免疫學(xué)檢測中的曲線擬合.ppt

免疫測定中的數(shù)據(jù)處理與曲線擬合,免疫測定中的數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理與科學(xué)作圖,免疫測定中的數(shù)據(jù)處理與曲線擬合,免疫測定的數(shù)據(jù)處理及結(jié)果報告,臨床免疫檢測技術(shù)：RIA和EIA等；數(shù)據(jù)處理的意義和目標(biāo)：只有在測定結(jié)果以一種有意義的方式報告時，測定結(jié)果才有用；免疫測定結(jié)果的客觀評價，對改善免疫測定的重復(fù)性以及免疫測定的標(biāo)準(zhǔn)化都有重要意義。數(shù)據(jù)處理報告的要求：通俗易懂；定性結(jié)果明確，定量范圍明確；處理后得到的數(shù)據(jù)要具有可重復(fù)性；試驗的評價不能建立在假定的正態(tài)分布上；結(jié)果具有用于進(jìn)一步分析處理（如流行病學(xué)）的充分性。免疫測定以其測定結(jié)果的表達(dá)方式：定性，定量兩類。,定性測定-“有”或“無”,判定結(jié)果：陰性，陽性。判定依據(jù)：cut-off值，S/NorP/N比值。判斷依據(jù)確立原則：盡可能避免假陽性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。應(yīng)用：傳染性病原體的血清標(biāo)志物檢測。,定性測定數(shù)據(jù)處理-cut-off值的確定,相關(guān)概念：ELISA測定的“灰區(qū)”-陽性判斷值的確定就是要使以其得到的測定結(jié)果的假陽性和假陰性的發(fā)生率最低，處于陽性判斷值定值域中的測定結(jié)果可歸為可疑，亦即ELISA測定的“灰區(qū)”。,定性測定數(shù)據(jù)處理-cut-off值的確定,Cut-off值設(shè)定的一般方法：標(biāo)準(zhǔn)差比率standarddeviationratio,SDR測定標(biāo)本對陰性比值（P/NorS/N）testtonegativeratio,TNR以陰性對照均值+2或3SD作為cut-off值綜合陰性對照均值+2或3SD及陽性對照-2或3SD建立cut-off值綜合陰性對照均值+2或3SD及陽性對照-2或3SD和轉(zhuǎn)化血清結(jié)果建立cutoff值百分位數(shù)法相對單位（relativeunits,EIU):標(biāo)本EIU=雙質(zhì)控（doublecontrol，2C）：0.18X（陰性質(zhì)控物中值+陽性質(zhì)控物中值）使用ROC曲線設(shè)定cut-off值,使用ROC曲線設(shè)定cut-off值：,ROC曲線：橫坐標(biāo)為假陽性率FPR=假陽性數(shù)/（假陽性+真陰性）縱坐標(biāo)為真陽性率TPR=真陽性數(shù)/（真陽性+假陰性）,根據(jù)這種關(guān)系確定區(qū)分正常與異常的分界點(diǎn)究竟在何處最合適，也就是說此時的假陽性和假陰性率最低或比例最適當(dāng)或最為符合使用目的，該分界點(diǎn)即可作為ELISAcut-off值。,ROC曲線的含義：,陽性人群的測定值與陰性人群的測定值重疊程度越小，即測定的識別能力越高，ROC曲線越偏向上，曲線下面積越大。,定量測定-測定待測物的含量,判定結(jié)果：濃度（U/L，g/L）。判斷依據(jù)：測定未知標(biāo)本的同時，以系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品測得的劑量反應(yīng)曲線（即標(biāo)準(zhǔn)曲線）以此推算未知標(biāo)本的濃度。劑量反應(yīng)曲線：一般均為非線性的，不同的數(shù)學(xué)模式可以用來改善上述劑量反應(yīng)曲線繪制的精密度，從而以較少的數(shù)據(jù)和計算獲得較為準(zhǔn)確的結(jié)果。應(yīng)用：非傳染性血清學(xué)指標(biāo)。,免疫測定中的劑量反應(yīng)曲線,（相對于定量生化）：非線性測定反應(yīng)和待測物濃度之間的關(guān)系不一定是一條簡單的直線；可能存在與系列標(biāo)準(zhǔn)品的測定數(shù)據(jù)擬合的多條曲線可能因曲線的選擇而造成偏差；具有相對大的且方差不齊的測定誤差，且在標(biāo)準(zhǔn)曲線的不同位置、在不同批的測定之間這種誤差亦不同。,單純線性回歸往往不能反應(yīng)真實情況,Figure1Falselylowandfalselyelevatedassayvaluesresultingfromdrawingastraightlineforthecalibrationcurve.,數(shù)據(jù)處理與科學(xué)作圖,問題：給定一批離散的數(shù)據(jù)點(diǎn)，需確定滿足特定要求的曲線或曲面,從而獲取整體的規(guī)律。目標(biāo)：用一個解析函數(shù)描述一組（二維）數(shù)據(jù)(通常是測量值)。方法：插值法-數(shù)據(jù)假定是正確的，要求以某種方法描述數(shù)據(jù)點(diǎn)之間所發(fā)生的情況；曲線擬合或回歸-設(shè)法找出某條光滑曲線，使它最佳地擬合數(shù)據(jù)，但不必要經(jīng)過任何數(shù)據(jù)點(diǎn)。曲線及相應(yīng)數(shù)學(xué)公式表明數(shù)據(jù)對（如標(biāo)準(zhǔn)品濃度與測定信號）之間的比例關(guān)系。,擬合與插值的比較,數(shù)據(jù)擬合：又稱曲線擬合或曲面擬合，不要求曲線（面）通過所有數(shù)據(jù)點(diǎn)，而是要求它反映對象整體的變化趨勢時應(yīng)用。,插值：要求所求曲線（面）通過所給所有數(shù)據(jù)點(diǎn)時應(yīng)用；,從幾何意義上看，擬合是給定了空間中的一些點(diǎn)，找到一個已知形式的連續(xù)曲面來最大限度地逼近這些點(diǎn)；而插值是找到一個(或幾個分片光滑的)連續(xù)曲面來穿過這些點(diǎn)。,線性內(nèi)插與2階曲線擬合,插值法interpolativemethods,假設(shè)：反應(yīng)變量的已知絕對精密；曲線構(gòu)建：以觀察到的數(shù)據(jù)構(gòu)建曲線；方法：點(diǎn)對點(diǎn)（線性插值）樣條插值splinefunction,點(diǎn)對點(diǎn)（線性插值）,假設(shè)：中間值落在數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的直線上；當(dāng)數(shù)據(jù)點(diǎn)個數(shù)增加和它們之間距離減小時，線性插值就更精確；適用范圍：線性范圍大或數(shù)據(jù)點(diǎn)多且相互緊密相連；處理：為使數(shù)據(jù)更具有線性關(guān)系，可對數(shù)據(jù)進(jìn)行某些方式的轉(zhuǎn)換（如對數(shù)轉(zhuǎn)換），然后在轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)上進(jìn)行線性插值。,將臨近的校準(zhǔn)點(diǎn)以點(diǎn)對點(diǎn)的方式用一條直線連起來。,線性插值在免疫檢測中的應(yīng)用：,采用某些更光滑的曲線來擬合數(shù)據(jù)點(diǎn)；最常用的方法是3階多項式，對相繼數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的各段建模，這種類型的插值被稱為3次樣條或簡稱為樣條；處理：為將每一個短曲線相互之間平滑地連起來，需對其進(jìn)行修飾（smoothing），這需要反復(fù)重新計算所有的曲線直至每一片段與其數(shù)據(jù)點(diǎn)的擬合間的連接可以接受。結(jié)點(diǎn)（knots，校準(zhǔn)物的濃度值）越多意味著數(shù)據(jù)處理工作量的增大；適用范圍：當(dāng)希望曲線密切遵循單個的校準(zhǔn)物數(shù)據(jù)點(diǎn)時，或數(shù)據(jù)非常精密并有多個校準(zhǔn)物時可選用，否則應(yīng)避免使用；,樣條插值splinefunction,將臨近的校準(zhǔn)點(diǎn)以一條曲線連起來，對整個標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點(diǎn)間的短片段進(jìn)行數(shù)學(xué)計算得到一條曲線，所獲得的合成數(shù)學(xué)函數(shù)稱為樣條函數(shù)。,線性插值樣條插值,兩種插值結(jié)果完全不同，因為插值是一個估計或猜測的過程，其意義在于，應(yīng)用不同的估計規(guī)則導(dǎo)致不同的結(jié)果。,樣條插值與線性插值：,特點(diǎn)：完全擬合試驗數(shù)據(jù)；每一片段基本上與其他部分無關(guān)；問題：對數(shù)據(jù)點(diǎn)的精密度和準(zhǔn)確性依賴大；每一個片段都應(yīng)有一個質(zhì)控樣本，而這往往是做不到的；無法完全解決hooks出現(xiàn)引起的不準(zhǔn)確；有時較其他“復(fù)雜”模式更費(fèi)時。影響因素：確定某部分曲線的兩個校準(zhǔn)點(diǎn)的準(zhǔn)確度和精密度。,插值法interpolativemethods及其應(yīng)用,曲線構(gòu)建：以符合數(shù)據(jù)點(diǎn)規(guī)律的經(jīng)驗?zāi)Ｊ綐?gòu)建曲線；目標(biāo)：反映對象整體的變化趨勢；達(dá)到最佳擬合的方法線性最小二乘準(zhǔn)則；擬合模式：雙曲線模式hyperbolicmodel多項式模式polynomialmodelLog-Logit轉(zhuǎn)換Logistic公式（兩參數(shù)，四參數(shù)）,曲線擬合與回歸curvefitting,曲線擬合問題的提法：已知一組（二維）數(shù)據(jù)，即平面上n個點(diǎn)（xi,yi)i=1,n,尋求一個函數(shù)（曲線）y=f(x),使f(x)在某種準(zhǔn)則下與所有數(shù)據(jù)點(diǎn)最為接近，即曲線擬合得最好。,1.通過機(jī)理分析建立數(shù)學(xué)模型來確定f(x)；2.將數(shù)據(jù)(xi,yi)i=1,n作圖，通過直觀判斷確定f(x)：,擬合函數(shù)的選擇：,2階曲線擬合與10階曲線擬合,n=1作為階次，得到最簡單的線性近似。通常稱為線性回歸；n=2作為階次，得到一個2階多項式；高階多項式給出很差的數(shù)值特性，不應(yīng)選擇比所需的階次高的多項式。,擬合曲線的階次：,雙曲線模式hyperboliccurve：曲線形狀：雙曲線；假定數(shù)據(jù)擬合下式：y=a+b(1/x)或(1/y)=p+q(x)。,多項式模式：曲線形狀：拋物線；假定校準(zhǔn)曲線擬合下述曲線形式；y=a+bx+cx2+dx3+pxn。,Log-Logit轉(zhuǎn)換：曲線形狀：具有單點(diǎn)屈曲的連續(xù)性S形函數(shù)；假定校準(zhǔn)曲線擬合下述曲線形式：logit（y）=a+b*ln（x），其中l(wèi)ogit（z）=lnz/（1-z）。,Logistic公式（兩參數(shù)，四參數(shù)）：曲線形狀：具有單點(diǎn)屈曲的連續(xù)性S形函數(shù)；假定校準(zhǔn)曲線擬合下述曲線形式：logistic公式：Y=+dx以對數(shù)表示時曲線呈線性。,擬合模式：,1）將校準(zhǔn)物濃度的倒數(shù)對測定反應(yīng)作圖或以B0/B對校準(zhǔn)物濃度作圖；2）最小平方線性回歸。,雙曲線擬合hyperboliccurve：,y=a+b(1/x)或(1/y)=p+q(x),問題：標(biāo)準(zhǔn)曲線的端值得不到好的擬合（特別是低濃度端）；測定誤差為倒數(shù)，與實際誤差規(guī)律相反；不具有S形，限制了應(yīng)用。雙曲線擬合模式：競爭性免疫測定數(shù)據(jù)（在限定范圍內(nèi)的值）能擬合很好的平滑曲線。,雙曲線模式hyperboliccurve應(yīng)用,1）將測定反應(yīng)對校準(zhǔn)物濃度作圖；2）對多項式進(jìn)行最小平方回歸。,多項式擬合：,適用范圍：一個三次多項式可被快速和成功地用于競爭免疫測定數(shù)據(jù)擬合；非競爭性免疫測定：有部分校準(zhǔn)曲線為直線，可能擬合不好；x的次方為非整數(shù)時能夠再現(xiàn)校準(zhǔn)曲線的實際線性部分，但在零濃度附近和高濃度時不準(zhǔn)確，需要截尾。問題：一個給定反應(yīng)值可能對應(yīng)兩個結(jié)果，因此需對校正曲線進(jìn)行截尾。,多項式模式應(yīng)用,1）將logit（B/B0）對校準(zhǔn)物濃度的對數(shù)作圖；2）對轉(zhuǎn)換后的曲線進(jìn)行最小平方回歸可得到良好的直線。,Log-Logit轉(zhuǎn)換曲線：,logit（y）=a+b*ln（x）,logit（y）=a+b*ln（x）,適用范圍：競爭免疫測定數(shù)據(jù)擬合。問題：不能包含零校準(zhǔn)物點(diǎn)；不能包含放免中的非特異結(jié)合數(shù)據(jù)。,Log-Logit轉(zhuǎn)換應(yīng)用：,1）將測定反應(yīng)對校準(zhǔn)物濃度的對數(shù)作圖；2）對轉(zhuǎn)換后的曲線進(jìn)行最小平方回歸。,Logistic公式（兩參數(shù)，四參數(shù)）：,Y=（a-d）/1+（X/C）b+d兩參數(shù)：a=y0，d=yxy=（y0-yx）/1+（X/C）b+yxY=log(y0-y)/(y-yx)=logit(y),X=log(x),A=-b,B=-blog(c)Logit(y)=Alog(x)+B四參數(shù)：不依賴于y0和yx的測定，更好地擬合原始數(shù)據(jù)。,優(yōu)點(diǎn)：不會出現(xiàn)鉤狀（hooks）；問題：與直線公式相比logistic公式在代數(shù)學(xué)上是一個相當(dāng)復(fù)雜的公式，因此要找出“最佳擬合”相對較難；參數(shù)：a，b，c，d四參數(shù)，或帶入a&d值，則為b，c兩參數(shù)。,Logistic公式（兩參數(shù)，四參數(shù)）應(yīng)用,例：在fPSA免疫分析中，四參數(shù)logistic擬合和四次多項式擬合最接近真實值。,Figure2Effectofcurve-fittingprogramappliedonthedegree(extent)ofdeviationoffPSAvaluesfromexpectedmeanvaluesoffPSA(representedbythedottedhorizontalline).,劑量反應(yīng)曲線：通常為S形或雙曲線。目標(biāo)：曲線線性化，獲得數(shù)學(xué)模式。方法：轉(zhuǎn)換一個或兩個變量（對數(shù)或倒數(shù)）；多項或其他方式的曲線線性回歸或比例轉(zhuǎn)換(logit)。最低要求：應(yīng)用時經(jīng)濟(jì)省時；一個反應(yīng)變量只對應(yīng)一個劑量結(jié)果（無hooks出現(xiàn)）。,總結(jié)：曲線擬合及其應(yīng)用,質(zhì)量作用定律模式和Scatchard作圖,曲線構(gòu)建：從化學(xué)原理（抗原抗體之間的反應(yīng)符合質(zhì)量作用定律）計算校準(zhǔn)曲線。原理：Ag+AbAbAg，Ka=，=Ka（n-AbAg）n為反應(yīng)孔中抗體的最大結(jié)合能力，以mol/g抗體表示，Ka是平衡常數(shù)。Scatchardplot繪制方法：以AbAg/Ag比值對AbAg作圖可得到一條直線；計算機(jī)軟件作圖。,特點(diǎn)：以化學(xué)理論為基礎(chǔ)，給出了免疫測定的化學(xué)本質(zhì)，比其他經(jīng)驗?zāi)Ｊ礁煽?。問題：在實際反應(yīng)中往往只在一定濃度范圍內(nèi)呈線性，受到以下條件限制1）抗原抗體均一（標(biāo)記物與非標(biāo)記物）和單價（多抗）；2）抗原抗體反應(yīng)必須達(dá)到平衡（非一步反應(yīng)）；3）抗原抗體按照一級質(zhì)量作用定律反應(yīng)，無改變抗體或抗原反應(yīng)性的作用，如協(xié)同作用或變構(gòu)作用；4）結(jié)合和游離物濃度必須為真正的測定值。使用范圍：非競爭免疫測定中雙抗夾心測定不能用。,Scatchard作圖及其應(yīng)用,相關(guān)應(yīng)用軟件,Thermolabsystems酶標(biāo)儀：可進(jìn)行的曲線擬合類型包括LINEARREGRESSION，POINTTOPOINT，QUAD.POLYNOMIAL，CUBICPOLYNOMIAL，CUBICSPLINE，QUARTICPOLYNOMIAL，4PARAM.LOGISTIC，從中選出最佳擬合（“bestfit”）。Program：RIAAID,ELISAAID(RobertMacielAssociates,Inc.Arlington,MA)通用的處理程序，可進(jìn)行l(wèi)og-logit(加權(quán)、非加權(quán)）、四參數(shù)logistic擬合、多項式擬合、點(diǎn)對點(diǎn)擬合等，可用于RIA和EIA。CurveExpert1.3：linearregressionmodels,nonlinearregressionmodels,interpolation,orsplines.Over30models。,摘自生物軟件網(wǎng)www.bio-,有關(guān)概念,準(zhǔn)確度accuracy實驗測得的分析物濃度與其真值之間符合程度。標(biāo)準(zhǔn)差standarddeviation,SD一組數(shù)據(jù)的離散度。變異系數(shù)coefficientofvariation,CV標(biāo)準(zhǔn)差以其均數(shù)的百分比來表示。重復(fù)性reproducibility通過重復(fù)測定的SD或算術(shù)平均值的區(qū)間值來考察。測定下限detectability超過零劑量精密度的最低抗原濃度。敏感性sensitivity實驗的測定反應(yīng)對待側(cè)物質(zhì)濃度變化的改變，即dR/dC。,夾心ELISA校準(zhǔn)曲線,優(yōu)化：為得到更大的線性范圍，可提高包被抗體和檢測抗體的用量；標(biāo)準(zhǔn)曲線的不同位置精確度不同，這影響到標(biāo)準(zhǔn)曲線上數(shù)據(jù)點(diǎn)的疏密分布，并需要相應(yīng)的質(zhì)控品；不同批標(biāo)準(zhǔn)曲線之間亦有誤差，因此每批實驗都應(yīng)重新坐標(biāo)準(zhǔn)確性。,Referrence,李金明