《IDNA的復(fù)制》PPT課件

Chapter4DNAreplication,Keynotes,Semi-conservativemechanismReplicons,originsandterminiSemi-discontinuousreplicationRNApriming,BasiccharactersofDNAreplication(基本特征）TheenzymeofDNAreplication（酶學(xué)）TheprocessofDNAreplication（過程）Reversetranscription（反轉(zhuǎn)錄）,DNA復(fù)制的基本特征,Template,四種dATP,dGTP,dCTP,dTTP為前體，二價(jià)金屬離子Mg2+(或Mn2+)，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)則復(fù)制產(chǎn)生子鏈解鏈復(fù)制方式為半保留復(fù)制（semi-conservativereplication）需要引物（primer）復(fù)制方向總是5-3復(fù)制子（replicon)復(fù)制的方向：一般為雙向半不連續(xù)性：岡崎片斷(Okazakifragment)具有高度的忠實(shí)性,圖4-1DNA復(fù)制可能的三種方式以及Meselson和Stahl實(shí)驗(yàn)的可能結(jié)果,半保留復(fù)制,1958年，Meselson和Stahl首次用實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DNA的半保留復(fù)制。用普通培養(yǎng)基（14N）培養(yǎng)15N標(biāo)記的大腸桿菌。用CsCl密度梯度離心法分析DNA。抽提子一代DNA分子。,圖4-2Meselson和Stahl實(shí)驗(yàn)的實(shí)際結(jié)果,HerbertTaylor在植物根尖細(xì)胞中使用放射自顯影證明，真核細(xì)胞DNA的復(fù)制方式也是半保留。,復(fù)制子（replicon),復(fù)制子:基因組中能單獨(dú)進(jìn)行復(fù)制的單位。每個(gè)起始點(diǎn)到終止點(diǎn)的區(qū)域?yàn)橐粋€(gè)復(fù)制子。起始點(diǎn)（originofreplication,ori):原核生物DNA分子中只有一個(gè)，長(zhǎng)度200bp左右。大腸桿菌oriC有245bp。真核生物有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。三個(gè)特征：a）由多個(gè)短的重復(fù)序列組成；b)富含AT；c)能夠被特定的復(fù)制起始區(qū)結(jié)合蛋白識(shí)別。終點(diǎn)（ter）：通常不固定。,圖4-3證明DNA復(fù)制的方向始終是53的末端終止實(shí)驗(yàn),圖4-10DNA的半不連續(xù)復(fù)制,OkazakifragmentLeadingstrandLaggingstrand,DNA復(fù)制所需要酶和蛋白質(zhì),DNApolymerase(DNApol)DNA解鏈酶(helicase)：水解ATP獲能解開雙鏈DNA單鏈結(jié)合蛋白(single-strandedbindingprotein,SSB),DNA引發(fā)酶(primase)：RNA引物合成DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)：與超螺旋松馳有關(guān)，改變DNA拓?fù)湫再|(zhì)，松馳超螺旋，有利于復(fù)制叉的前進(jìn)，有型和型，原核、真核中均有。DNA連接酶(ligase)端粒酶(telomerase),原核生物DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApol),1957年Kornberg首先從大腸桿菌提取DNApol：聚合作用：5335外切酶活性：校對(duì)功能53外切酶活性：引物切除、損傷修復(fù)主要功能是切除引物，填補(bǔ)岡崎片段產(chǎn)生的空隙及DNA損傷的修復(fù)DNApolI具有的聚合酶和5-外切酶活性的配合使用可導(dǎo)致本來一條鏈帶有切口的DNA分子發(fā)生切口平移(nicktranslation)。目前已在E.coli中發(fā)現(xiàn)DNApol、和。,DNApolI催化的缺口平移,DNApol是單一肽鏈的大分子,由polA編碼，分子量為109kD,二級(jí)結(jié)構(gòu)以-螺旋為主。用特異的蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶subtilisin或胰蛋白酶trpsin）處理，可把DNApol水解為兩個(gè)片段。小片段：323個(gè)氨基酸殘基，53外切酶活性大片段或稱Klenow片段：605個(gè)氨基酸殘基，DNA聚合酶活性和35外切酶活性,圖4-13DNApol的聚合和校對(duì),finger,thumb,palm,DNApol：53聚合酶活性及35外切核酸酶活性，90kDa，由polB基因編碼。DNApol:由10個(gè)亞基組成，分別為、及。是原核生物體內(nèi)真正起復(fù)制作用的酶，主要有核心酶和全酶兩種形式。全酶由核心酶、滑動(dòng)鉗(slidingclamp)和鉗載復(fù)合物(clamp-loadingcomplex)組成。核心酶：由、組成。亞基：由polC(也稱dnaE)基因編碼，53聚合酶活性亞基:由dnaQ基因編碼，35外切酶,校對(duì)和編輯為裝配必須PolIII：由核心酶和亞基組成。體內(nèi)PolIII形成二聚體，分別負(fù)責(zé)前導(dǎo)鏈和后隨鏈的復(fù)制。鉗載復(fù)合物：由、及亞基組成，具有ATP酶活性，負(fù)責(zé)滑動(dòng)鉗的裝載。滑動(dòng)鉗：由兩個(gè)亞基組成，為環(huán)繞DNA模板而成的環(huán)狀六角星結(jié)構(gòu)。,圖4-14E.coliDNApolIII全酶的結(jié)構(gòu)模型,DNApol和1999年被發(fā)現(xiàn)，屬于易錯(cuò)的聚合酶，參與DNA的修復(fù)合成。DNApol與DNApolII在細(xì)菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期被誘導(dǎo)表達(dá)，一起修復(fù)該階段DNA損傷DNApol在細(xì)菌進(jìn)行SOS反應(yīng)時(shí)被誘導(dǎo)合成。由1個(gè)UmuC和2個(gè)UmuD組成。,真核生物DNA聚合酶,目前發(fā)現(xiàn)超過15種，最重要的是、和五種。、及四種，都有53聚合功能。及、參與核染色體DNA復(fù)制；：鏈合成的引發(fā)，和：鏈的延長(zhǎng)，具3-外切酶活性，校對(duì)功能。PCNA(proliferatingcellnuclearantigen)為的輔助蛋白，三個(gè)亞基組成滑動(dòng)鉗，以提高的進(jìn)行性。：兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，N-端為5-脫氧核糖磷酸酶和與單鏈DNA結(jié)合的活性；C-端具聚合酶活性。參與DNA損傷的修復(fù)，增補(bǔ)DNA鏈上短的空隙。：線粒體DNA復(fù)制和損傷修復(fù)，具聚合酶、3-外切酶和5-脫氧核糖磷酸酶活性。,端粒與端粒酶(telomerase),Telomere:真核生物線性染色體3-末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，由蛋白質(zhì)和DNA組成。核苷酸重復(fù)序列富含G，和端粒結(jié)合蛋白組成核蛋白復(fù)合物。人的DNA端粒含有TTAGGG重復(fù)序列，長(zhǎng)度515kb。作用：保護(hù)染色體末端免于化學(xué)修飾或核酸酶降解以及不正常的融合和重組；解決染色體復(fù)制時(shí)末端丟失問題。,Telomerase:由RNA和蛋白質(zhì)組成的酶。兼有模板和逆轉(zhuǎn)錄酶兩方面的作用。1995年，F(xiàn)eng等克隆了人類端粒酶RNA基因，長(zhǎng)約450個(gè)堿基的RNA序列中有一段長(zhǎng)11個(gè)核苷酸的區(qū)域（5-CUAACCCUAAC-3）與人的端粒序列（TTAGGG）n互補(bǔ)。端粒酶蛋白質(zhì)的分離：四膜蟲端粒酶兩個(gè)多肽成分p80和p95。,圖4-27端粒酶的作用機(jī)理,端粒與衰老,實(shí)驗(yàn)：在無端粒酶活性的成纖維細(xì)胞中表達(dá)端粒酶時(shí)，端粒的縮短和細(xì)胞的衰老都受到抑制。結(jié)論：細(xì)胞的衰老是由端粒驅(qū)動(dòng)的。體外培養(yǎng)的細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度隨細(xì)胞逐代相傳而縮短，丟失到一定程度便失去對(duì)染色體的保護(hù)作用。細(xì)胞隨之發(fā)生衰老和死亡。,可把端?？闯梢幻骁?，端粒的長(zhǎng)度是鐘上的刻度，記載了細(xì)胞分裂的次數(shù)，稱為“端粒鐘”，或有絲分裂鐘或“生命的時(shí)鐘”，可通過測(cè)定端粒的長(zhǎng)度預(yù)測(cè)細(xì)胞的壽命。胚胎細(xì)胞和生殖細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度并不隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增加而縮短，具有無限的分裂能力，原因在于端粒酶的存在，而體細(xì)胞則很難檢測(cè)到端粒酶的活性，端粒的長(zhǎng)度也短得多。,端粒酶與腫瘤,人體內(nèi)除了生殖細(xì)胞和少數(shù)一些體細(xì)胞如淋巴細(xì)胞等細(xì)胞外，絕大多數(shù)體細(xì)胞中無法檢測(cè)到端粒酶的活性，而在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中能檢測(cè)到端粒酶的活性。體細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度很短，其繼續(xù)縮短導(dǎo)致染色體融合、細(xì)胞死亡，而腫瘤端粒酶的激活可以維持端粒的長(zhǎng)度，維持腫瘤的繼續(xù)分裂、增殖。端粒酶的表達(dá)可能是腫瘤形成和發(fā)展的共同途徑。,端粒酶與惡性腫瘤之間有相關(guān)性使之在腫瘤的診斷和治療上有望成為新的靶目標(biāo)?？梢酝ㄟ^各種途徑抑制端粒酶的活性有效抑制大多數(shù)腫瘤的生長(zhǎng)，而對(duì)正常細(xì)胞沒有影響。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscription)：具有腫瘤特異性，因此hTERT啟動(dòng)子可以用于靶向治療基因的表達(dá)。,Figure1Schematicdiagramofadeno-associatedvirus(AAV).(a)Thestructureofthewild-typeAAV.(b)Thegene-deliveryvectorbasedonAAV.Theviralgenomeisreplacedbyanexpressioncassette,whichusuallyconsistsofapromoter,transgeneandpolyA(pA)tail.(c)DiagramofAAV-hTERT-hIFN-.(d)DiagramofthetwoORFrepandcap.CapencodesthreecapsidproteinsVP1,VP2andVP3.Thearrowsmarksitesofthespecificligandsinsertion(numbersaretheaminoacidpositionsN-terminaloftheinsertion).,ChinSciBulletin,2007,52:1590-1599.,Oncogene(2004)23,457-464,DNA的復(fù)制的過程,DNA復(fù)制過程的三個(gè)階段DNA復(fù)制的起始階段，包括起始點(diǎn)，復(fù)制方向以及引發(fā)體的形成。DNA鏈的延長(zhǎng)，包括前導(dǎo)鏈及隨從鏈的形成和切除RNA引物后填補(bǔ)空缺及連接岡崎片段。DNA復(fù)制的終止階段。,（一）DNA復(fù)制的起始階段復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開始的，即復(fù)制起始點(diǎn)(originofreplication)常用ori或o表示，復(fù)制的基本單位為復(fù)制子或復(fù)制單元(replicon)。在原核細(xì)胞中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，一個(gè)復(fù)制子。在真核生物中復(fù)制是從許多起始點(diǎn)同時(shí)開始的，即有多個(gè)復(fù)制子。,DNA復(fù)制起始點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特性大腸桿菌Ori由422個(gè)核苷酸組成，是一系列對(duì)稱排列的反向重復(fù)序列，即回文結(jié)構(gòu)(palindrome)。有些生物復(fù)制起始點(diǎn)Ori是富含AT的區(qū)段。這些特殊的結(jié)構(gòu)對(duì)于在DNA復(fù)制起始過程中參與的酶和許多蛋白質(zhì)分子的識(shí)別和結(jié)合都是必須的。,圖4-28E.coli的OriC結(jié)構(gòu),(一)DNA復(fù)制的起始E.ColiDNA復(fù)制起始包括對(duì)其復(fù)制起始區(qū)OriC的識(shí)別，以及引發(fā)體(primosome)的形成。DNA雙螺旋的解旋由多種酶來完成的DNA解鏈酶：水解ATP獲能解開雙鏈DNA單鏈結(jié)合蛋白（SSB蛋白）：保持單鏈結(jié)構(gòu)引發(fā)酶(RNA聚合酶)：合成RNA引物隨從鏈?zhǔn)怯梢l(fā)體來完成的,圖4-29E.coliDNA復(fù)制過程中引發(fā)體的形成,（二）DNA鏈的延長(zhǎng)復(fù)制的延伸在復(fù)制體(replisome)內(nèi)進(jìn)行。DNA的復(fù)制實(shí)際上就是以DNA為模板在DNA聚合酶作用下，將四種dNTP聚合成DNA的過程。過程：復(fù)制體的形成前導(dǎo)鏈合成后隨鏈合成后隨鏈合成與前導(dǎo)鏈合成之間的協(xié)調(diào)。,圖4-30E.coliDNA復(fù)制過程中復(fù)制體的形成,圖4-31E.coliDNA復(fù)制的延伸,（三）DNA復(fù)制的終止階段E.coliDNA具有復(fù)制終止位點(diǎn)Ter位點(diǎn)，此處可以結(jié)合一種特異的蛋白質(zhì)分子叫做Tus(terminatorutilizationsubstance)，通過阻止DnaB解鏈酶(Helicase)的解鏈活性而終止復(fù)制。,圖4-32E.coliDNA復(fù)制終止區(qū)的結(jié)構(gòu),其它環(huán)狀DNA分子的復(fù)制,1、復(fù)制:首先由J.Carins從大腸桿菌中觀察到,又稱為Carins復(fù)制。2、滾環(huán)復(fù)制（rollingcirclereplication)：噬菌體(X174和M13)和一些小質(zhì)粒；真核生物如兩棲卵母細(xì)胞的rDNA和哺乳動(dòng)物的DHFR(二氫葉酸還原酶)基因。3、D環(huán)復(fù)制（Dloopreplication)：線粒體和葉綠體DNA和少數(shù)病毒如腺病毒DNA的復(fù)制,滾環(huán)復(fù)制,D環(huán)復(fù)制圖,真核與原核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)(差別)染色質(zhì)和核小體結(jié)構(gòu)對(duì)DNA復(fù)制的影響復(fù)制叉移動(dòng)的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于原核細(xì)胞真核生物是多點(diǎn)復(fù)制，具多個(gè)復(fù)制起始區(qū)，原核生物是單點(diǎn)復(fù)制。岡崎片段的長(zhǎng)度短于原核細(xì)胞復(fù)制嚴(yán)格限制在細(xì)胞周期的S期真核生物在完成全部復(fù)制之前，各個(gè)起始點(diǎn)上DNA的復(fù)制不能再開始；原核生物起始點(diǎn)上可連續(xù)開始新的DNA復(fù)制。真核生物線性DNA末端具有端粒結(jié)構(gòu)。,逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription),逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板合成DNA，存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒以及原核生物和真核生物如端粒酶的延長(zhǎng)等。逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscription)逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組復(fù)制過程乙肝病毒基因組的復(fù)制,圖4-40（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu),圖4-40（2）逆轉(zhuǎn)錄病毒的詳細(xì)結(jié)構(gòu),圖4-41逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的結(jié)構(gòu),圖4-42HIV的生活史,圖4-43HIV與宿主細(xì)胞的附著,圖4-44逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組逆轉(zhuǎn)錄的詳細(xì)過程,圖4-45逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果,圖4-46原病毒DNA進(jìn)入細(xì)胞核的機(jī)理,逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscription),1964年，Temin發(fā)現(xiàn)Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制劑遏制。表明：RNA腫瘤病毒的RNA復(fù)制過程中要合成DNA。Temin又發(fā)現(xiàn)放線菌素D能抑制致癌RNA病毒的復(fù)制，但不能抑制一般RNA病毒的復(fù)制。表明：轉(zhuǎn)錄對(duì)于RNA病毒增殖是必需的。,Temin提出前病毒假說：原病毒DNA是RNA腫瘤病毒在復(fù)制和致癌中的中間物。1970年，Temin在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶。,逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶：1、RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性2、RNA酶H（RNaseH）活性：水解RNA-DNA雜交體上的RNA3、DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：合成互補(bǔ)DNA。4、沒有35外切酶活性。,特點(diǎn)：含有Zn2+DNA合成反應(yīng)要求有模板和引物。需適