PCRSSP法基因定型解決臨床配血中血型問題

1、PCR-SSP法基因定型解決臨床配血中血型問題趙志弘 何路軍 喬芳 田亞娟 王振雷 張虹 劉敬閃【摘要】 目的利用ABO基因定型技術解決臨床疑難血型定型1例。方法運用血型血清學方法、PCR-SSP(Sequence Specific Primer,SSP)基因定型法對比進行1例正反定型不符標本的檢測。結果血清學方法不能正確定型。PCR-SSP法基因定型結果是該患者為O1O1V基因型。結論血型基因定型技術較血型血清學方法更準確、可靠，是血型血清學技術的極好補充。 【關鍵詞】 PCR-SSP;血型血清學;正反定型不符;ABO基因定型;冷凝集素 近些年來，隨著城市人口的激增，血站不僅在采供血量上增長

2、很快，而且在實際工作中出現(xiàn)了更多的正反定型不符合標本，這些標本有來自血站內(nèi)部檢驗科的，也有來自醫(yī)院臨床的。傳統(tǒng)的血清學檢測方法由于其自身局限性，因此面臨很大挑戰(zhàn)。筆者在實際工作中運用ABO基因定型方法解決了一些疑難血型定型的常見問題，現(xiàn)以1例臨床配血中出現(xiàn)的正反定型不符標本的鑒定報告如下。1材料與方法1.1血型血清學試驗按照文獻1操作?？?A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-H、抗-M、抗-N、抗球蛋白試劑、標準試劑ABO紅細胞、譜細胞均由上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司制備。1.2血型基因定型PCR-SSP; 血型血清學; 正反定型不符; ABO基因定型;冷凝集素采用聚合酶鏈反應-序列特異性引物

3、(PCR-SSP)技術。DNA提取嚴格按照TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒說明書進行。引物為采用瑞典隆德Martin.L.Olsson研究小組24與筆者自行設計，內(nèi)對照為擴增人類生長激素基因(HGH),均由上海生工合成。PCR擴增儀為美國ABI公司9700。引物混合物檢測的基因特異性、突變位點和PCR產(chǎn)物片段大小見表1。引物序列見表2。1.2.1PCR反應體系總反應體系10l,引物濃度10pmol/l,dNTPs濃度10pmol/l,基因組DNA濃度50ng/l,15mM MgCl2 (SIGMA公司),內(nèi)對照引物濃度5pmol/l,5U/l Taq DNA聚合酶(Promega,Sh

4、anghai)，甘油和甲酚紅終濃度分別為5%和0.01% (SIGMA公司)。表1基因分型引物檢測的基因特異性、突變位點和PCR產(chǎn)物片段大小1.2.2PCR循環(huán)參數(shù)采用熱啟動DNA變性技術96預置7min,然后按94 30s,66 30s,72 1min 進行32個循環(huán)，再72延伸2min。1.2.3電泳PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒別，電壓153V,時間15min，DNA Marker DL2000為TRAASTM公司產(chǎn)品，凝膠成像儀拍照觀察結果(見圖1)。2結果患者,女,25歲，2011年2月患貧血入住省二院。醫(yī)院在配血中發(fā)現(xiàn)其血型正反定型不符,遂請求本中心配型科鑒定。血清學鑒定結果及基

5、因定型結果分別見表3和圖1。表3患者血清學結果圖1表3顯示：該患者正定型為AB型，反定型為O型。存在正反定型不符合現(xiàn)象。圖1顯示：只有1、4泳道擴增出了特異性條帶，1、4泳道分別為O1和O1V基因的擴增產(chǎn)物，因此該患者基因型為O1O1V。3討論患者血型血清學結果正反定型不符，正定型為AB型，反定型為O型。因反定型O細胞、自身細胞凝集，提示該獻血員血清中存在冷凝集素。37水浴后，正定型抗A、抗B、抗A1、抗AB和反定型O細胞、自身細胞凝集消失，證明該患者血清中存在冷凝集素抗體。至此，定型不符的原因找到?；蚨ㄐ蛨D譜顯示出了其O1O1V基因型：1、4泳道為O1和O1V基因，2、3泳道為A基因，3、

6、5、6泳道為B基因。患者樣本只在1、4泳道擴增出了特異性條帶。綜上所述，此類標本在血站或醫(yī)院血庫的日常工作中會經(jīng)常遇到，具有較典型的代表性。此套常規(guī)ABO基因定型方法，切合實際，在3h內(nèi)可完成從DNA抽提到基因擴增的完成，效率較高，相對血型血清學方法，能在較短時間內(nèi)準確解決疑難血型標本的定型問題。此PCR-SSP法較PCR-RFLP法3(限制性內(nèi)切酶法)具有省時、簡便的特點。雖然血清學凝集反應是鑒定血型的基本方法，但是有其局限性，而以DNA為檢材的基因分型技術，不受血型抗體來源以及生物活性細胞的限制。采用高通量基因分型平臺可以檢測血型基因變異體。當今，經(jīng)典免疫血液學和分子免疫血液學很自然地整合

7、在一起，形成了“后基因組時代免疫血液學”。在整合的前提下，血清學方法和基因分型方法取長補短，相互補充，不存在誰取代誰的問題。從提高輸血安全性方面考慮，向臨床提供基因分型的血液制品，從供受者表型匹配逐步升級到基因型匹配，是今后的發(fā)展方向。血清學技術相對比較普及，當前加強分子生物學教育顯得刻不容緩5。基因定型技術作為血型血清學方法的極好補充，應當為廣大血型工作者所熟知和掌握。【參考文獻】 1肖星甫 輸血技術手冊成都：四川科學技術出版社，1992：494-5142Olsson ML,Chester MA.Frequent occurrence of a variant O1 allele at the blood group ABO locus.Vox Sang，1996,70:26-303劉長利，龔曉燕，王卓妍，等北京地區(qū)漢族人群ABO血型基因分型研究中國實驗血液學雜志,2008，16(2):425-4284Okeefe DS,Dobrovic A.A rapid and reliable PCR method of genotyping the