抗體效價的Elisa測定

1、實驗五 酶聯(lián)免疫吸附測定bsa抗體效價1.1.目的要求目的要求(1)學習酶聯(lián)免疫吸附測定的基本原理。 (2)掌握酶聯(lián)免疫吸附測定技術，抗體的效價測定及酶聯(lián)免疫測定儀的使用。 2.2.基本原理基本原理免疫酶技術:酶標ab/ag,酶結合物的酶在免疫反應后，作用于厎物后顯色，根據(jù)顏色的有無和深淺，定量測定ab/ag。免疫反應：一次或數(shù)次 具ag,ab特異的免疫學反應酶促反應：只進行一次 顯示出生物放大作用，靈敏度ng,pg 60年代初期，averameas & ram等建立了免疫酶技術(immunoenzymatic techniques) 利用特殊的交聯(lián)劑研制出辣根過氧化物酶-人血清白蛋白

2、及酸性磷酸酯酶-抗體，統(tǒng)稱為酶標記物或酶結合物，用于抗原或抗體的示蹤、定位或定量測定酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay簡稱為elisa)-是在免疫酶技術(immunoenzymatic techniques)的基礎上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術。本法兼有靈敏度高和特異性強兩方面的優(yōu)點。1974年 voller等用聚苯乙烯微量反應板作為免疫吸附劑吸附抗體(抗原)，再與相應的酶標記物結合操作更方便，易重復靈敏度可高達ng（10-9g）至pg(10-12g)，(enzyme-linked immunosorbent assay)免疫標記技術免疫標

3、記技術應用各種液相和固相免疫分析方法，對體液中的半抗原、抗原或抗體進行定性和定量測定標記抗體或抗原熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(或生物)發(fā)光劑鏡檢觀察或進行自動化測定熒光顯微鏡，射線測量儀，酶標檢測儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等直接在細胞、亞細胞、超微結構及分子水平上,對抗原抗體反應進行定性和定位研究酶-性能穩(wěn)定、經(jīng)濟易得、底物無色、產物顯色，便于檢測常用的酶:堿性磷酸酯酶、辣根過氧化物酶(horserad peroxidase簡稱hrp)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。酶標技術酶標技術戊二醛法， 過碘酸氧化法將酶與ab交聯(lián)在一起ag-ab-抗ab-hrptmb+h2o2產物

4、（黃色，od450)+h2o圖一直接型圖一直接型elisa 圖二間接型圖二間接型elisa圖三圖三 雙抗體夾心型雙抗體夾心型elisa圖四圖四 固相抗體競爭型固相抗體競爭型elisa未知抗原量=a（1）-a（2）每次反應后都要反復洗滌？1. 保證反應的定量反應2. 防止重疊反應，引起非特異現(xiàn)象。partially purified, inactivated hiv antigens antigens pre-coated onto an elisa plate部分純化，滅活病毒抗原抗原涂到酶標板patient serum which contains antibodies. if the pa

5、tient is hiv+, then this serum will contain antibodies to hiv, and those antibodies will bind to the hiv antigens on the plate.病人血清中含有抗體。如果病人是艾滋病毒+，那么這個血清含有艾滋病毒抗體，這些抗體可以綁定到病毒抗原板anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme. this is the second antibody, and it binds to human antibodies.抗人免疫球蛋白耦合酶。這是

6、繼抗體，并結合人類抗體 substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.基板而改變顏色，當裂解酶附二抗體 hiv (human immunodeficiency virus) detectionpositivenegativepositive control negative control patient a patient b patient c assay control 1.689 0.153 o.055 0.412 1.999 0.123 protein

7、protein interaction-elisa1. direct elisa different epitopecoat with prey proteinincubate with bait protein pimary ab anti bait protein -直接酶聯(lián)免疫吸附試驗不同表位外套與獵物蛋白孵化與誘餌蛋白原發(fā)性抗體抗誘餌蛋白2.competitive elisa same epitopecoat with bait princubate with primary antibody anti bait pr and various concentration prey pr

8、otein(競爭同一表位。外套與誘餌蛋白培養(yǎng)初級抗體抗誘餌蛋白及不同濃度的獵物蛋白)4. 4. 操作方法操作方法4.1 4.1 包被特異性抗原包被特異性抗原:固體抗原(如蛋白質)用包被液稀釋至10og/ml，每凹孔加100l，加蓋置4過夜(37 2h)，次日傾去凹孔內液體，用滴管取洗滌液在每孔中加34滴，靜置3min后傾去，重復3次，將反應板扣放在濾紙上，以除凈液體。4.2 4.2 封閉封閉: 每孔中加入200400l封閉液，加蓋或用封口膜封板，置37恒溫箱60min，傾去孔內液體，按上法洗滌3次。4.3 4.3 加待測血清加待測血清( (內含抗體內含抗體) )、陰性血清、陰性血清( (無抗體

9、無抗體) )及稀釋液及稀釋液( (pbs/pbs/tweentween) ):待測血清按倍比法用稀釋液稀釋(1:100、1:200等)，陰性血清也稀釋成1:100，取不同稀釋度的待測血清，陰性血清及稀釋液(pbs/tween)各1ool加至相應的凹孔中，加蓋或封板，置37恒溫箱1h，使抗體與固相抗原進行特異性結合，反復洗滌3次。12345678pbs/tween1:100陰性血清1:1,0001:5,0001:10,0001:20,0001:50,0001:100,000陽性血清4.4 4.4 加酶標抗體加酶標抗體:按說明書要求用稀釋液稀釋hrp-抗體(抗抗體)，每孔加l00l，封板后置37溫

10、育lh，按上法至少洗滌5次，最后用蒸餾水洗滌2次，扣在濾紙上吸干水分。4.5 4.5 顯色顯色: 每孔加入opd應用液1ooul、反應板置室溫暗處530min。當顯示橙色時應及時終止反應。4.6 4.6 終止反應終止反應:每孔加入5ol 2mol/l h2so4。穩(wěn)定35min即可比色測定。4.7 4.7 檢測檢測: 用酶聯(lián)免疫測定儀，以pbs/tween孔為對照、測波長為49onm時各孔光吸收（a）。1. 計算陽性血清與陰性血清a值之比(positive/negative，p/n)，當p/n2.1時為陽性，p/n2.1而1.5為可疑，p/n1.5為陰性。用目測法則以較陰性對照深色的最高稀釋度

11、作為抗體效價。2. 用“”“”表示，超過規(guī)定吸收值（0.20.4）的標本均屬陽性。 注意事項注意事項 (1)聚苯乙烯微量反應板應選擇高質量、非特異性吸附小的產品。包被物應具有較高的純度，其濃度一般在1100g之間，在偏堿條件下易吸附于反應板的凹孔中，4放置過夜較理想，若暫時不用，可加入終濃度為0.02% nan3，4貯存，也可傾去包被液，干燥后置硅膠干燥器中，室溫存放3個月以上不影響測定效果。 (2)反應各步均應充分洗滌，以除去殘留物，減少非特異性吸附。為使結果重復應固定洗滌次數(shù)及放置時間，切忌相互污染。 (3)為使顯色反應便于比較，顯色后置室溫暗處的時間應一致，終止反應35min后應立即比色

12、。必要時可設陽性對照，以固定顯色及終止時間。 (4)待測抗體或抗原與酶標抗體應具有相同的免疫特異性，否則無法結合。自動酶標儀（自動酶標儀（elx800uvelx800uv）使用程序使用程序1 開機，進行system self-test2 按“define”鍵，進入“select assay number”， 用“numeric”或“option”鍵輸入測試號（注：assay 01 為quick read，最大測試號為55）；按“enter”鍵修改測試的“name”；再按“enter”鍵進入下列菜單：按“method”鍵選擇測試的波長類型（single或dual）、波長大小(340、405、45

13、0、490或630nm)、微孔板類型(96孔、48孔或24孔)。按“map”鍵選擇閱讀方式(auto或manual) 、閱讀方向（down或across）、重復方向（down或across）、閱讀起始位置（輸入編號）、空白map（air、full、const、column、p-down、p-across）。 3 按“read”鍵，酶標板推進入儀器，開始讀數(shù)并計數(shù)，打印機輸出數(shù)據(jù)。 4 按“main menu”鍵回到主菜單，關閉電源。 酶標板的清洗：酶標板的清洗：采用elx50tm型微孔板洗板機，注射泵驅動的液體輸送，條狀單排清洗或全板清洗 了解轉膜電泳原理的應用及操作了解轉膜電泳原理的應用及操

14、作western blotting or immunoblotting a specific primary antibody1979, towbin1975, southern, southern blotting1977, alwine, northern blotting1979, towbin, western blotting 1982, reihart, eastern blotting ,雙向蛋白質印記western blotting: antibodies can be used to detect specific proteinsalternate detection me

15、thod secondary antibodies memebrane: 吸附生命大分子的固體材料nc, nitrocellulose 硝酸纖維素膜 0.45um 結合率：80 ug pr/cm2 便宜，可簡單快速封閉非特異性抗體的結合ndm, nylon-densed membrane 尼龍膜 結合率：480 ug pr/cm2dbm, diazobenzyloxymethyl 重氮芐氧甲基膜濕法轉移蛋白質：將gel 和membrane 夾在blotter paper 中，浸在轉移裝置的buffer中，通電45min 或over night 可完成。transfer buffer (500

16、ml, ph 8.3)transfer buffer (500 ml, ph 8.3) glycine 1.450 g (39 mm) tris base 2.900 g (48 mm) sds 0.185 g (0.037%)using the semi-dry transfer unit 1.remove the stacking gel from the gel. 去除堆積凝膠的凝膠。2.cut pieces of blotter paper to the size of the gel. note: the blotter paper (and the membrane) not be

17、 larger than the gel. larger pieces may make contact around the gel, and allow the current an alternate route, thereby making transfer inefficient. 裁片的記事簿紙張的大小的凝膠。 注：本記事簿紙（和膜）不大于凝膠。大塊的可能使接觸周圍的凝膠，并允許目前的替 代路線，從而使傳輸效率。3. wearing gloves rinsed of powder, cut a piece of membrane to the size of the gel. m

18、ark the lower right-hand corner to allow for orientation. pre-wet the membrane in transfer buffer for 2 to 5 minutes. 戴手套清洗粉，剪下一塊膜大小的凝膠。標記右下角以便方向。濕膜轉移緩沖液為2到5 分鐘。4. sandwich blotter paper membrane- gel- blotter paper make sure no air bubbles are trapped the membrane must therefore be positioned corre

19、ctly the first time. do not try to adjust.三明治吸墨紙紙膜凝膠-記事簿紙確保沒有氣泡被困膜因此必須正確定位第一時間。不要試圖調整。5. hold the cover level and slide it gently down onto the stack. 持有的封面和滑動它輕輕地放到堆棧6. weigh down the lid in order to ensure even contact with the stack.權衡下來的蓋子，以確保即使接觸堆棧。7. connect the unit to a suitable power supply. turn the power supply to zero before turning on.