HPLC硬件構(gòu)造上課講義

1、HPLC,的結(jié)構(gòu)、原理及,日常維護(hù),劉浩然,2013.03.30,內(nèi)容簡介,HPLC,的硬件結(jié)構(gòu),HPLC,的原理,HPLC,日常維護(hù)要點,一、概,述,HPLC,即,High performance liquid,chromatography,或,High pressure liquid,chromatography,譯為：高效液相或高壓液相,HPLC,是,20,世紀(jì),60,70,年代發(fā)展起來的分離分析,工具。是有機(jī)化合物分析、藥物分析的常用儀器,約,80,左右的藥物可用,HPLC,檢測,二,HPLC,主要知名品牌,沃特斯,Waters,安捷倫,Agilent,島津,Shimazu,其它：戴安

2、、菲尼根、熱電等,三,HPLC,的基本結(jié)構(gòu),分離部分,分析部分,控制部分,常見,HPLC,結(jié)構(gòu)外觀,島津,LC-20A,Waters,機(jī),型,Waters,機(jī)型,Thermo fisher,液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用,大連依利特,北京普源精電,北京北分,上海伍豐,江蘇天瑞,LC310,FL2200,浙江福立,北京東西分析,萊伯泰科,HPLC,HPLC,結(jié)構(gòu)的幾種形式,串聯(lián)式二元高壓泵系統(tǒng),并聯(lián)式二元高壓泵系統(tǒng),四流路串聯(lián)式單高壓泵系統(tǒng),HPLC,的不同類型主要在于高壓輸液泵的區(qū)別,通常有以下幾種形式,串聯(lián)式二元高壓泵,HPLC,結(jié)構(gòu)示意圖,分離部分,分離部分由,高壓輸液泵,色譜柱,及相關(guān)組,件組成,由高

3、壓輸液泵吸取流動相，使之進(jìn)入色譜,柱，由,進(jìn)樣器,注入樣品后，由色譜柱進(jìn)行,分離,在高壓輸液泵之前常用,脫氣機(jī),在色譜柱部分要裝,柱溫箱,保持色譜柱的溫,度恒定,高壓輸液泵,目前,HPLC,配備高壓輸液泵大致有兩種類型,一種是,兩個高壓輸液泵,各自輸送流動相后進(jìn)入混合器,俗稱“二元高壓泵,另一種是只有,一個高壓輸液泵,在這個輸液泵之前配備,一,個電磁閥,控制流路，通常這種形式的泵有四個流路。俗稱,四元低壓泵”。但其實質(zhì)上仍是,單泵,本室有兩臺島津的,HPLC,均為四元低壓的單泵。有兩臺,安捷倫,HPLC,其中一臺為四元低壓的單泵，另一臺為二,元高壓泵,高壓輸液泵（外觀,高壓輸液泵（內(nèi)部,排空閥

4、,高壓輸液泵,高壓泵（一個，串聯(lián)式,裝電磁閥的部位,泵傳動的帶齒皮帶,俯視圖（內(nèi)部,高壓輸液泵原理,單向閥的工作原理,紅寶石,正,向,反,向,單向閥實物,為何有兩個泵頭，卻只能算是一個泵,在同一個軸上有,兩個相位相差,180,度,的偏心輪，當(dāng)其,中一個吸液時，另一個排液,交替進(jìn)行,這樣就減,少了輸液的脈動,排空閥,Purge,閥）起什么作用,Purge,閥,Purge,閥主要用于兩個方面,1,剛開機(jī)時，要打開,Purge,閥,逆時針方向擰,180,度,啟動,高壓輸液泵沖洗約,5min,排掉一段流動相以去除管,腔中的氣泡,2,更換不同的流動相時，要將前面一段流動相排盡,開啟,Purge,閥時，一

5、般用較高的流速,5ml/min,來沖洗,管腔,混合器,混合器,混合器的作用,混合器主要是用來混勻流動相的,流動相不均勻?qū)z測影響很大,混合器通常是通過一些,U,形管來使流動相混,勻，即“蛇形管”模式。也有的是采用一,些過濾介質(zhì)來實現(xiàn)的。由于在混合過程中,沒有動力裝置，故稱為“靜態(tài)混合,此外，好的混合器可使儀器系統(tǒng)壓力比較,恒定,島津,20AT,型,HPLC,輸液泵,脫氣機(jī),手動進(jìn)樣器,柱溫箱,差示折光檢測器,紫外檢測器,混合器,脫氣機(jī),脫氣機(jī)原理,為什么要脫氣,因為流動相中可溶解一定的空氣,如果不脫氣，在檢測器中氣泡會冒出來，嚴(yán)重影,響檢測基線,脫氣機(jī)由真空泵、真空度檢測器及脫氣腔組成,流動相

6、通過含氟樹脂為材料的管狀膜，其中的氣,體可通過膜被真空泵抽去，而液體保留下來,脫氣機(jī)內(nèi)部構(gòu)造,島津儀器將柱溫箱和手,動進(jìn)樣器設(shè)計為一體,這一設(shè)計的最大弊,端是維護(hù)手動進(jìn)樣器十,分不便,7725i,手動進(jìn)樣閥原理,7725i,手動進(jìn)樣閥實圖,柱溫箱,柱溫箱是保障色譜柱在恒定的溫度下工作,的前提條件，也是,HPLC,結(jié)果重現(xiàn)性的保,障,沒有柱溫箱是很難進(jìn)行定性定量分析,的因為溫度可影響物質(zhì)的保留時間，峰,形等參數(shù),除制備型,HPLC,以外，一般分析型,HPLC,都,要有柱溫箱,國產(chǎn)柱溫箱,安捷倫自帶的臥式柱溫箱,色譜柱,色譜柱可分為正相色譜柱、反相色譜柱,特殊專用柱（手性色譜柱、離子色譜柱,氨基酸

7、分析柱、糖類分析柱等,操作儀器前一定要認(rèn)清是什么型號、什么,材質(zhì)的色譜柱！否則，亂用流動相，一次,就可導(dǎo)致色譜柱報廢,如：環(huán)糊精為填料,的手性色譜柱，如果流動相含有水，即可,溶解，一次性報廢,反相色譜柱,目前最常用的為反相色譜柱,反相色譜柱一般是以硅膠顆料上鍵合,C18,C8,而成。常用的為,C18,C18,反相色譜柱適合分離很多物質(zhì)，且色譜,柱較為耐用,C18,注意事項,但流動相,PH,值一定要保證在,28,之間。低于,或高于，色譜柱即遭破壞,反相色譜柱一定不能用純水作流動相，否,則鍵合的,C18,坍塌，報廢,流動相中水的比例最大為,90,液相色譜柱,色譜柱不能震動、跌落,色譜柱不用時，從儀

8、器上取下后要用適當(dāng),的溶劑保存，并在兩端擰上堵頭,紅,色,部,分,即,為,堵,頭,如何認(rèn)識不同型號儀器的構(gòu)造,無論何種,HPLC,其結(jié)構(gòu)總離不開高壓輸液,泵、進(jìn)樣器、柱溫箱、檢測器幾個部分,搞清儀器不同部分的作用是做好實驗和維,護(hù)儀器的前提,共用一個機(jī)箱的串聯(lián)式二元高壓輸液泵,典型代表是安捷倫,安捷倫,1200,內(nèi)部構(gòu)造,二元高壓輸液泵的,HPLC,Agilent,并聯(lián)式二元高壓輸液泵,這種形式的輸液泵制造工藝要求比串聯(lián)泵,更高,Waters,公司是以做并聯(lián)泵為主要產(chǎn)品的,島津近期也推出了并聯(lián)泵產(chǎn)品，如,LC,20AD,國產(chǎn),HPLC,中只有極少數(shù)廠家生產(chǎn)：如：上,海伍豐、江蘇天瑞等,二元高壓

9、,并聯(lián)泵,HPLC,結(jié)構(gòu)示意圖,貯液瓶,高壓輸液泵,脫氣機(jī),檢測器,色譜柱,柱溫箱,混合器,進(jìn)樣器,電,腦,廢液瓶,并,聯(lián),泵,結(jié),構(gòu),的,高,效,液,相,四流路單高壓輸液泵的,HPLC,典型代表為安捷倫,二元高壓,并聯(lián)泵,HPLC,結(jié)構(gòu)示意圖,貯液瓶,高壓輸液泵,電磁閥,檢測器,色譜柱,柱溫箱,混合器,進(jìn)樣器,電,腦,廢液瓶,脫氣機(jī),安捷倫,1100,整體結(jié)構(gòu),安捷倫,1100,內(nèi)部構(gòu)造,四元低壓,單泵,的,HPLC,Agilent,高壓輸液泵,電磁閥（含四個流路,分析部分,分析部分主要就是由,檢測器,組成,常用的檢測器有紫外檢測器、差示折光檢,測器、熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器,等,紫外檢

10、測器最為常用。它又可分為可變波,長檢測器,VWD,和二極管陣列檢測器,PDA,紫外檢測器（外觀,紫外檢測器（內(nèi)部,流通池,紫外可見波長檢測器示意圖,紫外可見波長檢測器獲得的色譜圖,光電二極管陣列,DAD,檢測器,DAD,檢測器仍然屬于紫外檢測器,與普通紫外可見波長檢測器不同的是，它,的二極管有,512,個，可同時采集不同波長下,的紫外吸收信號,普通紫外可見波長檢測器是先分光，再通,過流通池,DAD,是混合光先通過流通池,再分光,光電二極管陣列檢測器,DAD,DAD,檢測器,DAD,檢測器可作三維色譜圖,DAD,檢測器與普通紫外檢測器的對比,DAD,檢測器,能在檢測色譜峰的同時獲得光譜,便于,定

11、性,普通紫外,是先分光，再通過流通池，因為是單束,光，所以,靈敏度高,DAD,檢測器是先通過流通池，再分光，因為是混,合光，所以靈敏度低,一般比普通紫外靈敏底低,一個數(shù)量級,差示折光檢測器,主要用于無紫外吸收的糖類檢測,控制部分,控制部分主要就是工作站。工作站由硬件,和軟件兩部分組成,硬件一般是一塊可雙向傳輸數(shù)據(jù)的板卡,安裝于電腦主機(jī)上,軟件則是與相應(yīng)機(jī)型配套的程序,有一些軟件還要一個“加密狗”，外形類,似于,U,盤。沒有“加密狗”，軟件就不能運,行,HPLC,操作注意事項,使用,HPLC,之前必須熟悉相關(guān)基礎(chǔ)知識。包,括儀器構(gòu)造、流動相的選擇、色譜柱的保,養(yǎng)等,必須經(jīng)過培訓(xùn)方可獨立操作,做,

12、HPLC,的“四項基本原則,流動相和樣品必須微孔濾膜,過濾,開機(jī)初始一定要,排,除流動相,氣,泡,檢測前一定要,平衡,儀器,測完樣品一定要,沖,洗色譜,柱,堅持這四項基本原則，液相一般不會出現(xiàn)重大問題,流動相的選擇,不同的液相流動相不同。主要是根據(jù)色譜柱和檢,測器來選擇。千萬不要認(rèn)為所有液相的流動相是,通用的,以常用的紫外檢測器反相高效液相色譜為例，常,用的流動相為甲醇、乙腈及水或緩沖鹽,思考：為何選擇甲醇、乙腈為流動相,流動相用緩沖鹽注意事項,緩沖鹽易于在柱塞桿上析出，對柱塞桿及,柱塞桿密封圈磨損極大，如果沒有及時清,洗，會導(dǎo)到高壓輸液泵漏液,除非萬不得已，盡量不用緩沖鹽,如果要用緩沖鹽，盡

13、量,用揮發(fā)性緩沖鹽,如：醋酸醋酸銨,不要用非揮發(fā)性,緩沖鹽（如,磷酸緩沖鹽,人造寶石材質(zhì),柱塞桿密封圈（俗稱“黑草帽”,流動相的過濾,流動相必須用,0.22um,的微孔濾膜過濾,微孔濾膜有兩種，一種為有機(jī)相使用的,另一種為水相使用的，不可混用,有機(jī)相的膜一般為尼龍膜，水相的膜一般,為混合醋酸纖維素酯膜,用于流動相過濾的濾膜直徑為,50mm,流動相過濾裝置,樣品的過濾,樣品必須用,0.22um,的微孔濾膜過濾,微孔濾膜有兩種，一種為有機(jī)相使用的，另一種,為水相使用的，不可混用,有機(jī)相的膜一般為聚偏氟乙烯膜，水相的膜一般,為混合醋酸纖維素酯膜,用于流動相過濾的濾膜通常直徑為,13mm,為減少交叉污染，樣品常用,一次性過濾頭,過濾,用一次性過濾頭過濾樣品,測樣前的準(zhǔn)備,開啟儀器。將逆時針將,Purge,閥旋轉(zhuǎn),180,度,啟動高壓輸液泵，以,5ml/min,的流速沖洗,35min,以除去管路中的氣泡,打開紫外檢測器，監(jiān)測基線，至少使之平,衡半小時,切換至所需的色譜條件直到基線平穩(wěn)之后,再進(jìn)樣,一定要采用進(jìn)口的進(jìn)樣針,具體操作再進(jìn)行詳細(xì)培訓(xùn),測樣后沖洗色譜柱,每天測完樣品后必須沖洗色譜柱,常用的反相色譜柱的沖洗方法為：以甲醇（或乙,腈）：水,10,90,沖洗色譜柱