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文檔簡介

.,任務二：PCR擴增目的基因,.,一、實驗目的,1、掌握PCR擴增DNA的技術與原理2、學習PCR擴增儀的使用,.,二、實驗原理,聚合酶鏈式反應是一種體外DNA擴增技術，具有靈敏度高、特異性強、操作簡便和應用廣泛等特點。PCR工作原理類似于DNA的體內復制過程，是將待擴增的DNA片段和與其兩側的已知序列合成兩個與模板DNA互補的寡核苷酸作為引物，引物序列將決定擴增序列片段的特異性和片段長度。,.,標準的PCR過程分為三步：1.模板變性（92-96）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA2.低溫退火（37-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。3.延伸（72）：在Taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5端3端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。,.,.,三、實驗儀器,PCR擴增儀臺式高速離心機移液器高壓滅菌后的Eppendorf管（0.5mL）電泳儀,.,四、材料與試劑,1、模板DNA（0.1g/L）：用牙簽挑取單菌落懸浮到50L的裂解液中（1%TritonX-100，20mmol/LTris-HCLpH8.2，2mmol/LEDTA），95溫浴10min，10000r/min離心5min，取2L上清液用于總體積50L的PCR反應。,.,2、TaqDNA聚合酶（5U/L），10擴增緩沖液，dNTP（1mmol/L）：購買。3、引物（100pmol/L）：設計并合成與目的DNA兩側互補的引物。,.,五、實驗操作,1.準備PCR反應溶液,（1）按序將如下成分混合置于Eppendorf管內a.10擴增緩沖液10Lb.4dNTPs8Lc.引物11Ld.引物2Le.模板DNA1L（10ng）f.TaqDNA聚合酶L（2.5U）加水至終100L,.,（2）手指輕彈Eppendorf管底部離心2s,（3）加石蠟油50L封住溶液表面,.,2.PCR擴增反應,加好樣的Eppendorf管置于PCR擴增儀內變性：955min951min退火：5545s延伸：721min重復循環(huán)30次循環(huán)結束后72延伸8min反應完畢，取樣置-4待用,.,3.結果觀察,取樣進行瓊脂糖凝膠電泳溴化乙錠（EB）染色觀察DNA條帶,高度靈敏的熒光染色劑染色效果好操作方便穩(wěn)定性差強致癌劑中度毒性,.,六、注意事項,1、PCR結果若出現非特異性的擴增條帶，有必要進一步優(yōu)化反應條件，包括改變退火溫度和時間，調整Mg2+濃度等。2、PCR反應特異性

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