細胞增殖檢測(08碩)

1、細胞增殖活性與凋亡的形態(tài)學檢細胞增殖活性與凋亡的形態(tài)學檢測方法測方法華中科技大學華中科技大學同濟醫(yī)院病理研究所同濟醫(yī)院病理研究所 阮秋蓉阮秋蓉n細胞增殖細胞增殖n細胞凋亡細胞凋亡細胞增殖檢測細胞增殖檢測Methods for studying cell proliferation and viability in cell populations細胞周期細胞周期 細胞周期（細胞周期（cell cycle)是指細胞從前是指細胞從前一次分裂結束起到下一次分裂結束一次分裂結束起到下一次分裂結束為止的活動過程，分為間期與分裂為止的活動過程，分為間期與分裂期兩個階段。期兩個階段。n（一）（一） 間期：分

2、為三期、即間期：分為三期、即DNA合成前期合成前期（G1）、）、DNA合成期（合成期（S）與）與DNA合成后合成后期（期（G2）。）。n（二）分裂期（二）分裂期 ：細胞的有絲分裂（：細胞的有絲分裂（M）需）需經(jīng)前、中、后，末期，是一個連續(xù)變化過經(jīng)前、中、后，末期，是一個連續(xù)變化過程，由一個母細胞分裂成為兩個子細胞。程，由一個母細胞分裂成為兩個子細胞。細胞增殖檢測方法細胞增殖檢測方法 目前主要有兩種檢測細胞增殖能力的方法。目前主要有兩種檢測細胞增殖能力的方法。n直接方法直接方法: 通過直接測定進行分裂的細胞數(shù)來通過直接測定進行分裂的細胞數(shù)來評價細胞的增殖能力。（評價細胞的增殖能力。（DNA sy

3、nthesis）n間接方法間接方法: 細胞活力檢測方法，通過檢測樣品細胞活力檢測方法，通過檢測樣品中健康細胞的數(shù)目來評價細胞的增殖能力。中健康細胞的數(shù)目來評價細胞的增殖能力。（ metabolic activity）n直接方法直接方法: 胸腺嘧啶核苷（胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）滲入法）滲入法 Brdu檢測法檢測法n間接方法：間接方法： MTT檢測法檢測法 羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）檢測法檢測法(一一)胸腺嘧啶核苷（胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）滲入法）滲入法n胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的堿基，是DNA合成的必需物質。n用同位素3H標記Td

4、R即3H-TdR作為DNA合成的前體能摻入DAN合成代謝過程，通過測定細胞的放射性強度，可以反映細胞DAN的代謝及細胞增殖情況。n但是具有放射性。(二二) Brdu檢測法檢測法n為常用的方法。為常用的方法。n用用BrdU（ 5-溴脫氧尿嘧啶核苷）預處理的細溴脫氧尿嘧啶核苷）預處理的細胞中，胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入復制的可代替胸腺嘧啶核苷插入復制的DNA雙鏈中，而且這種置換可以穩(wěn)定存在，并雙鏈中，而且這種置換可以穩(wěn)定存在，并 帶到子代細胞中。帶到子代細胞中。n細胞經(jīng)過固定和變性處理后，可用免疫學方法細胞經(jīng)過固定和變性處理后，可用免疫學方法檢測檢測DNA中中BrdU的含量（如采用鼠抗的

5、含量（如采用鼠抗BrdU單單克隆抗體特異識別克隆抗體特異識別BrdU,再采用辣根過氧再采用辣根過氧 化酶化酶標記的山羊抗鼠標記的山羊抗鼠IgG二抗標記，最后用比色法二抗標記，最后用比色法或熒光的方法進行定量測定），從而判斷細胞或熒光的方法進行定量測定），從而判斷細胞的增殖能力。的增殖能力。間接方法間接方法n在一些情況下，細胞活力的檢測相當于細胞增殖能力的測定。n主要采用特殊的試劑MTT MTT及其他四唑鹽來測定細胞的代謝活力，通過檢測細胞的氧化還原活性來檢測細胞增殖能力.(三三)MTT檢測法檢測法nMTT檢測法主要反映細胞的能量代謝，是檢測細胞增殖活力的一種簡便準確的方法。n其原理是在活細胞生

6、長和增殖過程中，線粒體內的脫氫酶可將黃色的MTT分解成蘭紫色的甲臜（Formazan），生成的甲臜量的多少與細胞的數(shù)量和細胞的活力成正比 (四四)羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）檢測法）檢測法n羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）是一種可穿透細胞膜的熒光染料，具有與細胞特異性結合的琥珀酰亞胺脂基團和具有非酶促水解作用的羥基熒 光素二醋酸鹽基團，使CFSE成為一種良好的細胞標記物。nCFSE進入細胞后可以不可逆地與細胞內的氨基結合偶聯(lián)到細胞蛋白質上。n當細胞分裂時，CFSE標記熒光可平均分配至兩個子 代細胞中，因此其熒光強度是親代細胞的一半。n在一個

7、增殖的細胞群中，各連續(xù)代細胞的熒光強度呈對遞減，利用流式細胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測 通道可對其進行分析。細胞凋亡檢測方法n細胞凋亡是指為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。n細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系 列基因的激活、表達以及調控等的作用，它不是病理條件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。區(qū)別點細胞凋亡細胞壞死起因生理或病理性病理性變化或劇烈損傷范圍單個散在細胞大片組織或成群細胞細胞膜保持完整，一直到形成凋亡小體破損染色質凝聚在核膜下呈半月狀呈絮狀細胞器無明顯變化腫脹、內質網(wǎng)崩解細胞體積

8、固縮變小腫脹變大凋亡小體有，被鄰近細胞或巨噬細胞吞噬無，細胞自溶，殘余碎片被巨噬細胞吞噬基因組DNA有控降解，電泳圖譜呈梯狀隨機降解，電泳圖譜呈涂抹狀蛋白質合成有無調節(jié)過程受基因調控被動進行炎癥反應無，不釋放細胞內容物有，釋放內容物。 細胞凋亡的生物學特征細胞凋亡的生物學特征n1形態(tài)學變化n2生物化學變化1）DNA的片段化 2） 大分子合成（一）細胞凋亡的形態(tài)學檢測（一）細胞凋亡的形態(tài)學檢測n 1 光學顯微鏡和倒置顯微鏡n 2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡n 3 透射電子顯微鏡觀察n 4 TUNEL法 DNA片斷化檢測片斷化檢測 n細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質發(fā)生濃縮, 染色質DNA

9、在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成180200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA標記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。 TUNEL法法 n細胞凋亡中細胞凋亡中, 染色體染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性大量的粘性3-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉末端

10、，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物過氧化物 酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到到DNA的的3-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法標記法 （terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL（TdT mediated dUTP nick end labeling）。由）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因的斷裂，因而沒有而沒有3-OH形成，很少能夠被染色。形成，很少能夠被染色。nTUNEL是分子生物學與形態(tài)學相結合是分子生物學與形態(tài)學相結合 的研究的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化