凱氏法蛋白質(zhì)測定

1、第十一講 食品蛋白質(zhì)及氨基酸的測定,1. 蛋白質(zhì)概況 蛋白質(zhì)是含氮的有機化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五種元素組成。某些蛋白質(zhì)中還含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 在食品和生物材料中常包括蛋白質(zhì)，可能還包括有非蛋白質(zhì)含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物堿等；含氮類脂、卟啉和含氮的色素,第一節(jié) 概述,食品中蛋白質(zhì)的含量,第一節(jié) 概述,測定蛋白質(zhì)最基本的方法是通過先測定樣品中的總氮量，再由總氮量計算出樣品中的蛋白質(zhì)含量。 食品和其原料中蛋白質(zhì)含量的測定，主要（也是最常用的）用凱氏定氮法測定總氮量和杜馬法。 這里也包括非蛋白的氮，所以只能稱為粗蛋白的含量（但馬鈴薯等非蛋白氮

2、多的要單測,第一節(jié) 概述,一些蛋白質(zhì)的含氮量,第一節(jié) 概述,一些蛋白質(zhì)的含氮量 一般為 15% 17.6%，有的上下浮動可以測出總氮 N,N6.25 = 蛋白質(zhì)含量,第一節(jié) 概述,2.蛋白質(zhì)定量法,利用蛋白質(zhì)共性的方法,定氮法 雙縮脲法 物理法,利用特定氨基酸殘基法,染料結(jié)合法 福林酚試劑法,凱氏定氮法最常用的，國內(nèi)外應(yīng)用普遍,第一節(jié) 概述,一、凱氏定氮法,由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。書中只介紹前三種。 1.原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化(digest)，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出。 而樣品中的有機氮(

3、organic nitrogen)轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。 然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標準鹽酸或硫酸溶液滴定,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,整個過程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定 （1）消化 總反應(yīng)式,加硫酸鉀 作為增溫劑，提高溶液沸點，純硫酸沸點 340， 加入硫酸鉀之后可以提高至400以上。也可加入硫酸鈉， 氯化鉀等提高沸點，但效果不如硫酸鉀,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,加硫酸銅 作為催化劑。還可以作消化終點指示劑（做蒸餾時堿性指示劑）。還可以加氧化汞、汞（均有毒，價格貴）、硒粉、二氧化鈦。 加氧化劑 如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機 物氧化速度,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,消化裝置 “自動回流

4、消化儀,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,2）蒸餾 消化完全的樣品溶液，濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣 (NH4)2SO4+2NaOHNH3+Na2SO4+2H2O,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,3）吸收與滴定(titration) 吸收：加熱蒸餾所放出的氨，硼酸溶液 滴定：鹽酸標準溶液， 硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.810-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用 也可采用硫酸或鹽酸標準溶液吸收，然后再用氫氧化鈉標準溶液反滴定吸收液中過剩的硫酸或鹽酸，從而計算總氮量,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,2、適用范圍（application) 此法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測定。 3、試劑 濃硫

5、酸：脫水、氧化 硫酸銅：催化劑及消化指示劑 硫酸鉀：提高溶液的沸點 氫氧化鈉 混合指示劑 硼酸 鹽酸,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,4、操作方法 （1）消化：固體樣品0.2-2g，半固體樣品2-5g，液體樣品10-20ml，加入催化劑及濃硫酸進行消化至溶液綠色透明。（同時做空白實驗） （2）蒸餾： 按裝置進行連接，奈氏試劑檢查，無紅棕色物質(zhì)生成(檢查氨是否全部蒸完)，蒸餾過程中用硼酸吸收。 （3）滴定用0.1000mol/L鹽酸滴定至由蘭色變?yōu)槲⒓t色。（甲基紅為指示劑,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,5.蛋白質(zhì)計算 (V1V0) C0.014F100 蛋白質(zhì)= mn V1V0滴定時所耗鹽酸標準溶液的毫升數(shù)； C

6、標準鹽酸溶液的當(dāng)量濃度； 0.141毫升當(dāng)量氮的克數(shù)； F氮的蛋白質(zhì)換算系數(shù)； m樣品克數(shù)。 n 稀釋倍數(shù),第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,6.注意事項 當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30過氧化氫 23 m1 后再繼續(xù)加熱消化。 消化時不要用強火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶內(nèi)壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。 樣品含脂肪或糖較多時，消化時間要長些。同時注意消化過程中產(chǎn)生泡沫溢出瓶外。 在蒸餾過程中注意接頭處有無松漏現(xiàn)象。 蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源否則可能造成吸收液倒吸,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,二、微量凱氏定氮法,

7、1、原理及適用范圍同前 2、與常量法不同點： 加入硼酸量有50 ml 10 ml, 滴定用鹽酸濃度由0.1 mol/L 0.01 mol/L , 可用微量滴定管。 3、蒸餾裝置,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,三、自動凱氏定氮法,1、原理及適用范圍同前 2、特點： （1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。 （2）快速：一次可同時消化8個樣品，30分鐘可消化完畢。 （3）自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置?？捎嬎憧偟俜趾坎⒂涗?，12分鐘完成1個樣,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,四、雙縮脲法,傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高

8、、準確，不要大儀器，但費時間，有環(huán)境污染。 新開發(fā)的：雙縮脲法、 紫外分光光度法、 染料結(jié)合法、 水楊酸比色法等。 都是快速測定蛋白質(zhì)的方法,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,1、原理 當(dāng)脲（尿素NH2CONH2）加熱至150160時，可由兩個分子間脫去一個氨分子而生成二縮脲（也叫雙縮脲），反應(yīng)式如下,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,雙縮脲與堿及少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的配合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng),第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,蛋白質(zhì)分子含有肽鍵, 與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，故也能呈現(xiàn)此反應(yīng)而生成紫紅色配合物 在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，據(jù)此可用吸收光度法來測定蛋白質(zhì)含量，該配合物的最大吸收波長為560nm,第

9、二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,2.方法特點及應(yīng)用范圍 本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定 3.主要儀器： 分光光度計，離心機（4000 r/min） 4. 試劑： (1) 堿性硫酸銅溶液 (2) 四氯化碳,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,5操作方法： 標準曲線的繪制 采用凱氏法測出的蛋白質(zhì)樣品為標準樣繪標準曲線。 顯色（加入試劑靜置1小時） 比色（取上清離心） 樣品的測定 顯色 比色 查標準曲線,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,6、結(jié)果計算 蛋白質(zhì)（mg/100g）= 式中：c由標準曲線上查得的蛋白質(zhì)mg數(shù)； m樣品質(zhì)量，g,第

10、二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,7、說明及注意事項 蛋白質(zhì)的種類不同，對發(fā)色程度的影響 不大，有大量脂肪存在時，會出現(xiàn)混濁可以先脫脂 標準曲線作完整后，無需每次再作標準 曲線 樣品含有脯氨酸且有大量糖類存在時，顯色不好還會出現(xiàn)結(jié)果偏低,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,五、紫外吸收法,1原理：利用蛋白質(zhì)的特有基團，對紫外光有吸收作用在280 nm下，吸光度與蛋白質(zhì)濃度成直線關(guān)系，求含量,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,2適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因為干擾因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。 3主要儀器： 紫外分光光度計 離心機（3000 5000 r/min） 4操作：用凱氏法測定作標樣做標準曲線,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的測定,第

11、三節(jié) 揮發(fā)性鹽基氮的測定,揮發(fā)性鹽基氮是指動物性食品由于酶和細菌的作用，在腐敗過程中，使蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)。此類物質(zhì)具有揮發(fā)性，在堿性溶液中蒸出后，用標準酸滴定計算含量。 1.原理 揮發(fā)性鹽基氮遇到弱堿氧化鎂游離蒸餾出來，蒸餾出來的氨，被硼酸吸收后生成硼酸銨，使吸收液變?yōu)閴A性，混合指示劑由紫色變?yōu)榫G色。再由標準鹽酸滴定至紫色,2 、試劑 2.1 氧化鎂混懸液（ 10g/L ）：稱取 1.0g 氧化鎂，加 100mL 水，振搖成混懸液。 2.2 硼酸吸收液（ 20g/L ）。 2.3 鹽酸 c(HCL)=0.01mol/L 或硫酸 c(1/2H 2 SO 4 )=0.01m

12、ol/L 的標準滴定溶液。 2.4 甲基紅乙醇指示劑（ 2g/L ）。2.5 次甲基藍指示劑（ 1g/L,3.分析步驟 樣品處理：精確取 10g 試樣（粉碎好的樣品）于 200mL 磨口三角瓶中，加 100.0mL(V 總 ) 蒸餾水于振蕩器上振蕩 30 分鐘， 4000 轉(zhuǎn)離心。 蒸餾滴定：將盛有 2 0.0 mL 吸收液及 5-6 滴混合指示液的錐形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入吸收液的液面下，準確吸取 10.0mL （ V 分取 ）上述樣品上清液于蒸餾器反應(yīng)室內(nèi)，加 10 mL 氧化鎂混懸液（ 10g/L ），迅速蓋塞，并加水以防漏氣，通入蒸汽，進行蒸餾，蒸餾 5min 即停止，吸收滴

13、定：吸收液用鹽酸標準滴定溶液 0.01mol/L ）或硫酸標準滴定溶液滴定，終點至藍紫色。同時做試劑空白試驗,4.計算式及結(jié)果表述： (V1-V0)c14 X= 100 m（5/100,第四節(jié) 氨基酸定量測定,一、甲醛滴定法 1、原理 氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的-NH2基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時，- NH2基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用強堿標準溶液來滴定-COOH基，并用間接的方法測定氨基酸總量,2、方法特點及應(yīng)用 此法簡單易行、快速方便。 在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測定發(fā)酵液中氨基氮含量的變化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，并以此

14、作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標之一,3、試劑,40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至淡藍色。 0.1% 百里酚酞乙醇溶液 0.1mol/L 氫氧化鈉標準溶液,4、操作方法 樣品溶液（氨基酸約20-30mg），+50ml蒸餾水 加入3滴百里酚酞指示劑+中性甲醛20ml，搖勻，靜置1分鐘，0.1mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定（淡蘭色，終點） 記錄所消耗的堿液ml數(shù),5、結(jié)果計算 X（V2VI）C0.014100V式中：X為樣品中氨基氮含量（g100 g）；V2-百里酚酞作指示劑時消耗氫氧化鈉標準液的體積（ml）；V1-空白液消耗氫氧化鈉標準液的體積（ml）；C-氫氧化鈉標準液

15、的濃度（molL）；V-為樣品液取用量（ml）0.014-為氮的毫摩爾質(zhì)量（g/mmol,6、說明及注意事項 此法適用于測定食品中的游離氨基酸。 固體樣品應(yīng)先進行粉碎，準確稱樣后用水萃取，然后測定萃取液； 液體試樣如醬油、飲料等可直接吸取試樣進行測定。萃取可在500C水浴中進行0.5小時即可。 若樣品顏色較深，可加適量活性炭脫色后再測定，或用電位滴定法進行測定。 與本法類似的還有單指示劑（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用標準堿完全中和-COOH基時的pH為8.5-9.5，但分析結(jié)果稍偏低，雙指示劑法的結(jié)果更準確,誤差 脯氨酸與甲醛作用時產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏低； 酪氨酸含有酚羧基，滴定時也會

16、消耗一些堿而致使結(jié)果偏高； 溶液中若有銨存在也可與甲醛反應(yīng)，往往使結(jié)果偏高,二、電位滴定法,1、 原理 根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計的玻璃電極及甘汞電極同時插入被測液中構(gòu)成電池，用氫氧化鈉標準溶液滴定，依據(jù)酸度計指示的pH值判斷和控制滴定終點,2、 儀器 酸度計、磁力攪拌器、微量滴定管 3、 試劑 20%中性甲醛溶液：參考甲醛滴定法試劑 0.05mol/L氫氧化鈉標準溶液 4、操作方法 pH8.2-計算總酸含量； pH9.2-試劑空白試驗,5、 結(jié)果計算 X=（V1V2）C0.014100V 式中：X為樣品中氨基酸的含量（g/l00ml）； V1-

17、測定用樣品加人甲醛稀釋后消耗氫氧化鈉標準液的體積（ml）； V2-試劑空白試驗加人甲醛后消耗氫氧化鈉標準溶液的體積（ml）； V-樣品稀釋液取用量（ml）； C-氫氧化鈉標準液的濃度（mol/L） 0.014-氮的毫摩爾質(zhì)量（g/mmol,6、 說明 本法準確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測定 對于渾濁和色深樣液可不經(jīng)處理而直接測定,三、其他方法,1.茚三酮比色法(ninhydrin method) 原理 氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍紫色(Ruhemann purple color)化合物（除脯氨酸外均有此反應(yīng)）。該藍紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長為570nm，故據(jù)此可以測定樣品中