乙肝表面抗原定量測定的方法學驗證分析

1、CHENGDU MEDICAL COLLEGE乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法學驗證姓名Z P學號0925400072班級09級醫(yī)學檢驗本科二班指導老師沈富兵二一三年四月乙肝表面抗原定量測定的方法學驗證作者：ZP (成都醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院09級醫(yī)學檢驗本科二班，610500)【摘要】目的用福州藍圖生物工程有限公司出品的乙肝表面抗原ELISA法定量分析試劑盒對乙肝表面抗原定量測定的方法進行驗證，以判斷是否能用于教學以及臨床分析。方法 運用ELLISA法定量測定乙肝表面抗原，應用試劑盒 HBsAg標準從濃度為8ng/ml的2倍稀釋的6個濃度梯度，根據 OD值繪制標準 曲線再計算相對回收率和板內

2、和板間精密度，通過資料數據綜合分析。結果 HBsAg線性較好，其準確度、精密度、LOD值均在正常范內。 結論 ELISA法定量檢測HBsAg能較準確、快速地反映體內乙肝病毒復 制情況，可以用于教學以及臨床分析。【關鍵詞】乙肝表面抗原方法學驗證標準曲線 精密度 ELLISA病毒性肝炎中乙型肝炎的危害較大，我國是病毒性乙型肝炎的高發(fā)流行區(qū)， 普通人群的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV感染率接近60%，約占世界 HBV!帶者的1/3。乙型肝炎病毒的病原體不僅具有傳染性，還可能導致發(fā)展成肝硬化，甚至肝癌，所以乙型肝炎病毒的早期、準確、定量檢測對乙型肝炎臨床診 斷、療效觀察及預防

3、具有重要的意義。酶免分析法HBV- EIA是 HBVS原和抗體最常用的檢測技術，其方法簡便、價廉，適合一般實驗室推廣，其中酶聯(lián)免疫吸附 技術(en zyme lin ked immuno sorbe nt assay, ELISA)目前應用最為廣泛，它常用聚苯乙烯為固相載體，使其與待測標本中的相應抗體或抗原結合，然后加酶標記的抗原或抗體，再加底物顯色，最后根據色澤深淺來推算待測抗原或抗體的含量。 此方法特異性高，有效測定范圍可達到 20500 ng/ml，且酶免疫法有標記的試劑 比較穩(wěn)定并且無放射線危害等優(yōu)點。我們采用對已知抗體濃度的樣品進行 ELISA的定量檢測，通過對其數據的分 析來驗證E

4、LISA法最乙肝表面抗原定量檢測的準確性和可靠性，以衡量其實用性。1材料與方法1.1材料1.1.1試劑盒乙肝表面抗原ELISA法定量分析試劑盒，福州藍圖生物工程有限公司出品。 1.1.2儀器及酶標板酶標儀：Bio-Rad 680;洗板機：Bio-Rad 1575;超純水系統(tǒng)：Millipore Elix ； 電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052):上海精宏實驗設備有限公司。1.1.3溶液配制0.01M pH7.4的PBS緩沖液：稱取 8g NaCI、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和 0.24g KH2PO4,溶于 800ml 蒸 餾水中，用HCI調節(jié)溶液的pH值至7.4,最后加蒸餾水

5、定容至1L即可。質控品：用PBS緩沖液將標準品配制成6、3、1.5ng/ml三個質控品，每質控品1ml。首先取450 d的8ng/ml的標準品到C1號EP管中再向其中加入150 d的PBS緩 沖液，即配制成了 6ng/ml的質控品，再取300pl C1號EP管內的溶液到C2號 EP管內，再向C2號管內加入300 pl的緩沖液混勻。即配制成了 3ng/ml的質控 品。接著取300 d C2號管內的液體到C3號EP管內，再加入300 d的緩沖液混 勻，即配制成了 1.5ng/ml的質控品。具體方法如下圖11.2檢測方法1.2.1標準曲線各濃度的配制用PBS緩沖液將標準品配制成 8、4、2、1、0.

6、5、0.25ng/ml。先取6個EP管分別標記為對應的濃度。取400 d標準品于標記為的EP管中，再取200 d號管內液體于 號管內再向 號管中加入200d的緩沖液混勻，即配制成了濃度為 4ng/ml的標準品。再從 號管內取200 d的液體到 號管內，接著取200 d的緩沖液到 號 管內混勻，即配制成了 2ng/ml的標準品。從 號管內取200 d的標準品到號管內，再向號管內加入200 d的緩沖液混勻，即配制成了 1ng/ml的標準品。用同樣的方法，配制好濃度分別為0.5ng/ml、0.25ng/ml.的標準品體積分別為200d、200d、400pl備用。具體方法如下圖 2圖21.2.2測定方

7、法取出試劑盒中已包被酶標板，取出板條，在相應孔中加入已配制好的系列標準品、質控品及空白對照；88631.5O44631.5O22631.5O11631.5O0.50.5631.5O0.250.25OOOOOOOOO圖3注：雙線框區(qū)域為標準品，濃度依次為8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml，三線框區(qū)域為質控品，濃度依次為 6、3、1.5ng/ml，粗框區(qū)域為空白對照加入的是 PBS緩沖液，每個孔內加入的均是 50 pl。37T溫育30min,洗板4次；加入酶標抗體，生物素二抗，50孔；37T溫育30min,洗板4次；加入A、B液，50孔，37C溫育15分鐘；加入終止液，50孔。1.3標準曲

8、線制作及結果計算酶標板放入酶標儀，蓋上蓋子；在電腦上打開 Microplate Manager 5.2軟件；選擇450nm波長（參照波長630nm）,設置LAYOUT和報告模式，測定 各孔吸收值；輸入標準品各濃度值，以雙對數法制備標準曲線，獲取各孔的濃度值，打 印標準曲線圖和計算結果。1.4統(tǒng)計學方法用Microsoft Excel處理實驗數據。2結果2.1測得的OD值如下表1.73901.63801.08500.69200.33800.01500.88400.88801.21700.67400.35300.00900.53600.50901.21800.65600.33800.01000.2

9、7200.26001.23300.67400.34700.00900.14900.13801.24800.69600.34300.01200.06200.07100.00900.01200.00200.00900.00900.01100.00900.01100.0100圖4注：圖4與圖3相對應2.2標準曲線1=濃度(ng/ml)圖5由上圖可得出如下結論：標準曲線以濃度為橫坐標，以測得的0D值為縱坐標。由對應濃度和0D值 得出的散點連成一條直線后，散點基本都在直線上，說明散點的線性非常好。在 以后檢測乙肝表面抗原濃度的時候可以根據測出的0D值在標準曲線上找出對應的濃度。2.3準確度（回收率）計算

10、各質控品高中低三個濃度平均回收率分別為92.59%、100.887%、93.68%都在正常范圍內如表1所示。ELISA法檢測 VEGFR2-F(的回收率準確度(回收 率)計算VEGFR2-FC(n g/ml)測定值(ng/ml)回收率(%)平均回收率RR(%)SD(%)64.99883.365.63793.9565.64294.03392.595.3065.71595.2565.78796.4533.093103.133.005100.16732.91897.267100.8872.6033.005100.16733.112103.7331.51.37791.81.51.45096.6671.

11、51.37791.893.682.071.51.42194.7331.51.40193.4表12.4精密度計算2.4.1板內精密度板內精密度質控品各濃度組的 RSD都小于15%,精密度良好，如表2所示板內精密度VEGFR2-FC測定值測定值測定值測定值測定值RSD(%)(ng/ml)12345本S64.9985.6375.6425.7155.7875.694 ±.3185.58533.0933.0052.9183.0053.1123.027 ± 0.0782.5771.51.3771.4501.3771.4211.4011.405 ± 0.0312.210表22.

12、4.2板間精密度板間各組濃度質控品RSD都小于15%，說明板間精密度達到標準。如表 3 所示。板間精密度VEGFR2-FC(ng/ml)測定值測定值測定值測定值測定值X _ SRSD(%)64.9985.6375.6425.7155.7875.694 ±.3185.58565.4715.4235.6745.3235.7465.5274 ± 0.1773.20265.7735.6745.7825.5475.6675.689 ± 0.0961.68733.0933.0052.9183.0053.1123.027 ± 0.0782.57732.8153.335

13、3.1873.2212.9333.098 ± 0.2166.97232.8863.3443.1183.2342.9973.116± 0.1825.8411.51.3771.4501.3771.4211.4011.405 ± 0.0312.2101.51.2261.2571.2271.5641.3341.322 ± 0.14210.7411.51.6651.2431.2361.5411.3201.401 ± 0.19213.704表32.5檢測限（LOD）計算：取空白孔的0D值的均數加2倍標準差?？瞻卓椎?D值的均數=0.0098空白孔的OD值的

14、標準差=0.0028L0D=0.0098+2*0.0028=0.01543討論通過圖4、圖5和表1、表2、表3可知本次實驗的準確度、板內精密度、 板間精密度、LOD值都復合實際，且各數據都趨于理想，對此我們做出分析：HBsAg是乙肝病毒感染后最早出現的血清標志物之一，因此HBsAg的檢測是診斷肝炎病毒感染的重要依據。而針對這項檢測的檢測方法的靈敏度與高特異性 的高低以及二者的結合程度是影響檢驗結果的重要因素，直接關系到臨床診斷和用藥，所以對HBsAg的檢測方法的建立和方法的驗證是實驗成敗的關鍵所在。本實驗以HBsAg測定為例，為了對乙肝表面抗原ELISA法定量進行分析的 方法學建立與驗證，以確

15、認ELISA法定量檢測HBsAg能否較準確、快速地反映 體內乙肝病毒復制情況。按試劑說明書嚴格操作的同時做標準曲線。本實驗用的試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ ELISA ）。往預先包被人乙肝病毒 表面抗原（HBsAg）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫浴并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的 催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。 顏色的深淺和樣品中的 人乙肝病毒表面抗原（HBsAg）呈正相關。用酶標儀在 450nm波長下測定吸光 度（0D值），計算樣品濃度。本實驗嚴格按試劑說明書操作的同時運用計算機 軟件和酶標儀，測得了

16、 0D值且繪制出了標準曲線。本實驗采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），通過倍比稀釋來完成其定量檢測。其中，標準品的濃度依次為：8 4、2、1、0.5、0.25ng/ml，每個濃度設置兩個孔，共十二個孔；質控品的濃度依次為：6、3、1.5ng/ml，每個濃度設置五個孔，共十五個孔。往標準品、質控品依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，而陰性對照加入等量 PBS,經過溫浴并徹底洗滌。用底物 TMB 顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的 黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算質控品的準確度、 板內精密度、板間精密度、LOD值。本

17、實驗是設計精密，操作簡便、快捷。主要是通過對質控品的準確度、板內 精密度、板間精密度、LOD值的計算和根據標準品的 OD值得出的標準曲線， 以確認ELISA法定量檢測HBsAg能否較準確、快速地反映體內乙肝病毒復制情 況。如圖5所示，標準曲線相關系數為0.9985,接近于1，即相關性良好。方法 準確度（accuracy），一般用相對回收率表示，表明用該方法測得的生物樣品中待 測藥物的濃度與其真實濃度的接近程度，由表1可得出相對回收率符合參考值85%115%，所以該測定方法比較準確。方法精密度（precision），般用RSD表示，對于ng/ml級水平的RSD 一般 應W1%。由表2板內精密度和

18、表3板間精密度可知，板內精密度完全符合要求， 板間精密度基本符合要求。檢測限LOD，又稱方法的靈敏度，由計算得LOD=0.0154，說明本分析方法 對于低濃度樣品的檢測靈敏度高。根據流行病學調查，我國人群乙型病毒肝炎感染率達 10%左右，乙肝的實驗 診斷對于其治療及預防有重要參考意義。ELLISA適用于乙肝表面抗原的定量測 定，其優(yōu)點是快速、方便、操作簡單，且靈敏度相對于其他方法較高，自20世紀 70年代以來，許多高靈敏度的測定方法應用于臨床免疫學檢測，特別是酶聯(lián)免疫法（ELLISA法）應用最廣，其解決了低濃度HBsAg的定量檢測問題,能夠及時 有效的測定出乙肝表面抗原含量，對臨床診斷和用藥提供有力的依據。綜上所述，通過實驗對HBsAg的準確度、板內精密度、板間精密度、 LOD 值的評價和分析，證實該定量檢測方法，具有高靈敏度和高特異性，能夠滿足臨 床檢測和教學的要求。參考文獻1 李金明，王露楠，徐錫霞，等室內質量控制對乙型肝炎表面抗原準確的影響J 中華檢驗醫(yī)學雜志，2001，24(4) : 255 2 施紀文，徐簡華，溫惠萍.ELISA法和膠體金免疫層析法檢測乙肝表面抗原的比較J.現代檢驗醫(yī)學雜志，2005，20 (5): 49.3 章敏，萬唐，彭慧中，等前S2、前S1