PCR反應(yīng)的影響因素

1、PCR反應(yīng)的影響因素變性溫度與時(shí)間：模板變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達(dá)不到變性溫度就不會(huì)產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會(huì)啟動(dòng)。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。變性溫度太高，又會(huì)影響酶的活性。一般情況下可設(shè)為94 2030秒，高溫時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以保持耐熱DNA聚合酶的活力，zui高變性溫度不宜超過95。退火溫度與時(shí)間：退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量。溫度高特異性強(qiáng)，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。合適的退火溫度一般在4568之間。設(shè)置特定反應(yīng)的zui適退火溫度，可根

2、據(jù)引物的（G+C）%含量進(jìn)行推測(cè)，一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5，退火時(shí)間一般為3060秒，足以使引物與模板之間完全結(jié)合，長(zhǎng)時(shí)間退火沒有必要。延伸溫度與時(shí)間：PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075之間，延伸時(shí)間根據(jù)所用聚合酶擴(kuò)增速度和擴(kuò)增片段大小設(shè)定，如同樣擴(kuò)增2 Kb片段，若使用Taq酶只需1分鐘，使用Pfu酶則應(yīng)設(shè)定2分鐘以上。延伸時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)，時(shí)間太短則可能得不到擴(kuò)增產(chǎn)物或得到一些短的非特異性片段。循環(huán)次數(shù)：可根據(jù)模板DNA的量、擴(kuò)增片段的大小和擴(kuò)增產(chǎn)物的下步應(yīng)用等因素，設(shè)定20-40個(gè)循環(huán)。循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足，如果循環(huán)次數(shù)太多，錯(cuò)配幾率會(huì)增加

3、，非特異性背景嚴(yán)重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。酶量：50 L反應(yīng)體系可用0.5-5 U酶，酶量的選擇與模板DNA的量，擴(kuò)增片段大小等有關(guān)，酶量過多易發(fā)生非特異性反應(yīng)，而且可能增加突變的機(jī)率，尤其在進(jìn)行高保真擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)盡量減少酶量，但酶量過少時(shí)反應(yīng)性能下降。模板：模板可以是單鏈DNA，也可以是雙鏈DNA，質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增效率略低于線狀DNA。模板加量一般不需太多，不超過1 g為宜，因?yàn)榧恿窟^多可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加，但是要考慮模板中靶序列的含量。例如，使用基因組為模板擴(kuò)增單拷貝或低拷貝靶序列，就需要適當(dāng)加大模板用量。引物：引物與模板配對(duì)的長(zhǎng)度應(yīng)至少為17個(gè)核苷酸，zui

4、高不宜超過30個(gè)核苷酸，zui佳長(zhǎng)度為2024個(gè)核苷酸，如需插入酶切位點(diǎn)，應(yīng)在酶切位點(diǎn)5端多加幾個(gè)堿基，有利于酶切。引物的（G+C）%含量組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個(gè)引物中（G+C）%含量應(yīng)盡量相似。引物內(nèi)部應(yīng)避免形成明顯的次級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)。兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)，特別是在引物3端。如果可能，引物3端zui好富有GC，這樣退火后有利于引物3端的延伸。人工合成的引物zui好經(jīng)過色譜層析純化或PAGE純化，以除去未能合成至全長(zhǎng)的短鏈等雜質(zhì)。引物的終濃度一般為0.1-2 M左右，濃度太高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，太低則擴(kuò)增產(chǎn)物太少。模板的制備PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA

5、。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、真菌等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液、羊水細(xì)胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。反應(yīng)的控制PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20200umol/LTaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）引物 濃度一般為0.

6、1 0.5umol/L反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)變性溫度和時(shí)間 95，30s退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 左右，一般在4555延伸溫度和時(shí)間 72，1min/kb(10kb內(nèi)）Tm值=4(G+C) +2(A+T)循環(huán)次數(shù) ：一般為25 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：DNA變性（90-96）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA退火（60-6

7、5）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3端開始以從53端的方向延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。如圖所示：現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60-65間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.

8、07.5，小量分裝，-20冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。模板（靶基因）核酸模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。試劑對(duì)照：在PCR試劑

9、中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。反應(yīng)條件選擇PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至4060，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94變性，65左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的

10、最主要原因。一般情況下，9394min足以使模板DNA變性，若低于93則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。退火（復(fù)性）溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度

11、：Tm值（解鏈溫度）=4(G+C)+2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值-(510）在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合， 提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。延伸溫度與時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：7080 150核苷酸/S/酶分子70 60核苷酸/S/酶分子55 24核苷酸/S/酶分子高于90時(shí)， DNA合成幾乎不能進(jìn)行。PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075之間，常用溫度為72，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠的。3