果酒酵母實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、果酒酵母的分離純化及選育果酒是利用新鮮水果為原料，在保存水果原有營(yíng)養(yǎng)成分的情況下，利用自然發(fā)酵或人工添加酵母菌來(lái)分解糖分而制造出的具有保健、營(yíng)養(yǎng)型酒。果酒富含多種氨基酸、維生素及礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，還含有豐富的生理活性物質(zhì)，經(jīng)常適量飲用具有一定的保健作用。酵母品種是釀造果酒的關(guān)鍵因素之一，酵母性狀的好壞直接影響到所釀果酒的口感和風(fēng)味，決定果酒品質(zhì)的優(yōu)劣。果酒酵母包括醇釀酒酵母和非釀酒酵母，前者的應(yīng)用提高了果酒釀造的生產(chǎn)效率，后者的應(yīng)用則對(duì)果酒的總體風(fēng)味產(chǎn)生積極的影響。野生型果酒酵母經(jīng)分離純化后，結(jié)合誘變、雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程及其他育種技術(shù)，其釀造性能顯著提高，釀造的果酒品質(zhì)明顯改善，因此

2、果酒酵母的選育研究得到了重點(diǎn)關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)選用葡萄為原料，分離純化了3株酵母菌，并對(duì)其篩選使其適合果酒釀造。1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)掌握果酒酵母分離純化的方法；2、對(duì)分離純化得到的酵母菌進(jìn)行篩選使其適合果酒釀造。二、實(shí)驗(yàn)原理 釀酒酵母細(xì)胞透明，呈圓形或橢圓形，形體比較大，一般為7×12m，含有轉(zhuǎn)化酶能將葡萄汁中的糖轉(zhuǎn)化成乙醇、二氧化碳和其它代謝產(chǎn)物。優(yōu)良純種酵母應(yīng)具備下列性能：1、除釀酒水果本身的果香外，酵母也應(yīng)產(chǎn)生良好的果香與酒香。2、生長(zhǎng)速度快，有較高的發(fā)酵能力，能將糖分全部發(fā)酵完。3、具有較高的抗S02能力，有較好的凝集力和較快的沉降速度。4、培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，對(duì)

3、溫度，pH，離子強(qiáng)度，溶氧等環(huán)境因素不敏感。5、能在低溫或果酒適宜溫度下發(fā)酵，以保持果香和新鮮清爽的口味。由此可見(jiàn)，酵母的品質(zhì)對(duì)果酒的產(chǎn)量和質(zhì)量影響很大。要獲得優(yōu)良的釀酒酵母，必須對(duì)其進(jìn)行分離選育。果酒酵母的篩選應(yīng)從相應(yīng)的果品及其種植環(huán)境中采樣分離，如成熟果實(shí)的表皮、自然腐爛發(fā)酵的果肉或果汁和果園的土壤等相關(guān)場(chǎng)所。根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，在果汁和自然發(fā)酵的果酒醪液中檢出率較高，因?yàn)樗鼈兊幕|(zhì)環(huán)境與釀酒環(huán)境很相似。為使我們需要的酵母易于檢出，應(yīng)對(duì)采集的樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)，通過(guò)設(shè)置較高的酒精濃度、添加SO2、調(diào)整pH 等手段抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，使希望檢出的微生物得到增殖。酵母檢出后，應(yīng)對(duì)其的發(fā)

4、酵性能進(jìn)行考察，包括酵母的一系列生理生化特性和風(fēng)味物質(zhì)形成的能力等，這些可通過(guò)作生理生化實(shí)驗(yàn)和三角瓶小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)分析和測(cè)定。3、 實(shí)驗(yàn)儀器與材料富集培養(yǎng)基：乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，乳酸20g，蒸餾水1000ml（先將馬鈴薯去皮、切片，稱200g，并加蒸餾水1000ml，煮沸半小時(shí)，用紗布過(guò)濾，補(bǔ)足蒸餾水量至1000ml，制成20%的馬鈴薯汁，在20%的馬鈴薯汁中加入乳酸，煮沸融化，加入葡萄糖，補(bǔ)足水分并在121攝氏度條件下，高溫滅菌30分鐘）釀酒酵母培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，制法同上。器具：15個(gè)

5、培養(yǎng)皿、12支試管、4個(gè)100ml錐形瓶、3個(gè)250ml燒杯、30個(gè)試管、30個(gè)杜氏管、1個(gè)試管架、7個(gè)三角瓶，無(wú)菌滴管，接種環(huán)，酒精燈，玻璃涂棒，冰箱，高溫滅菌鍋，水浴鍋，顯微鏡，血球計(jì)數(shù)板，恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床。4、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟1、 酵母的分離與純化1.1接種：取成熟的蘋果的小塊果皮直接接入250ml錐形瓶含有150ml的乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，需要三組，置于28攝氏度恒溫?fù)u床中，轉(zhuǎn)速為120，震蕩培養(yǎng)48h；將蘋果果皮研磨直接接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，需要三組，置于29攝氏度恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h；1.2培養(yǎng)：用無(wú)菌吸管吸取上述培養(yǎng)后培養(yǎng)液1ml，置于9ml的無(wú)菌水中，稀釋為

6、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5；1.3分離、純化：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基溶化后制成平板，用1ml的無(wú)菌吸管，分別吸取10-3、10-4、10-5置于培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌的玻璃涂棒迅速涂抹均勻，培養(yǎng)基做好標(biāo)記，放于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)大約兩天，培養(yǎng)基倒置，菌落長(zhǎng)出后，觀察其菌落并用顯微鏡查菌體數(shù)。一般一個(gè)單獨(dú)的菌落可視為一個(gè)細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，是純培養(yǎng)，如果結(jié)構(gòu)復(fù)雜未得到純培養(yǎng)，可進(jìn)行再次分離培養(yǎng)知道純化為止，步驟如下：A. 將融化了的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每皿大約15ml，冷凝成平面，記上標(biāo)記；B.用平板劃線法接種（一）右手持接種環(huán)，經(jīng)火焰滅菌，待涼后，挑取菌體培養(yǎng)物少許。（

7、二）左手斜持瓊脂平板，于火焰近處將菌涂于瓊脂平板上端，來(lái)回劃線，涂成薄膜（約占平板總表面積的十分之一），劃線時(shí)接種環(huán)與平板表面成3040º角，輕輕接觸，以腕力在平板表面行輕快地滑移動(dòng)作，接種環(huán)不應(yīng)劃破培養(yǎng)基表面。（三）燒灼接種環(huán)，殺滅環(huán)上殘留細(xì)菌，待冷（是否冷卻，可先在培養(yǎng)基邊緣處試觸，若瓊脂溶化，表示未涼，稍等再試），從薄膜處取菌作連續(xù)平行劃線，約占平板表面五分之一左右，再次燒灼接種環(huán)，等三次平行劃線以同樣方法作第四次，第五次劃線，將平板表面劃完。（四）劃線完畢，蓋上皿蓋，底面向上，用標(biāo)簽注明菌名和組名，置恒溫箱中培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落即可。2、 酵母的篩選與保藏2.1酵母菌種的復(fù)篩發(fā)酵力

8、實(shí)驗(yàn)：取100ml三角瓶，各加入80ml果汁，置于80攝氏度的水浴殺菌5min，冷卻到30攝氏度后，按每升接種30ml的比例分別接入酵母種子液，在20攝氏度下發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中每24小時(shí)測(cè)定1次三角瓶質(zhì)量，確定菌株發(fā)酵力的強(qiáng)弱。2.2酵母菌的耐受性試驗(yàn)1.用配好的PDA液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基分別倒入試管與三角瓶中，試管每支10ml，共300ml，三角瓶每瓶50ml、共350ml。再將三角瓶和試管在121°高溫下滅菌30min。杜氏管倒置放入試管中，保證杜氏管中沒(méi)有氣泡。2.采用杜氏管發(fā)酵法測(cè)定所篩選的酵母菌對(duì)乙醇（4%、6%、8%、10%、12%）、二氧化硫（40、60、80、100、1

9、20mg/l）的耐性。按下表在試管中加入果汁。然后加入杜氏小管倒置使其充滿果汁，塞好棉塞，115 20min滅菌。滅菌完后，待試管溫度為常溫后按下表加入酒精，加完后搖勻。最后在每個(gè)編號(hào)試管中接入對(duì)數(shù)期酵母1×107個(gè)，28靜止培養(yǎng)。觀察產(chǎn)氣情況，選出耐酒度比較好的菌種。將標(biāo)簽貼于各試管上，標(biāo)10、12、14、16、18，按下表每管加入果汁量：試管編號(hào)010121416182095%酒精/mL01.051.261.41.681.902.15果汁/mL108.958.748.608.328.107.85培養(yǎng)液含酒精%（v/v）0101214161820按亞硫酸含量為6% 計(jì)， 計(jì)算出60

10、、100、120、180、240 mg/L濃度所需的量，分別加入到果汁中制成SO 2 不同濃度系列的液體培養(yǎng)基。按下表加入果汁，然后加入杜氏小管倒置使其充滿果汁，塞好棉塞，115 20min滅菌。滅菌完后，待試管溫度常溫后按上表加亞硫酸（科密歐試劑SO2含量6%），加完后搖勻。最后在每發(fā)酵管中接入對(duì)數(shù)期酵母1×107個(gè)，28靜止培養(yǎng)。觀察產(chǎn)氣情況，選出耐SO 2比較好的菌種。將標(biāo)簽貼于各試管上，標(biāo)1、2、3、4、5，按下表每管加入果汁量：試管編號(hào)012345亞硫酸/uL01017203040果汁/mL101010101010培養(yǎng)液含SO2mg/L060100120180240將酵母菌

11、分別接入含不同濃度的乙醇和不同濃度二氧化硫的果汁培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)，觀察杜氏管中氣泡產(chǎn)生情況。5、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：發(fā)酵力實(shí)驗(yàn)：菌種對(duì)照12345菌198.0g97.8g97.8g97.7g97.7g97.7g菌298.5g98.3g98.2g98.0g98.0g97.9g菌3103.3g103.2g103.1g103.0g103.0g102.9g耐受性實(shí)驗(yàn)：菌株2：酒精量（%）4681012杜氏小管產(chǎn)氣情況+二氧化硫濃度（mg/L)406080100120杜氏小管產(chǎn)氣情況+菌3：酒精量（%）4681012杜氏小管產(chǎn)氣情況+二氧化硫濃度（mg/L)406080100120杜氏小管產(chǎn)氣情況+實(shí)

12、驗(yàn)結(jié)果分析：發(fā)酵力實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，菌種一的失重量為0.3g，菌種二的失重量為0.6g，菌種三的失重量為0.4g，因此，菌種二的發(fā)酵力較好。耐受性實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，菌種一沒(méi)有氣泡產(chǎn)生，菌種二耐酒精及耐二氧化硫的程度比菌種三要穩(wěn)定。菌種保藏：本實(shí)驗(yàn)采用試管斜面保藏。 酵母菌的富集培養(yǎng)純化的酵母菌酵母菌顯微鏡下的酵母菌純化的酵母菌稀釋富集培養(yǎng)液果酒釀造：果酒釀造的工藝流程 鮮果分選破碎、除梗果漿分離取汁澄清清汁 發(fā)酵倒桶貯酒過(guò)濾冷處理調(diào)配過(guò)濾成品 發(fā)酵前的處理前處理包括水果的選別、破碎、壓榨、果汁的澄清，果汁的改良等。 碎、除梗： 破碎要求每粒種子破裂，但不能將種子和果梗破碎，否則種子內(nèi)的油酯、糖苷類物質(zhì)及果梗內(nèi)

13、的一些物質(zhì)會(huì)增加酒的苦味。破碎后的果漿立即將果漿與果梗分離，防止果梗中的青草味和苦澀物質(zhì)溶出。二氧化硫處理： 二氧化硫在果酒中的作用有殺菌、澄清、抗氧化、增酸、使色素和單寧物質(zhì)溶出、還原作用、使酒的風(fēng)味變好等。使用二氧化硫有氣體二氧化硫及亞硫酸鹽，前者可用管道直接通入，后者則需溶于水后加入。發(fā)酵基質(zhì)中二氧化硫濃度為60-100mg/L。（以葡萄酒為例：二氧化硫添加量的計(jì)算：葡萄果實(shí)×70%×60/0.06×1000。）此外，尚需考慮下述因素：原料含糖高時(shí)，二氧化硫結(jié)合機(jī)會(huì)增加，用量略增；原料含酸量高時(shí)，活性二氧化硫含量高，用量略減；溫度高，易被結(jié)合且易揮發(fā)，用量略

14、減；微生物含量和活性越高、越雜，用量越高；霉變嚴(yán)重，用量增加 。果汁的調(diào)整： 取汁測(cè)定果汁中糖度和酸度，根據(jù)發(fā)酵需要調(diào)整糖度和酸度。糖的調(diào)整： 釀造酒精含量為10%-12%的酒，果汁的糖度需 17-20°Bx。如果糖度達(dá)不到要求則需加糖，實(shí)際加工中常用蔗糖或濃縮汁。酸的調(diào)整： 酸可抑制細(xì)菌繁殖，使發(fā)酵順利進(jìn)行；使酒顏色鮮明；使酒味清爽，并具有柔軟感；與醇生成酯，增加酒的芳香；增加酒的貯藏性和穩(wěn)定性。干酒易在0.6%-0.8%，甜酒0.8%-1%一般pH大于3.6或可滴定酸低于0.65%時(shí)應(yīng)該對(duì)果汁加酸。3）酒精發(fā)酵發(fā)酵分主（前）發(fā)酵和后發(fā)酵，主發(fā)酵時(shí)，將果汁到入容器內(nèi)，裝入量為容器容

15、積的4/5，然后加入 3%-5%的酵母，攪拌均勻，溫度控制在20-28 ，發(fā)酵時(shí)間隨酵母的活性和發(fā)酵溫度而變化，一般約為3-12天。殘?zhí)墙禐?.4%以下時(shí)主發(fā)酵結(jié)束。然后應(yīng)進(jìn)行后發(fā)酵，即將酒容器密閉并移至酒窯，在12-28 下放置 1個(gè)月左右。發(fā)酵結(jié)束后要進(jìn)行澄清，澄清的方法和果汁相同。發(fā)酵性能測(cè)定測(cè)定一個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)酒精度及含糖量變化，繪制發(fā)酵曲線，并對(duì)自制果酒進(jìn)行感官評(píng)定，分析測(cè)定理化指標(biāo)（糖度、酒度、酸度）。還原糖、總糖的測(cè)定：直接滴定法?？偹岬臏y(cè)定：中和滴定法。酒度的測(cè)定：蒸餾法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：4月1日：菲林試劑比色法側(cè)總糖和還原糖。V3=5.4mlX=Fx1/V1X1/V3X1000(F=0.05925) 得x=219.225g4月2日：菲林試劑比色法側(cè)總糖和還原糖。V3=4.4mlX=Fx1/V1X1/V3X1000(F=0.05925) 得x=268.995g4月3日：菲林試劑比色法側(cè)總糖和還原糖。V3=5mlX=Fx1/