第三方檢驗檢測機構PCR檢測室防核酸污染措施

1、第三方檢驗檢測機構PCR檢測室防核酸污染措施摘要】隨著社會的需求，第三方檢驗檢測機構的數(shù)量日益增多。檢測數(shù)據(jù)的準確性不僅關乎檢測機構的檢測水平，也直接影響行政機關的執(zhí)法效力，因此檢測實驗室必須確保其檢測數(shù)據(jù)科學公正、準確可靠。核酸檢測是第三方檢驗檢測機構中最常見的檢測工程，而氣溶膠污染是核酸檢測中最主要最常見的污染，也是困擾絕大多數(shù)實驗室的難題，必須要加以重視。本文就本中心在核酸檢測防污染方面的體會進行初步總結?！娟P鍵詞】檢驗檢測機構;PCR檢測室;核酸檢測;氣溶膠污染中圖分類號：E9393文獻標識碼：A文章編號：2095-2457202128-0049-002DOI：10.19694/j k

2、i.issn2095-2457.2021.28.018【Abstract】Thenumberofthethirdpartyinspectionandtestinginstitutionsisincreasingwiththedemandsofthesociety.Theaccuracyofthetestingresultsnotonlyrelatestothetestingleveloftheinstitution，butalsodirectlyaffectstheenforcementeffectivenessofadministrativeagencies.Thetestingresult

3、smustbescientific，fair，accurateandreliableinthethirdpartyinspectionandtestinginstitutions.Nucleicacidtestingisthemostcommonproject，andtheaerosolpollutionisthemostcommonpollutioninnucleicacidtesting，anditisalsoaproblemexistedinmostlaboratories，sowemusttakeitseriously.Theexperienceofpreventingthenucle

4、icacidpollutionispreliminarysummarizedinthispaper.【Keywords】Inspectionandtestinginstitutions;PCRtestingrooms;Nucleicacidtesting;Aerosolpollution隨著養(yǎng)殖企業(yè)的增多，局部養(yǎng)殖企業(yè)管理不標準，飼養(yǎng)環(huán)境惡劣，存在抗生素的濫用和疫苗的不合理使用現(xiàn)象，使得病毒也在不斷地演化，導致養(yǎng)殖業(yè)面臨更高的疾病爆發(fā)率，疾病的病因也越來越復雜，往往存在多種病原感染。第三方檢驗檢測機構一般均會設立PCR檢測室，直接針對病原核酸進行檢測，核酸檢測特異性強、靈敏度高，對疾病的診斷起

5、著至關重要的作用，但在操作過程中易受到污染，導致假陽性的結果【1】，其中最常見且最難消除的污染為氣溶膠污染。氣溶膠污染一般是在提取陽性樣品的核酸或PCR時使用移液器加樣時產(chǎn)生，一個氣溶膠粒子能攜帶上萬個DNA分子，這些DNA分子漂浮在空氣中，難以消除，局部可附著在檢測人員的衣物上，隨著人或物的流通而進一步污染整個實驗室，對實驗結果產(chǎn)生嚴重的干擾，因此解決和監(jiān)控氣溶膠污染是第三方檢驗檢測機構確保檢測結果質(zhì)量的必由之路。本中心作為江蘇省內(nèi)動檢領域首家通過CMA認證的高校檢測機構，在解決和監(jiān)控核酸污染方面積累了一定的經(jīng)驗，現(xiàn)總結如下。1PCR檢測室布局需合理PCR整個試驗分試劑準備區(qū)一區(qū)、核酸提取區(qū)

6、二區(qū)、擴增區(qū)三區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)四區(qū)，流轉(zhuǎn)順序為試劑準備區(qū)核酸提取區(qū)擴增區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)，試劑、樣本等在各區(qū)之間以相應傳遞窗單向傳遞，嚴禁人員、器材和試劑倒流。各區(qū)均設有緩沖間，工作服和清潔消毒物品不得跨區(qū)混用。各區(qū)在空間上完全獨立，不能相通，各區(qū)均有獨立的通風系統(tǒng)，四個區(qū)域的壓力依次遞減，一區(qū)、二區(qū)保持正壓，三區(qū)、四區(qū)保持負壓狀態(tài)，各區(qū)之間壓差5Pa。PCR檢測室的進風口和出風口不能設在建筑的同一平面，以防止排出的空氣被重新吸進實驗室【2】。2加強實驗室的質(zhì)量控制措施2.1強化生物平安意識試劑準備區(qū)配液區(qū)要求高度潔凈，定期監(jiān)控，不能存在病原核酸污染;核酸提取區(qū)要有相應的生物平安設施，病料的處理需在生

7、物平安柜內(nèi)進行;產(chǎn)物分析區(qū)使用溴化乙錠的區(qū)域要與其他操作區(qū)域相互隔離。實驗人員應做好防護措施，實驗過程中必須穿戴相應區(qū)域的工作服、口罩，戴一次性無粉手套，疑有污染應立即更換。未檢測的樣品和檢畢樣品應分開存放在冰箱指定位置，檢畢樣品超過留樣時間須經(jīng)高壓滅菌處理后再送廢棄物處理中心處置。2.2加強人員管理和培訓實驗室應建立人員管理和培訓制度。檢測人員必須進行崗前培訓包括實驗技能培訓和生物平安培訓并經(jīng)考核合格前方可進行檢測工作，檢測過程全程嚴格按照實驗室標準操作規(guī)程SOP進行操作。移液器使用時動作要輕柔并全程在生物平安柜中進行，陰性對照加液全部在配液區(qū)完成并優(yōu)先蓋好管蓋，陽性對照和樣本除核酸外其余均

8、在配液區(qū)加液蓋好管蓋，然后至核酸提取區(qū)參加樣本核酸并輕輕蓋好管蓋，最后參加陽性核酸對照蓋好管蓋，將所有PCR管瞬離后進行核酸擴增。擴增結束后先離心，將管帽和管壁上的液體離至管底，防止開蓋時液體濺出污染實驗室，再在PCR產(chǎn)物分析區(qū)進行電泳。實驗結束后按照SOP要求對實驗室進行清潔消毒，清潔時不同區(qū)域的抹布禁止混用，石浩宇等【3】通過熒光定量PCR方法對實驗室環(huán)境監(jiān)測發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域的抹布混用可引起核酸污染，消毒采用紫外消毒和75%酒精擦拭、噴霧消毒相結合。實驗室應定期對人員進行理論知識、實際操作和生物平安方面的培訓，安排人員定期對實驗室進行消毒和環(huán)境監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)污染及時上報處理。2.3按規(guī)定存放試劑和

9、耗材核酸檢測涉及試劑種類較多，必須按實驗室和試劑存儲要求存放于指定位置，禁止亂拿亂放。PCR反應涉及的試劑按說明書要求存放于配液區(qū)冰箱中，配液區(qū)為整個PCR檢測室最為潔凈的區(qū)域，嚴禁任何核酸溶液包括樣本核酸和陽性對照進入該區(qū)域。DNA或RNA提取試劑盒在核酸提取區(qū)翻開使用后只能在該區(qū)域存放，嚴禁流入其他區(qū)域。高壓過后的潔凈耗材保存在試劑準備區(qū)，并單向流轉(zhuǎn)到其他區(qū)域，最后通過污物走廊高壓滅菌處理后再送廢棄物處理中心，嚴禁試劑和耗材的倒流。3加強實驗室的消毒措施3.1化學消毒PCR檢測室可交替使用75%酒精或6%雙氧水進行封閉消毒，每周至少消毒一次。先用裝有75%酒精的氣溶膠消毒機對實驗室空氣進行

10、密集噴淋，以對實驗過程中產(chǎn)生的氣溶膠具有較好的沉降效果，然后再用84消毒液擦拭實驗臺面或拖擦地面，作用10min后用清水擦拭實驗臺面，以防84消毒液殘留抑制實驗結果，儀器設備外表及實驗輔助用品如指形管架等也應使用75%乙醇定期擦拭消毒。PCR檢測室還可直接使用裝有6%雙氧水的氣溶膠消毒機對實驗室空氣進行噴霧消毒，工作20min后繼續(xù)關閉門窗熏蒸半小時至一小時，然后翻開實驗室通風設備進行換氣。另外，也可使用商品化的氣溶膠污染去除劑進行消毒，某些核酸氣溶膠污染去除劑可有效降解95%以上的DNA氣溶膠污染和99%以上的RNA氣溶膠污染，可用于清潔設備、耗材、操作臺及環(huán)境中的核酸污染。3.2物理消毒紫

11、外消毒是一種高效、平安、環(huán)保、經(jīng)濟的技術，能夠有效地殺滅病毒、細菌和原生動物，而且?guī)缀醪划a(chǎn)生任何消毒副產(chǎn)物，無二次污染，且不受水體溫度、pH值的影響。因此，PCR檢測室各區(qū)域應配備紫外燈，實驗結束后翻開實驗室各區(qū)域的紫外燈進行紫外消毒，照射時間1h【4】。紫外燈管累計工作1000h或輻射強度低于70W/cm2時應及時更換燈管。生物平安柜在實驗開始前半小時和結束后半小時也應進行紫外消毒。4定期對實驗室進行監(jiān)控4.1實驗室溫度、濕度控制氣溶膠濃度在相對條件下與溫度成負相關，與濕度成正相關【5】，PCR檢測室應合理控制實驗室溫度、濕度于規(guī)定要求范圍內(nèi)，盡量減少溫濕度的波動，以減少氣溶膠的產(chǎn)生。4.2

12、定期對實驗室進行環(huán)境監(jiān)控每個月監(jiān)控實驗室是否存在污染，清潔消毒效果是否良好。采集環(huán)境中的樣本進行核酸污染監(jiān)控，可用擦拭法對PCR檢測室的儀器設備、實驗臺面、地面、傳遞窗等部位進行相關核酸的檢測，任一部位環(huán)境監(jiān)測結果不合格，均應采取相應措施加強實驗室清潔消毒，直至環(huán)境監(jiān)測結果全部合格。安排檢測員記錄陽性率及假陽性的發(fā)生頻率，及時發(fā)現(xiàn)異常，假設檢測過程中發(fā)現(xiàn)陽性率異常升高、陰性對照頻繁出現(xiàn)假陽性、未知擴增條帶重復出現(xiàn)等問題，極有可能發(fā)生了核酸氣溶膠污染，應緊急進行污染源的排除和清理。本中心作為由高校成立的非獨立法人第三方檢驗檢測機構，為社會提供優(yōu)質(zhì)的檢測效勞和公證的數(shù)據(jù)以及出具具有法律效力的檢測報告是本中心工作的重點，中心檢測水平的上下更是關乎高校的聲譽，PCR檢測作為日常檢測的重點工程更是應該保證其檢測結果的準確性，因此檢測過程中必須嚴格執(zhí)行標準操作規(guī)程，加強防止交叉污染的意識，做好實驗室的清潔消毒和環(huán)境監(jiān)測工作，防止因核酸污染而造成假陽性結果?！緟⒖嘉墨I】【1】KwokS，HiguchiR.AvoidingfalsepositiveswithPCRJ.Nature，1989，3396221：237.【2】薛秀榮，來祝檁，韓惠云.淺談核酸檢測實驗室防污染措施J.中