 孔板 5 秒9 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀或轉(zhuǎn)移到100 微升1 厘米光徑比色皿，在分光光度儀里檢測(cè)：間隔5 分

12、鐘，讀數(shù)6 次（共 30 分鐘） 獲得吸光讀數(shù)10活性計(jì)算：（ 1）酶標(biāo)儀檢測(cè)（樣品讀數(shù)背景讀數(shù)）X 樣品稀釋倍數(shù)X 0.10（體系容量；毫升） ÷0.02（樣品容量；毫升）X 10.5 （毫摩爾吸光系數(shù)）X 30（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）毫升單位 /毫克X 0.6 （光徑距離；厘米）單位 /毫升 ÷（樣品蛋白濃度）毫克/單位微摩爾對(duì)硝基苯酚/分鐘（ 2）比色皿檢測(cè) （樣品讀數(shù)背景讀數(shù)）（毫摩爾吸光系數(shù)）X 30X 樣品稀釋倍數(shù)X 0.10（體系容量；毫升） ÷0.020 （樣品容量；毫升）X 10.5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘） 單位 /毫升 ÷（樣品蛋白濃度）毫克/ 毫升單位 / 毫克單位微摩爾對(duì)硝基苯酚/分鐘注意事項(xiàng)1 本產(chǎn)品為 20 次操作，包括背景對(duì)照2 操作時(shí)，須戴手套3 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1 次4 樣品須澄清，至關(guān)重要5 樣品處理時(shí)，避免使用蛋白酶抑制劑、PMSF 、烷基胺（ alkyl amine ）等6 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行比色測(cè)定7 濾波器可以使用波長(zhǎng)400nm 替代 405nm8 測(cè)定值由低到高變化；酶動(dòng)法測(cè)定可以持續(xù)60 分鐘9 測(cè)定值吸光讀數(shù)越高，表明酶活性越高10比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底11待測(cè)樣本為核蛋白樣品，其蛋白濃度為50 微克 /20 微升；待測(cè)樣本