shRNA干擾VEGF表達對白血病細胞多藥耐藥的影響

1、shRNA干擾VEGF表達對白血病細胞多藥耐藥的影響 作者：方莉莉， 許文林， 陳琛， 房新建， 陳巧云， 李娟【摘要】 目的： 探討血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）與人白血病耐藥細胞株K562/A02細胞多藥耐藥的關(guān)系及其機制。方法： 針對VEGF基因設(shè)計合成3條干擾片段shRNA1，2，3，采用脂質(zhì)體2000分別將其轉(zhuǎn)染入K562/A02細胞，RTPCR法檢測VEGF和多藥耐藥相關(guān)基因MDR1，MRP1，topo，GST的mRNA水平；蛋白質(zhì)印跡法檢測VEGF蛋白水平；MTT法檢測各組細胞對多柔比星的半數(shù)抑制濃度（IC50值）。結(jié)果： K562/A02細胞VEGF mRNA表達水平顯著高于

2、敏感株K562細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），且VEGF蛋白水平也顯著高于K562細胞；轉(zhuǎn)染shRNA后，K562/A02細胞中VEGF mRNA水平出現(xiàn)不同程度下調(diào)，其中shRNA2組和shRNA3組與轉(zhuǎn)染隨機片段組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），以shRNA3組下調(diào)最顯著，并且VEGF蛋白水平也出現(xiàn)相應(yīng)的下調(diào)；轉(zhuǎn)染48 h后K562/A02細胞中MDR1，MRP1及topo的mRNA水平均出現(xiàn)不同程度下調(diào)，以shRNA3組下調(diào)最顯著，分別下調(diào)（39.7±1.21），（29.1±0.97），（28.2±1.04），GST

3、基因表達則無明顯變化；陽性轉(zhuǎn)染組細胞對多柔比星的敏感性明顯增加，其中以shRNA3組最顯著。結(jié)論： VEGF shRNA可以抑制K562/A02細胞VEGF基因與蛋白的表達，不同干擾片段的沉默效果不同，并增強K562/A02細胞對多柔比星的敏感性，其機制可能與MDR1，MRP1及topo 2 / 22的表達下調(diào)有一定的關(guān)系。 【關(guān)鍵詞】 血管內(nèi)皮生長因子； RNA干擾； K562/A02細胞； 多藥耐藥 Abstract Objective: To study the relationship between vascular endothelial growth factor(VEGF) a

4、nd multidrug resistance of human leukemia cell line K562/A02 by RNA interference, and then the mechanism was explored.Methods： The VEGF shRNA chain1,2 and 3 were designed,synthesized, then transfected into K562/A02 cells line by lipofectamine 2000 reagent.RTPCR was used to detect the expression of V

5、EGF and MDRrelating genes MDR1,MRP1,topo,GST in mRNA level; Western blotting was used to analyzed the expression of VEGF in protein level; MTT was used to determine the IC50 of transfectional cells to doxorubicin. Results： Compared to K562 cell,the expression of VEGF in K562/A02 cell was even more(P

6、<0.01),and after VEGF shRNAs were transfected into K562/A02 cells,the expression of VEGF at the mRNA level were decreased,and there were statistical difference between VEGF shRNA2 group or VEGF shRNA3 group and HK group(P<0.05),the greatest decrease was seen in cells transfected with V

7、EGF shRNA3;and the protein level of VEGF were also downregulated. The MDR1,MRP1,topo mRNA of K562/A02 cell were significantly decreased; the greatest decrease was seen in VEGF shRNA3 group. The IC50 value of positively transfected group were lower than that of control groups. Conclusion： After silen

8、ce of VEGF by shRNA,the mRNA expression of MDRassociated genes such as MDR1,MRP1 and topo in K562/A02 cells were downregulated,and the sensitivity of K562/A02 cell to doxorubicin were increased. Key words vascular endothelial growth factor; RNA interference; K562/A02 cells; multidrug resistance 多藥耐藥

9、（MDR）目前仍是急性白血?。ˋL）治療的主要障礙，盡管新的化療藥物和化療方案不斷涌現(xiàn)，但仍有部分患者因化療耐藥而導(dǎo)致治療失敗。白血病細胞的耐藥往往同時存在數(shù)種耐藥機制，MDR1，MRP1等耐藥相關(guān)基因的高度表達是白血病產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因之一。血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）作為最重要的促血管生成因子之一，在腫瘤增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。最近的研究表明1，在急性白血病初診、緩解、難治/復(fù)發(fā)各組骨髓及外周血中，VEGF水平均高于正常對照組，特別是在難治/復(fù)發(fā)性AL患者中，VEGF的表達水平最高，表明VEGF水平的變化和白血病病情、預(yù)后密切相關(guān)。因此，我們采用RNA干擾技術(shù)阻斷白血病細胞

10、株K562/A02細胞中VEGF的自分泌作用，觀察細胞對藥物敏感性的變化，并針對VEGF影響K562/A02細胞多藥耐藥的作用機理進行初步探討。 1 材料與方法 1.1 材 料 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin2000，Trizol試劑、胞核/胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、DAB顯色試劑盒、RPMI1640培養(yǎng)液及無血清無抗生素OPTIMEMI培養(yǎng)液購自Invitrogen公司，RTPCR相關(guān)試劑購自Fermentas公司，VEGFA鼠單克隆抗體購自Ebioscience公司，VEGF shRNA1，2，3及通用陰性對照HK由武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司合成。人慢性粒細胞性白血病細胞系K562細胞購自中科院

11、上海細胞庫，K562/A02細胞購自南京凱基生物有限公司。 1.2 VEGF shRNA1，2，3的合成 以人VEGF mRNA序列(NM_001025366，NM_001025367，NM_001025368，NM_001025369，NM_001025370，NM_001033756、NM_003376)同源CDS序列設(shè)計shRNA雙鏈，本研究選取的VEGF mRNA的靶位點分別是：shRNA1（636654）：5GGCGTCGCACTGAAACTTT3，shRNA2（13521370）：5GCGGATCAAACCTCACCAA3，shRNA3（14141432）：5GTGAATGCAGA

12、CCAAAGAA3。 1.3 VEGF shRNA的轉(zhuǎn)染 參照LipofectamineTM 2000 Reagent說明書，取停藥2周的K562/A02細胞，無菌PBS洗1次，接種于培養(yǎng)瓶，每瓶接種細胞106，共設(shè)5組：分別為K562/A02（未轉(zhuǎn)染組）、HK組（轉(zhuǎn)染隨機片段組）、shRNA1組、shRNA2組和shRNA3組，其中HK組和K562/A02為對照組，轉(zhuǎn)染shRNA質(zhì)粒的細胞為3個陽性轉(zhuǎn)染組。配制A液：6.0 g shRNA溶于200 l RPMI1640培養(yǎng)液；配制B液：20 l Lipofectamine溶于200 l RPMI1640培養(yǎng)液。將A，B兩液混合，室溫下靜置3

13、0 min后加入待轉(zhuǎn)染細胞中。37，5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)6 24 h，棄去培養(yǎng)液，換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。 1.4 RTPCR檢測VEGF及相關(guān)基因的表達 于轉(zhuǎn)染24 h，48 h后分別收獲細胞，PBS洗滌3次，用Trizol Reagent提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄條件參照AMV酶說明書合成cDNA，取等量cDNA分別以各自引物測定各組細胞中相關(guān)基因actin，VEGF，MDR1，MRP1，topo，GST(引物序列見表1)的表達量，擴增產(chǎn)物在含0.5 mg/L溴乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳分離，于凝膠成像儀上掃描定量，以actin作為內(nèi)參照進行質(zhì)控和標化。表1 相關(guān)基因PCR引物1.5

14、蛋白質(zhì)印跡法檢測VEGF蛋白的表達 于轉(zhuǎn)染48 h后收獲細胞，PBS洗滌3次，按胞核/胞質(zhì)蛋白提取試劑盒說明書提取胞質(zhì)蛋白，行BCA蛋白制作標準曲線后定量，取50 g總蛋白加適量上樣緩沖液100煮沸5 min變性，12%SDSPAGE電泳，1 mA/cm2恒流半干轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉室溫搖床封閉1 h，以GAPDH（13 000）作內(nèi)參照，鼠抗人VEGF抗體（1500），4過夜，洗滌液洗膜3次，10 min/次，山羊抗鼠二抗（12 000）室溫孵育1 h，洗膜同上，DAB顯色，拍照。 1.6 MTT法檢測細胞對多柔比星的IC50值 分別取轉(zhuǎn)染24 h，48 h后的上述5組細胞各以105/ml接

15、種于96孔板上，2×104/孔，各取4個復(fù)孔，加入不同濃度的多柔比星，培養(yǎng)48 h后加MTT 20 l/孔，37，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育46 h，棄去上清液，加DMSO 200 l/孔，振蕩20 min，使紫色結(jié)晶溶解，在490 nm波長的酶標免疫測定儀上檢測各組的光密度值，然后采用IC50值計算軟件分別計算各組細胞的IC50值，相對逆轉(zhuǎn)率=（對照組IC50-處理組IC50）對照組IC50。實驗重復(fù)4次。 1.7 統(tǒng)計分析 計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，兩組資料比較采用t檢驗，P<0.

16、05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 2 結(jié) 果 2.1 K562細胞和K562/A02細胞VEGF的差異性表達 PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)：K562和K562/A02細胞中VEGF mRNA與actin的灰度比值分別為0.518±0.047，0.814±0.124，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖1a；蛋白質(zhì)印跡結(jié)果也顯示：以GAPDH為內(nèi)參，K562/A02細胞VEGF蛋白表達明顯高于K562細胞，見圖1b。 2.2 shRNA轉(zhuǎn)染后K562/A02細胞VEGF mRNA的表達 RTPCR分別檢測轉(zhuǎn)染24 h,48 h及72 h后5組細胞VEGF mRNA的表達，見圖2。5

17、組待測樣本的cDNA均可擴增出強度基本一致的actin的特異性產(chǎn)物，可用于靶基因表達分析。轉(zhuǎn)染shRNA后，K562/A02細胞中VEGF mRNA水平出現(xiàn)不同程度下調(diào)，其中shRNA2組和shRNA3組與HK組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。轉(zhuǎn)染24 h,48 h,72 h后shRNA3對VEGF mRNA的抑制率分別為（29.6±1.1）%,（45.9±1.6）%和（43.2±1.5）%。 2.3 shRNA轉(zhuǎn)染后K562/A02細胞VEGF蛋白的表達 蛋白質(zhì)印跡法檢測5組細胞VEGF蛋白的表達，可見40 kD左右有一條特異條帶，為目的蛋白條帶，以GAPDH為內(nèi)參照，

18、轉(zhuǎn)染組與HK組比較，shRNA1組、shRNA2組VEGF蛋白表達量略有下降，shRNA3組VEGF蛋白表達明顯下調(diào)（圖3）。 2.4 shRNA轉(zhuǎn)染后K562/A02細胞耐藥相關(guān)基因的表達 見圖4。5個待測樣本的cDNA均可擴增出強度基本一致的actin的特異性產(chǎn)物，可用于靶基因表達分析。轉(zhuǎn)染shRNA后的K562/A02細胞MDR1,MRP1,topo表達均出現(xiàn)不同程度下調(diào)，以shRNA3組下調(diào)最明顯，與HK組相比，分別下調(diào)（39.7±1.21）,（29.1±0.97）,（28.2±1.04），GST表達無顯著變化。 2.5 shRNA轉(zhuǎn)染后K562/A02細

19、胞的藥物敏感性 見表2。轉(zhuǎn)染shRNA1,shRNA2及shRNA3的3 組細胞對多柔比星的IC50值均低于隨機對照HK組，其中以shRNA3組下降最為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；未轉(zhuǎn)染組與HK組細胞對多柔比星的IC50值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 3 討 論 RNA干擾(RNA interference，RNAi)具有高效催化、強特異性、毒性低等優(yōu)勢，較其他反義技術(shù)能更有效下調(diào)胞質(zhì)mRNA表達。體外合成的小分子干擾RNA(small interfenring RNA，siRNA)制備成本高，不穩(wěn)定且易降解，在細胞內(nèi)有效時間短，而短發(fā)夾RNA(short hairpin RN

20、A，shRNA)相對較穩(wěn)定，有效維持時間更長，為RNAi技術(shù)的應(yīng)用提供了更好的方法。人VEGF基因由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成，第15外顯子編碼的部分是VEGF的核心區(qū)域,用于維持二聚體空間結(jié)構(gòu)的8個特征性的半胱氨酸殘基就處于這個核心部分。因此，本課題設(shè)計3個shRNA干擾片段分別針對VEGF基因第25外顯子，采用瞬時轉(zhuǎn)染法分別導(dǎo)入K562/A02細胞。結(jié)果顯示，3個shRNA干擾片段對VEGF的抑制作用不同，其中shRNA3的干擾作用最顯著，VEGF蛋白的表達情況與基因變化基本一致。說明shRNA的導(dǎo)入可以抑制耐藥白血病細胞VEGF mRNA和蛋白的表達。 研究表明，腫瘤患者血清中VEGF含

21、量的高低與疾病的預(yù)后密切相關(guān)。肺癌患者血清中VEGF的含量越高，疾病分期越晚，療效越差，預(yù)后不佳2。慢性髓細胞白血病急變期的細胞中VEGF的表達量明顯高于慢性期，細胞VEGF的表達量與療效及預(yù)后呈負相關(guān)3。Avramis等4的研究顯示VEGF可增強白血病細胞對紫杉醇和長春新堿的抵抗，抑制VEGF可提高白血病細胞對化療藥物的敏感性。Kautoh等5發(fā)現(xiàn)用VEGF處理的CMK86細胞系對化療藥物依托泊苷或多柔比星有明顯的抵抗效應(yīng)。由此可見，腫瘤細胞VEGF的表達量可能與腫瘤多藥耐藥有一定的相關(guān)性。我們的研究結(jié)果顯示K562/A02細胞VEGF的表達水平明顯高于K562細胞，并且VEGF shRNA

22、可以增加K562/A02細胞對多柔比星的敏感性。 目前已證實的白血病耐藥機制包括：轉(zhuǎn)運誘導(dǎo)的耐藥，如Pgp、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）、肺耐藥相關(guān)蛋白（LRP）和乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）等使化療藥物排出增加。凋亡誘導(dǎo)的耐藥，如拓撲異構(gòu)酶（topo）通過改變受損的DNA的拓撲結(jié)構(gòu)，利于受損的DNA的修復(fù)，而導(dǎo)致耐藥。代謝誘導(dǎo)的耐藥，如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶使藥物失活增加。藥物靶點誘導(dǎo)的耐藥。在治療耐藥的乳腺癌時，同時應(yīng)用抗VEGF受體的單抗，阻斷VEGF的自分泌作用后，能明顯增強化療的效果，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞Pgp介導(dǎo)的耐藥性6。Zhang等7觀察VEGF165在內(nèi)皮細胞對抗癌藥物的敏感性方面的作用時，結(jié)果

23、發(fā)現(xiàn)，VEGF165介導(dǎo)的HDMEC多藥耐藥表型對多種藥物耐受，部分歸因于LRP和MRP的上調(diào)。沈慧玲等8發(fā)現(xiàn)抗VEGF抗體能明顯抑制白血病細胞topo的表達，細胞酶活性下降，促進DNA斷裂，并且呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系，表明VEGF抑制腫瘤細胞凋亡的機制和上調(diào)細胞topo表達密切相關(guān)。由我們的研究結(jié)果可初步推斷，VEGF shRNA增加耐藥白血病細胞對多柔比星的敏感性可能與下調(diào)MDR1,MRP1及topo等基因的表達有關(guān)，但具體的作用機理還有待進一步研究。VEGF可以通過自分泌途徑作用于腫瘤細胞表面受體使之發(fā)生磷酸化作用，進而激發(fā)胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生一系列磷酸化反應(yīng)，如PI3K/AKT,MAPK/ERK

24、,Ras GTP酶活化蛋白等活化，從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。然而有報道表明抑制PI3K/AKT通路的活化可以抑制白血病細胞中MDR1,MRP1基因的表達9,10。另有報道發(fā)現(xiàn)抑制ERK的磷酸化能夠抑制MDR1,topo的表達11,12。因此，我們推測VEGF shRNA可能通過抑制PI3K/AKT或MAPK/ERK信號通路的活化來影響耐藥相關(guān)基因的表達。 因此，我們認為VEGF作為腫瘤血管新生的關(guān)鍵因子之一，不僅通過刺激血管內(nèi)皮細胞的生長而促進造血系統(tǒng)腫瘤的增殖，而且可能通過其旁分泌或自分泌途徑，在一定程度上賦予白血病細胞對化療藥物耐藥的能力。利用RNA干擾技術(shù)阻斷VEGF的表達，為有效逆轉(zhuǎn)白血病多

25、藥耐藥提供新的方向，也為臨床成功治療白血病提供新的策略。【參考文獻】 1 周光紀,馬 麗,何紅華.急性白血病患者VEGF水平測定及意義探討J.實用預(yù)防醫(yī)學(xué),2007,14(1):19-21.2 Park SH,Lee SS.The relationship between serum VEGF concentration and prognosis of lung cancerJ.Korean J Intern Med,2003,18(4):207-211.3 Verstovsek S,Kantarjian H,Manshouri T,et al.Prognostic significance

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