解除牡丹種子深度休眠的方法研究

1、解除牡丹種子深度休眠的方法研究上海中學 張逸倫校外指導教師：衛(wèi)志明，朱木蘭摘要：牡丹為國花之首選，且亦花亦藥，具有重要的研究價值。牡丹種子具有深度休眠特性，需2年才能自然萌發(fā)，因而研究牡丹種子休眠解除的方法意義重大。本研究通過對解除牡丹種子休眠影響因素的探索，建立了解除牡丹種子深度休眠的成套技術(shù)體系。該體系分為實生苗和離體種胚兩種途徑。實生苗途徑操作步驟：（1）1000 mg/l ga3浸泡24 h；（2）附含100 mg/l ga3 + 1 mg/l ba + 3 mg/l ca(no3)2 4濕砂儲藏；（3）泥炭、菜園土和珍珠巖（361）基質(zhì)播種；（4）10 mg/l ga3 + 1 mg

2、/l ba + 3 mg/l ca(no3)2 葉面噴灑。離體種胚途徑操作步驟：（1）1000 mg/l ga3浸泡24 h；（2）100 mg/l ga3 + 1 mg/l ba + 3 mg/l ca(no3)2去殼浸泡24 h；（3）添加5 mg/l ga3 + 1 mg/l ba + 3 mg/l ca(no3)2 的wpm培養(yǎng)基培養(yǎng)4周。實生苗途徑獲得明顯主莖的牡丹苗木歷時180天，離體種胚途徑獲得明顯主莖的離體芽苗歷時30天。緒論牡丹(paeonia suffruticosa)，別名富貴花、百兩金、木芍藥、鼠姑、鹿韭，洛陽花，為芍藥科芍藥屬木本植物，落葉灌木，素有“國色天香”、“花

3、中之王”的美譽，為我國國花之首選（李嘉玉，1999；李子峰等2006；翟敏等，2007）。牡丹不僅有較高的觀賞價值，還具備很好的藥用價值。早在漢代，藥用植物典籍神農(nóng)本草經(jīng)就有牡丹被馴化入藥的記載（魏澤圃等，1987；郭紹霞等，2003；翟敏等，2007）。隨著牡丹在園林綠化、藥材儲備中市場價值的增大，催生了牡丹的經(jīng)濟市場，整個市場已經(jīng)形成了從種苗、盆花、切花、干花到規(guī)模化景觀開發(fā)和精細化精油提取等完整的產(chǎn)業(yè)鏈條，鏈條上每個環(huán)節(jié)都蘊藏著誘人的商機和花卉產(chǎn)業(yè)全新的經(jīng)濟增長點（劉會超等，2010）。擴大繁殖系數(shù)，提高擴繁效率，開展牡丹種苗規(guī)?；a(chǎn)，為市場快速高效提供各級優(yōu)質(zhì)牡丹苗木，成為當今牡丹生

4、產(chǎn)與研究的主要關(guān)注點。牡丹的種苗繁殖以種子播種方式為主，其中包括結(jié)籽稀少的重瓣型品種，只有極少部分不結(jié)籽的重瓣型品種采用分株或嫁接方式進行后代繁殖。然而，牡丹種子在自然條件下具有休眠特性，具體表現(xiàn)在胚根(下胚軸)和胚芽(上胚軸)的休眠，尤以上胚軸休眠更為深沉（julie a.t. et al；1994；賈文慶等，2006；xin huang et al，2008）。通常情況下，牡丹種子靠越冬低溫打破休眠而自然萌發(fā)成苗需兩年時間，開花需10年左右，時間跨度過長，生產(chǎn)效率過低，生產(chǎn)成本過高，嚴重制約牡丹經(jīng)濟的蓬勃興起（成仿云等，2008）。因此，快速高效破除上胚軸休眠特性，有效提高種子的發(fā)芽率及發(fā)

5、芽勢，縮短牡丹種子成苗成花時間跨度，對日益升溫的牡丹經(jīng)濟來說，意義重大。為快速破除牡丹上胚軸休眠特性，盡快緩解牡丹種苗供需矛盾，我們對牡丹自然萌發(fā)種子和離體培養(yǎng)種胚的休眠釋放進行了研究，獲得了快速高效打破牡丹上胚軸休眠特性的良好方法?，F(xiàn)總結(jié)成文，以期為牡丹的規(guī)?；a(chǎn)和市場化開發(fā)提供一定的技術(shù)與理論支持。材料與方法1、植物材料：鳳丹種子，自 2010年至2012年，每逢9月采集于上海植物園科研中心牡丹育種苗圃，采后去莢、陰涼處風干，塑料袋分裝，4或-20冰箱保存?zhèn)溆谩?、材料處理：選取成熟飽滿的牡丹種子，用自來水沖洗2-4 h，濾紙吸干；再用70%酒精浸泡60s，無菌水或蒸餾水沖洗3次，濾紙吸

6、干，4或-20冰箱保存?zhèn)溆谩?、 母液制備： 1000 mg/l的赤霉素（ga3）溶液，用分析純酒精助溶，現(xiàn)配現(xiàn)用；1 mg/l ba，用1 mol/l hcl助溶，4冰箱保存；5 mg/l ca(no3)2，直接溶于水，常溫保存。4、 培養(yǎng)基：wpm基本培養(yǎng)基，按需添加植物激素等，121滅菌20 min，用于種胚離體培養(yǎng)。 5、 播種基質(zhì)：泥炭、菜園土和珍珠巖（361）的基質(zhì)，用于播種已發(fā)根的牡丹種子；冷藏所用濕砂，使用前121滅菌60 min，用于儲存各處理的牡丹種子。6、 ga3對牡丹種子休眠解除的影響（1） ga3預(yù)處理對發(fā)根的影響：選取飽滿的牡丹種子，用0，200, 600, 100

7、0, 1400, 1800 mg/l的ga3浸泡24 h，棄液，留種子，溫水洗3次，風干，埋藏于濕砂中，黑暗條件下常溫儲藏。（2） ga3對出苗的影響：將1000 mg/l的ga3浸泡24 h的牡丹種子埋藏于附含0，50，100，150,200,250 mg/l ga3的濕砂中，黑暗條件下4儲藏。（3） ga3對實生苗上胚軸伸長的影響：用0, 5, 10，15，20, 30 mg/l ga3噴灑處理6（2）獲得的小苗葉片，3天/次，持續(xù)噴灑2個月。（4） ga3對離體種胚上胚軸伸長的影響：選取經(jīng)1000 mg/l ga3浸泡24 h、去殼并用100 mg/l ga3浸泡24 h的牡丹離體種胚為

8、實驗對象，直接接種于附含0, 1, 3，5，7, 10 mg/l ga3的wpm培養(yǎng)基中。7、 ba對牡丹種子休眠解除的影響：選取經(jīng)1000 mg/l ga3浸泡處理的牡丹的帶殼種子和去殼種子為實驗對象，帶殼種子直接埋藏于100 mg/l ga3分別添加0,0. 5，1，1.5，2.0 mg/l ba的4濕砂中，實生苗時期葉面噴灑上述濃度ba處理液；去殼種子用上述處理液浸泡24 h后，剝胚培養(yǎng)，離體種胚直接接種于附含上述濃度ba的wpm培養(yǎng)基中。8、 ca(no3)2對牡丹種子休眠解除的影響：選取經(jīng)1000 mg/l ga3浸泡處理的牡丹帶殼種子和去殼種子為實驗對象，帶殼種子直接埋藏于100

9、mg/l ga3分別添加0, 1，2，3, 4, 5 mg/l ca(no3)2的4濕砂中，實生苗時期葉面噴灑上述濃度ca(no3)2處理液；去殼種子用上述處理液浸泡24 h后，剝胚培養(yǎng)，離體種胚直接接種于附含上述濃度ca(no3)2的wpm培養(yǎng)基中。9、 概念界定及數(shù)據(jù)統(tǒng)計：胚根外露稱露白，露白天數(shù)以連續(xù)3天露白種子數(shù)低于1%的初始日期為露白日期，并以此計算露白天數(shù)（發(fā)根、出葉或出苗、出芽、成苗等同此標準），根長達到5 mm即為發(fā)根，第一片真葉出土為出葉或出苗，頂芽出現(xiàn)為出芽，主莖達到1 cm為成苗，離體種胚主莖達到1 cm稱為成芽苗；各種平均值和百分率按常規(guī)計算方法進行。結(jié)果與分析1、 g

10、a3預(yù)處理對發(fā)根的影響通常情況下，牡丹種子在自然狀態(tài)下發(fā)根需要1年左右時間（馬新玲等，2011），因而牡丹種子播前預(yù)處理受到廣泛關(guān)注。為了探尋ga3預(yù)處理對牡丹發(fā)根的影響，我們選取飽滿的牡丹種子，用0，200, 600, 1000, 1400, 1800 mg/l的赤霉素（ga3）浸泡24 h，常溫濕砂藏，黑暗條件下發(fā)根。從表1可見，隨著ga3濃度的升高，種子的露白天數(shù)逐漸減少，露白百分率出對照外，先升高后下降，1000 mg/l ga3處理達到最高（88.25%）；而發(fā)根天數(shù)則以1000 mg/l ga3處理為最短（326±5天），發(fā)根百分率為87.87%，最高。1400，1,80

11、0 mg/l ga3兩個處理的露白率雖然高于1000 mg/l ga3處理，但平均發(fā)根天數(shù)大于1000 mg/l ga3處理，發(fā)根率也低于1000 mg/l ga3處理。這可能與過高濃度ga3快速促進胚乳代謝而消耗了胚根生長所需營養(yǎng)有關(guān)。因此，牡丹種子用1000mg/l ga3預(yù)處理24 h后砂藏的發(fā)根效果較佳。表1 高濃度ga3預(yù)處理對牡丹種子發(fā)根的影響濃度露 白發(fā) 根（mg/l）露白天數(shù)(d)露白百分率(%)發(fā)根天數(shù)(d)發(fā)根百分率(%)0346±585.78358±482.14200338±383.12356±582.71600329±2

12、85.33346±386.231000297±388.25326±587.871400294±385.09332±384.261800290±482.45344±482.282、 ga3對出苗或出葉的影響為了探索ga3對出苗或出葉的影響，我們將1000 mg/l ga3浸泡24 h的牡丹種子埋藏于附含0，50，100，150, 200, 250 mg/l ga3的濕砂中，黑暗條件下4儲藏，露白后轉(zhuǎn)入常溫下萌發(fā)，發(fā)根后播種于泥炭、菜園土和珍珠巖（361）的基質(zhì)中出葉（本課題又稱出苗）。從表2可見，隨著ga3濃度的升高，牡丹種子

13、的發(fā)根天數(shù)和出葉天數(shù)逐漸減少；出苗或出葉百分率在0-100 mg/l ga3處理范圍內(nèi)，隨著處理濃度的升高而增加，高于100 mg/l ga3時，反而下降；在0-100 mg/l ga3處理范圍內(nèi)，葉形表型正常，高于100 mg/l ga3時，葉型異常的數(shù)量增多。因此，經(jīng)1000 mg/l ga3預(yù)處理24 h的牡丹種子，埋藏于附含100 mg/l ga3 4黑暗條件下的濕砂中一段時間的后續(xù)出苗或出葉效果最佳，發(fā)根天數(shù)為92±4 d，出苗即出葉天數(shù)為118±4 d，出葉百分率達到90.45%。表2 ga3對牡丹種子出苗的影響濃度（mg/l）發(fā)根天數(shù)(d)出葉天數(shù)(d)出葉百

14、分率(%)葉片形狀0148±3233±883.72正常50128±5190±584.32正常10092±4118±490.45正常15085±5108±584.47少量異型葉20078±397±576.76部分異型葉25070±290±573.75多為異型葉3、ga3對實生苗上胚軸伸長的影響在牡丹的休眠特性中，以上胚軸的休眠尤為深沉，種子萌發(fā)后，由一片葉柄將葉片送出地面，通常在1年后，頂芽才露出地表（成仿云等，2008）。為了加表3 ga3對實生苗上胚軸伸長的影響濃度（mg/

15、l）出芽天數(shù)(d)成苗天數(shù)(d)成苗百分率(%)主莖質(zhì)地0372±5495±387.42堅硬5218±5270±589.14堅硬10155±2188±390.26堅硬15150±3173±587.38軟20142±3165±584.76較軟30130±1150±583.40松軟、節(jié)間長速牡丹上胚軸深度休眠的釋放，我們用1000 mg/l ga3預(yù)處理牡丹種子24 h，再將其埋藏于附含0，50，100，150, 200, 250 mg/l ga3的濕砂中，黑暗條件下4儲藏,11

16、8±4 d（表2）出葉后用0, 5, 10，15，20, 30 mg/l ga3噴灑小苗葉片，3次/天，持續(xù)噴灑2個月。從表3可見，隨著ga3濃度的升高，牡丹實生苗出芽天數(shù)和成苗天數(shù)逐漸減少，而成苗百分率以10 mg/l ga3為最高，達到90.26%。0-10 mg/l 范圍內(nèi)ga3處理，實生苗主莖質(zhì)地均呈現(xiàn)堅硬狀態(tài)；處理濃度達到15 mg/l時，由于生長速度過快，實生苗主莖質(zhì)地開始變軟；處理濃度達到30 mg/l時，主莖除了生長過快、質(zhì)地松軟外，還出現(xiàn)了節(jié)間增長的現(xiàn)象（表3）。綜合上述幾種考察指標，葉面噴灑10 mg/l ga3對進一步解除牡丹上胚軸休眠效果最佳。4、ga3對離體

17、種胚上胚軸伸長的影響選取經(jīng)1000 mg/l ga3浸泡24 h、去殼并用100 mg/l ga3浸泡24 h 的牡丹離體種胚，直接接種于附含0, 1, 3，5，7, 10 mg/l ga3的wpm培養(yǎng)基中萌發(fā)，主要考察出芽天數(shù)、成芽苗天數(shù)、成芽苗百分率和主莖質(zhì)地等四項生長指標。離體種胚上胚軸休眠解除，生長成主莖有效伸長（大于1 cm）的無根芽，稱之為成芽苗。從表4可見，隨著ga3濃度的升高，牡丹離體種胚出芽天數(shù)和成芽苗天數(shù)逐漸減少，1, 3，5，7, 10 mg/l ga3處理較對照（wpm基本培養(yǎng)基）的出芽天數(shù)、成芽苗天數(shù)差異極其顯著；在0 - 5 mg/l ga3范圍內(nèi)，成芽苗百分率高而

18、一致，主莖質(zhì)地表現(xiàn)為致密狀態(tài)，7，10 mg/l ga3處理的主莖質(zhì)地逐漸疏松，嚴重者呈匍匐狀，因而成芽苗百分率也隨之下降。因此，5 mg/l ga3為離體種胚上胚軸伸長的最適濃度。表4 ga3對離體種胚上胚軸伸長的影響濃度（mg/l）出芽天數(shù)(d)成芽苗天數(shù)(d)成芽苗百分率(%)主莖質(zhì)地0216±5278±497.77致密158±375±198.25致密337±255±395.66致密525±348±198.85致密722±142±285.60疏松1020±131±178

19、.08松軟5、ba對牡丹種子休眠解除的影響選取經(jīng)1000 mg/l ga3浸泡處理的牡丹的帶殼種子和去殼種子為實驗對象，帶殼種子直接埋藏于100 mg/l ga3分別添加0,0. 5，1，1.5，2.0 mg/l ba的4濕砂中，發(fā)根后播種于泥炭、菜園土和珍珠巖（361）的基質(zhì)中，出苗后葉面噴灑上述濃度ba處理液；去殼種子用上述處理液浸泡24 h后，剝胚培養(yǎng)，離體種胚直接接種于附含上述濃度ba的wpm培養(yǎng)基中。從表5可見，隨著ba濃度的升高，實生苗和離體種胚的出芽天數(shù)均逐漸減少，而二者的成芽苗天數(shù)以1 mg/l ba處理天數(shù)最少，高于這個處理濃度，無論是實生苗還是離體種胚均出現(xiàn)多芽現(xiàn)象。這主要

20、由于隨著ba濃度的升高，ba打破牡丹種胚上胚軸休眠的強度增加，所以出芽天數(shù)逐漸減少；ba又是一種作用很強的細胞分裂素，多芽出現(xiàn)即側(cè)芽生長旺盛，直接抑制主莖生長，因而在限定時間內(nèi)合格的芽苗減少，1.5,2.0mg/l ba處理的成芽苗天數(shù)也隨之增加。因此，1 mg/l ba為解除牡丹種胚休眠的最佳使用濃度。表5 ba對牡丹種子休眠解除的影響濃度（mg/l）實 生 苗離 體 種 胚出芽天數(shù)(d)成苗天數(shù)(d)出芽天數(shù)(d)成芽苗天數(shù)(d)0166±2228±2218±3288±40.5155±1198±360±195±

21、11.0147±2187±250±278±31.5132±2190±347±382±12.0125±1195±144±186±26、ca(no3)2對牡丹種子休眠解除的影響選取經(jīng)1000 mg/l ga3浸泡處理的牡丹種子和去殼種子為實驗對象，用 100 mg/l ga3分別添加0, 1，2，3, 4, 5 mg/l ca(no3)2的處理液浸泡，帶殼種子直接埋藏于含上述配方的4濕砂中，發(fā)根后播種于泥炭、菜園土和珍珠巖（361）的基質(zhì)中，出苗后采用葉面噴灑0, 1，2，3,

22、4, 5 mg/l ca(no3)2；去殼種子用上述處理液浸泡24 h后，剝胚培養(yǎng)，離體種胚直接接種于附含上述濃度ca(no3)2的wpm培養(yǎng)基中。從表6可見，0-3 mg/l ca(no3)2濃度范圍內(nèi)，實生苗和離體種胚的出芽天數(shù)、成苗天數(shù)和成芽苗天數(shù)等均隨著處理濃度升高而減少；3 mg/l ca(no3)2處理的實生苗出芽天數(shù)、成苗天數(shù)分別為152±1 d和220±1 d，離體種胚的出芽天數(shù)、成苗天數(shù)分別為196±2 d和272±1 d。 4, 5 mg/l ca(no3)2處理濃度的出芽天數(shù)，成苗和成芽苗天數(shù)均較3 mg/l ca(no3)2處理有

23、所增加（表6），這可能與ca(no3)2處理濃度過高對植物材料反而造成了一定的毒害作用有關(guān)。因此，單因素實驗結(jié)果表明，3 mg/l ca(no3)2處理對牡丹種子休眠解除效果最佳。表6 ca(no3)2對牡丹種子休眠解除的影響濃度（mg/l）實 生 苗離 體 種 胚出芽天數(shù)(d)成苗天數(shù)(d)出芽天數(shù)(d)成芽苗天數(shù)(d)0168±3235±2226±2298±21165±1229±3208±1286±12161±2227±2205±2282±33152±1220&

24、#177;1196±2272±14164±1223±1228±2316±25169±1232±1235±2343±47、牡丹種子休眠解除體系的建立 通過上述實驗，我們分析了牡丹種子休眠解除的幾種影響因素及技術(shù)參數(shù)，并將這些技術(shù)參數(shù)優(yōu)化組合，形成了解除牡丹種子休眠特性的具體操作流程，見圖1。從圖1可見，這一操作流程分為兩種途徑，實生苗途徑和離體種胚途徑。 實生苗途徑操作步驟： （1）1000 mg/l ga3浸泡24 h；（2）附含100 mg/l ga3 + 1 mg/l ba + 3 mg/l

25、 ca(no3)2 4濕砂儲藏；（3）泥炭、菜園土和珍珠巖（361）基質(zhì)播種；（4）10 mg/l ga3 + 1 mg/l ba + 3 mg/l ca(no3)2 葉面噴灑。離體種胚途徑操作步驟： （1）1000 mg/l ga3浸泡24 h；（2）100 mg/l ga3 + 1 mg/l ba + 3 mg/l ca(no3)2去殼浸泡24 h；（3）添加5 mg/l ga3 + 1 mg/l ba + 3 mg/l ca(no3)2 的wpm培養(yǎng)基離體培養(yǎng)。 8、優(yōu)化后的休眠解除體系的應(yīng)用效果：選取健康飽滿的牡丹種子，按圖1的操作步驟和流程驗證該休眠解除體系的應(yīng)用效果。實驗分3批次進

26、行，每次150粒種子。結(jié)果見表7。從種子到實生苗，平均歷時180 d，成苗百分率平均達到88.1%，見版圖；從種子到離體種胚，再到有待離體生根的芽苗（即成芽苗），平均歷時僅為30 d，成芽苗百分率平均達到97.3%，版圖。表7 休眠解除體系的應(yīng)用效果實驗批次實 生 苗離 體 種 胚成苗天數(shù)(d)成苗百分率(%)成芽苗天數(shù)(d)成芽苗百分率(%)117887.53097.0218286.63198.0318090.32998.0平均18088.13097.3討論（1）ga3具有解除牡丹種子休眠的作用（成仿云等，2008），這與我們的實驗結(jié)果一致。（2）我們的實驗結(jié)果表明，低濃度的ba也能在一定程

27、度上解除牡丹的休眠特性，這一報道在牡丹上不多見。（3）ca(no3)2在本研究的單因素試驗中，對解除牡丹休眠的效果不太明顯，但在配方中作為添加劑使用時，效果良好。這可能與ca2+的信號轉(zhuǎn)導作用有關(guān)。ca(no3)2在牡丹種子休眠解除中的作用及使用效果鮮見報道。（4）牡丹離體生根雖然存在一定難度（beruto m, et al.）,但本研究所得的主莖伸長后的芽苗，比較容易離體生根。結(jié)論通過牡丹種子休眠釋放的影響因子研究，建立了解除牡丹種子深度休眠的技術(shù)體系。該體系分為實生苗和離體種胚兩種途徑。實生苗途徑操作步驟： （1）1000 mg/l ga3浸泡24 h；（2）附含100 mg/l ga3

28、+ 1 mg/l ba + 3 mg/l ca(no3)2 4濕砂儲藏；（3）泥炭、菜園土和珍珠巖（361）基質(zhì)播種；（4）10 mg/l ga3 + 1 mg/l ba + 3 mg/l ca(no3)2 葉面噴灑。離體種胚途徑操作步驟： （1）1000 mg/l ga3浸泡24 h；（2）100 mg/l ga3 + 1 mg/l ba + 3 mg/l ca(no3)2去殼浸泡24 h；（3）添加5 mg/l ga3 + 1 mg/l ba + 3 mg/l ca(no3)2 的wpm培養(yǎng)基培養(yǎng)4周。實生苗途徑獲得明顯主莖的牡丹苗木歷時180天，離體種胚途徑獲得明顯主莖的離體芽苗歷時30

29、天。創(chuàng)新點牡丹種子具深度休眠特性，自然萌發(fā)需2年才能成苗。本研究實生苗途徑獲得明顯主莖的牡丹苗木歷時180天，離體種胚途徑獲得明顯主莖的離體芽苗歷時30天。因而，本研究的創(chuàng)新點在于：建立了解除牡丹種子休眠的技術(shù)體系。其意義在于：簡便、快速、高效地解除牡丹種子深度休眠，大大縮短了牡丹成苗成花的時間跨度，為牡丹、芍藥等具深度休眠特性物種的后續(xù)開發(fā)利用提供了全新的技術(shù)平臺。圖1 解除牡丹種子深度休眠的操作流程成 芽 苗（歷時30 天）上胚軸伸長（出芽）種胚培養(yǎng)wpm + 5 mg/l ga3 + 1 mg/l ba + 3mg/l ca(no3)2ca(no3)2 剝出種胚 無菌化處理去殼種子100

30、 mg/l ga3 + 1 mg/l ba + 3 mg/l ca(no3)2常溫浸泡24h成 苗（歷時180 天）上胚軸伸長（出芽）出苗（出葉）10 mg/l ga3 + 1 mg/l ba + 3 mg/l ca(no3)2葉面噴灑3天/次 發(fā) 根 露 白帶殼種子100 mg/l ga3 + 1 mg/l ba + 3 mg/l ca(no3)24 濕砂儲存1000 mg/l ga3 24h浸泡 牡 丹 種 子版圖土壤萌發(fā)牡丹種子的上胚軸休眠打破版圖說明：圖a：自然萌發(fā)25月的牡丹種苗，僅具葉柄和葉片，上胚軸仍處于休眠狀態(tài)。 圖b：處理萌發(fā)6月的牡丹種苗，具葉柄、葉片和明顯的主莖，上胚軸休眠被打破。版圖離體培養(yǎng)牡丹種胚的上胚軸休眠打破版圖說明：圖a：離體培養(yǎng)20周的牡丹種胚，僅具真葉，上胚軸仍處于休眠狀態(tài)。 圖b：半量處理后離體培養(yǎng)6周的牡丹芽苗，具真葉、葉柄、葉片和明顯的主莖，上胚軸休眠被打破。圖c：全量處理后離體培養(yǎng)4周的牡丹芽苗，具真葉、葉柄、葉片和明顯的主莖，上胚軸休眠被打