中科大FPLC使用參考

1、FPLC使用指南From : USTC | Date : 2016-12-01簡介(INTRODUCTIONFPLC全稱為快速蛋白液相色譜 (Fast protein liquid chromatography )，其原理與高效液相色譜理論類似，是由經(jīng)典的液體柱層析引入氣相色譜理論，并且對相 體進行了改革，配用高壓輸液泵，采用高靈敏檢測器、梯度洗脫裝置、自動收 集裝置和微機等發(fā)展起來的現(xiàn)代液相色譜。我們實驗室有兩套純化儀，一臺是AKTA prime plus(著重介紹)，另外一臺是 AKTA pure protein(簡單介紹)。AKTA Pure 純化系統(tǒng)(詳見 AKTA Pure onsi

2、te-training)AKTA Prime Plus 純化系統(tǒng)?安全(Safety)?組件(Components)?方法編程(Method programming)?使用方法(Usage)?維護注意事項(Maintenance)安全(Safety)1. 警告！系統(tǒng)必須與接地電源插座連接。2. 警告！用戶不能打開系統(tǒng)，因為系統(tǒng)含高壓電路，會造成致命的電擊。3. 警告！必須總有上樣環(huán)連接在上樣閥的接口2和6。這是為了在轉(zhuǎn)換此閥時防止液體從這些接口噴出。尤其是使用危險化學品時，這是特 別危險的。4. 警告！如果有大量溢出的液體滲入系統(tǒng)外殼并同帶電部件接觸的危險，應立即關(guān)閉系統(tǒng)并同指定的技術(shù)服務人員

3、聯(lián)系。5. 警告！ NaOH有害健康，應避免泄漏。組件(Components)AKTA prime plus蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)包括下列部件：1. 緩沖液閥和梯度轉(zhuǎn)換閥 (Buffer valve and gradie nt switch valve) 緩沖液閥用于 選擇使用緩沖溶液，用于系統(tǒng)泵施加大的樣品體積。梯度轉(zhuǎn)換閥用于建立梯度。2. 系統(tǒng)泵(System pump)：系統(tǒng)泵用于經(jīng)系統(tǒng)運送液體，如樣品或緩沖溶液。將液體經(jīng)緩沖液閥、梯度轉(zhuǎn)換閥或經(jīng)上樣閥進入流動通道。3. 壓力傳感器(Pressure sensor)壓力傳感器可以測量在位液體壓力。還可用作 壓力保護裝置。4. 混合器(Mixer)

4、:混合器用于混合兩元梯度。以兩步將溶液混合以得到最適宜 的結(jié)果?；旌掀鞯捏w積可以選擇。5. 上樣閥(Injection valve)：上樣閥用于裝加樣環(huán)和用于將樣品注射到柱上。6. 檢測器(Monitor):檢測器的目的是測量流出柱后液體的UV吸收、電導率和pH (任選)。用于這些測量的流動池安裝在系統(tǒng)的右側(cè)。7. 具有分流閥的分部收集器 (Fraction collector with flow diversion valve):分部收集器用于將樣品組分收集在管中供進一步分析。分流閥在廢液和收集管之間轉(zhuǎn)換 流向。? 方法編程(Method programming)主菜單概要該菜單出現(xiàn)在自檢后

5、啟動時，用于運行予制的應用Template模板和法模板。Run stored Method用于運行用戶編輯的運行方法Man ual Run用于不使用方法，手工運行系統(tǒng)。Program Method用于編輯用戶專用方法。用于對檢測紫外(UV)、電導、pH、溫度、和運轉(zhuǎn)泵Set Parameters及混合器設置參數(shù)。用于檢測系統(tǒng)內(nèi)部參數(shù)，例如序列號、泵運行時間、Check和燈亮度。使用方法（Usage）利用AKTA Prime Plus洗脫鎳柱中的蛋白（以5 mL鎳柱為例）1. 打開AKTA （機器背部左下角），將 A泵和B泵用蒸餾水沖洗干凈分別插入到 Ni-binding buffer 和 El

6、ution buffer 中 ，并在 Template 中選擇 system wash, 洗泵（大概五分鐘）。2. system wash完畢后，先選擇 manual run，%B=Q pressure limitation= MPa，流速=1 ml/min。先將Ni柱底部接到探測器上，再將1號接線口接到鎳柱上 端（這樣可以防止綠色線管扭曲），觀察電腦屏幕待 UV線、電導線平齊時End program。3. 設定程序：流速 3 ml/min， limit pressure 為 MPa設定 breakpoint:0 ml： %B=4, set fraction size=020 ml:開始拉梯度

7、，%B=4 開始收集樣品，set fraction size 3 ml/tube80 ml： %B=60 同時也一直在收集樣品，set fraction size 3 ml/tube100 ml： %B=60（有時有些蛋白量很大或者延時出來，可以設這個程序，以防萬一），set fraction size 3 ml/tubeEnd4. 蛋白純化結(jié)束后，要清洗 AKTA泵內(nèi)部溶液，方便下位同學使用，將 A泵和B泵用蒸餾水沖洗干凈插入到蒸餾水中，并在Template中選擇systemwash,洗A、B泵。用蒸餾水清洗完畢后如果長期不用機器，需要用20%酒精再次清洗系統(tǒng)泵。并將收集器上的玻璃管收拾干凈

8、，并用水清洗，放于管架晾干。（總之，意思就是：0 ml時所有的系統(tǒng)全部要求置零，0-20 ml區(qū)間跑4% elutionbuffer把雜蛋白洗下來。20-80 ml區(qū)間設定elution buffer的濃度從4%慢慢升 到60%同時收集樣品，80-100 ml區(qū)間用60%把剩余蛋白全部洗脫下來并收集 樣品，到達100 ml時停止。）5. 蛋白質(zhì)純化圖譜的保存與提?。?）保存：在電腦桌面打開 prime view evaluation軟件，打來文件夾，在里面按照時間順序找到你蛋白質(zhì)純化圖譜， 然后點擊file，選擇save as將你的圖保存在你的文件夾。（2）提?。狐c擊file,選擇 expor

9、t curves 選擇 01: UV 和 06： Cone并在 Reduce numberof samples中選擇Reduce by 1。點擊保存，得到excel表格，并用 Graphpad prism5做蛋白純化圖譜。關(guān)鍵步驟：1. 提前看好轉(zhuǎn)盤與滴液體的部分是否靠緊，否則不會自動收集樣品。2. 根據(jù)出來的峰對應的離心管取下來放在冰上，取60卩至ml Ep管，暫放在冰上，用于制備SDS-PAG樣品。3. 根據(jù)峰的位置選擇樣品，一般會有 30 ml左右，加入1 mM EDTA和 2 mMDTT以及 PMSF,下面的 gel filtration 可以用 super loop 上樣。4. 萬一

10、電腦顯示器上不更新圖譜了，可能是與電腦的連接斷了，需要關(guān)了純 化儀，重啟。5. 樣品收集器偶爾會出現(xiàn)跳管子的情況，受樣品是要注意從頭或從尾對一下管子。跑其他柱子也是一 樣。6. 不要用蠻力擺動輸送臂。松開固定輸送臂按紐,并將臂升高。（如圖示）7. 及時清理廢液。（尤其過夜純化蛋白時，要檢查廢液是否裝滿）利用AKTA Prime Plus過分子篩1. 打開AKTA將A泵用蒸餾水沖洗干凈插入到gel filtration buffer中，并在Template 中選擇 system wash,洗泵（大概五分鐘）。并用 gel filtration buffer 手動或者程序設定清洗上樣環(huán)。2. sy

11、stem wash完畢后，先選擇 manual run，%B=0 pressure limitation= MPa，流速=2 ml/min（根據(jù)不同分子篩設定流速）。先將AKTA上 1號接線口濕接上部 分子篩，此時觀察柱子管道是否有氣泡，如果有氣泡那么應該將1號接口線濕接到分子篩尾部接口，待分子篩頭部管道空氣排清后再正過來接柱子，最 后將柱子尾部接口接到探測器上。觀察電腦屏幕待UV線、電導線平齊時Endprogram。3. Super loop接上，6號出口線接super loop上面，下面出來接上 2號口。4. 設定程序（以30 ml樣品和320 ml分子篩為例）：流速：2 ml/min，限

12、壓：MPa，A 為 gel filtration buffer，全程 %B=00 ml： inject30 ml： load100 ml： load，set fraction size=8 ml/tube （此處的 break point 體積以各自的蛋白大小而定）400 ml： load，set fraction size=0End5. 蛋白純化結(jié)束后，要清洗 AKTA泵內(nèi)部溶液，方便下位同學使用，將 A泵用蒸餾水沖洗干凈插入到蒸餾水中，并在Template中選擇system wash,洗泵。6. 蛋白質(zhì)純化圖譜的保存與提取（1 ）保存：在電腦桌面打開 prime view evaluati

13、 on 軟件，打來文件夾，在里面按照時間順序找到你蛋白質(zhì)純化圖譜，然后點擊 file，選擇save as將你的圖保存在你的文件夾。（2）提取：點擊file,選擇export f curves 選擇 01: UV 和 06： Cone并在 Reduce number of samples中選 擇Reduce by 1。點擊保存，得到 excel表格，并用 Graphpad prism5做蛋白 純化圖譜。關(guān)鍵步驟：1. super loop上盡量不要有氣泡，如果有氣泡只能跟過鎳柱一樣快跑完時手動調(diào)成load。所有參數(shù)在跑的過程中都可以改動，因此雖然程序上接樣是從100ml-400 ml這么寬的范圍

14、進行收集，但根據(jù)實際情況可以自己調(diào)。2. Super loop中的樣品如果只有30毫升，在設定程序時需要有所保留設定為 29毫升，以免分子篩里進入氣泡。3. 在使用綠色上樣管時，請用注射器吸取少量gel filtration buffer，打入到綠色上樣管中（一是為了去除氣泡，而是為了去除管內(nèi)液體）。?維護注意事項（Maintenance ）1. 每天，除了連續(xù)使用外，當實驗完成系統(tǒng)使用結(jié)束后，應盡可能避免保存在裝載緩沖液狀態(tài)過夜。尤以高鹽濃度洗脫緩沖液為甚！假如，不能避免，則緊 記次日盡早用System Wash Method完成以蒸餾水將系統(tǒng)徹底清洗，才予以 保存或再更新使用其它緩沖液，再

15、次投入使用進行實驗操作。用蒸餾水將剩 下的緩沖液徹底沖洗出系統(tǒng)，這步驟至關(guān)重要。此舉不但可以避免緩沖液對 系統(tǒng)造成腐蝕機會，或因使用高鹽濃度緩沖液保存過久造成鹽結(jié)晶等的堵 塞，對系統(tǒng)構(gòu)成不必要的損害和損耗。2. （我們機器沒有pH探測器）任何時間當不使用系統(tǒng)時，絕不要將pH電極留在流動池里。請不應將電極以水保存，否則這將使電極末端的玻璃膜，因長 期保持于工作狀況下，會加速老化，甚或變干。電極可作以下處理：從流動 池卸下pH電極。先以蒸餾水沖洗一遍，輕拭水份后，使其末端以其合適溶液泡浸保存。建議使用之保存溶液為：1摩爾KN03及pH值為4溶液（以1:1）的混合緩沖液。3. 若數(shù)天或更長的時間不使

16、用系統(tǒng)，除用蒸餾水徹底清洗系統(tǒng)外。取下柱和pH電極（任選件）。通過細管道替換柱，并安裝虛擬pH電極（如果使用）。然后用20%乙醇再沖洗所有使用的管件通道和所有的流動池一遍，然后并以 此將系統(tǒng)保存。（pH電極應先行處理，參看上面2節(jié)的說明）。UV流動池也 可以如上所述地用蒸餾水沖洗然后用 20%乙醇通過流動池。但如需要也可吹 乾存放，重新放置上紅的保護罩。在此并不建議使用壓縮空氣使之吹乾，因 為其內(nèi)可能含有油滴，造成污染。建議使用低壓高純氮氣或憜性氣體（如氬 氣等）。4. 每月定期保養(yǎng)處理，或當發(fā)現(xiàn)假峰等問題出現(xiàn)時，可拆下柱子，并用適宜的毛細管道替換其位置，將所有的緩沖液入口管件置于 1摩爾NaOH中，對所有 的入口管件通路運行System Wash Method,以流速為每分鐘1毫升，將整個 系統(tǒng)充分沖洗若20分鐘。然后立即用蒸餾水，以通條件將整個系統(tǒng)運行 System Wash Method加以沖洗20 分鐘。5. 當裝配部分收集器出口管架時，應根據(jù)收集管的長度不同而使用不同的切換口。調(diào)整時可將出口管和管夾放在輸送臂上的長度導向小孔上，將管夾底在 孔外臂上，將出口管輕推向下到達導向孔的底部，然后上緊管夾螺母。此可 確保出口管露出正確的長度，以免造成跳管或收集體積錯誤情況發(fā)生。6. 一定要保持實驗環(huán)境的清潔，當使用儀器時