免疫熒光雙染和細(xì)胞化學(xué)DAB染色步驟

1、制備細(xì)胞爬片1、在無菌培養(yǎng)皿或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中鋪上滅菌后的蓋玻片，在每片蓋玻片上滴一滴計數(shù)后的細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度為2×105/ml）。再在每片蓋玻片上滴加培養(yǎng)液至剛好覆蓋滿蓋玻片。將培養(yǎng)皿（6孔細(xì)胞培養(yǎng)板）置于 37，含 5% CO2及飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2、4小時后將培養(yǎng)液加量至覆蓋整個培養(yǎng)皿的底面。 3、倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞增殖到合適的密度后取出培養(yǎng)皿中止培養(yǎng)（一般為1-3天）。 4、傾去培養(yǎng)液，加 PBS（PH 7.27.4）洗滌細(xì)胞爬片 2 次，每次 1 min。5、加 10%中性多聚甲醛（或-20預(yù)冷的丙酮）固定 1015min。6、吸除固定液，加 PBS 再

2、洗滌細(xì)胞爬片 3 次，每次 5 min。7、置于室溫下干燥1小時，如暫不染色，先放在-20 冰箱中保存。8、取出蓋玻片時注意蓋玻片的正反面（有細(xì)胞的為正面）。將硅化玻片放入飯盒（金屬），排好順序，一定要放平，消毒，將消化好的細(xì)胞滴在硅化玻片上，可一片滴兩滴，放入培養(yǎng)箱2小時，待細(xì)胞貼片，2小時后取出加培液至沒過玻片，放培養(yǎng)箱過夜，取出后即丙酮固定，偶做過，效果不錯的。免疫熒光雙染用兩個不同的物種的原始抗體的雙免疫熒光染色基本方案1) 冰凍切片，晾干，4%多聚甲醛固定 1015min。（細(xì)胞爬片固定后，以下步驟一樣）2) 漂洗和稀釋：在10 mM磷酸鈉緩沖液，pH7.5，150mM NaCl（P

3、BS）中漂洗切片，3×5分鐘。PBS液是用來漂洗和稀釋的。其他緩沖液如Tris緩沖堿（TBS）也可用。3) 在細(xì)胞爬片上加0.03%-1% Triton X-100溶液處理15min。（若是要檢測的抗原表達于胞膜，此步可考慮省略），PBS液洗3×5分鐘4) 阻斷步驟：用含5%的正常二度抗體物種來源血清的PBS孵化切片60分鐘。（37） （一抗前不洗，只甩干）5) 原始抗體：在切片上吸干多余的阻斷液，在室溫下孵化60分鐘或在4下相應(yīng)地用稀釋的兩個物種（如鼠和兔）的未標(biāo)記的一度抗體混合一起孵化過夜。當(dāng)用熒光標(biāo)記的原始抗體用于直接免疫染色（一度抗體）時，你可以跳過用二度抗體的間接

4、免疫染色方法（二度抗體）的步驟（6）。（4過夜最好）在PBS液或TBS中漂洗3×5分鐘。6) 二度抗體：用一對不同熒光素標(biāo)記的二度抗體，用以結(jié)合相應(yīng)物種原始抗體的IgG，在室溫下孵化切片60分鐘，在PBS中漂洗3×5分鐘。7) 復(fù)染：如果必要進行核染色如用DAPI（5g/ml PBS中5min）。在PBS中漂洗切片3×5分鐘。8) 選擇性：為了阻止熒光標(biāo)記從抗體上脫離，也為了更長的保存以保護染色，在水溶性媒介使用前，推薦在含4%甲醛的PBS液中簡短的處理（1-3分鐘）。在PBS中漂洗切片2×3分鐘。9) 錨定：對于熒光顯微鏡，用抗褪色媒介錨定切片。注釋：

5、一般來說，兩種二度抗體來自同一物種進行雙/多標(biāo)記當(dāng)用生物素標(biāo)記的二度抗體時，在進行復(fù)染色（步驟7）前，應(yīng)首先用熒光標(biāo)記的（鏈）親和素的ABC技術(shù)（見6.2.1章節(jié)）來觀察生物素。細(xì)胞爬片的免疫化學(xué)染色法 （DAB染色）1、在細(xì)胞爬片上加0.03% Triton X-100 水溶液處理15min。（若是要檢測的抗原表達于胞膜，此步可考慮省略）2、 吸除0.03% Triton X-100，加3%H2O2 孵育10min。3、 吸除3%H2O2，加2%牛血清白蛋白封閉3060min。PBS 洗5min。4、 吸除PBS，分別滴加相應(yīng)的一抗（用含1%牛血清白蛋白的PBS 液稀釋到合適滴度），置于37

6、孵育1h，或置于4冰箱中過夜。陰性對照片此步用PBS 替代一抗。5、 吸去一抗，PBS 漂洗3 次，每次5min。滴加山羊抗鼠的IgG 抗體-fitc多聚體，37孵育30min。 6、 PBS 漂洗3 次，每次5min。新鮮配制DAB 顯色液，滴加后作用35min，置于顯微鏡下觀察染色結(jié)果。7、 雙蒸水漂洗后，滴加蘇木精染液，染色10min。(1-2分鐘就夠了染得太淺要再染!)8、 雙蒸水漂洗后，滴加0.5%HCl-70%Ethanol（乙醇），作用1min 以分色。9、 雙蒸水漂洗后，滴加1%NaHCO3 作用35min 以藍化細(xì)胞核。10、雙蒸水漂洗1min，然后將細(xì)胞爬片經(jīng)70%、80%、95%、100%、10