生物活性小分子與靶點(diǎn)相互作用研究中的新方法和新技術(shù).docx

生物活性小分子與靶點(diǎn)相互作用研究中的新方法和新技術(shù)唐功利麻錦彪?yún)呛胥戧惡氄钚孕》肿优c靶蛋白的相互作用是生命中基本的相互作用之一, 因而靶蛋白和活性小分子的篩選是生命有機(jī)化學(xué)及藥物化學(xué)研究的重要內(nèi)容. 在活性小分子篩選方面, 細(xì)胞印跡(cytoblot)、以核磁共振為基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系研究(SAR-by-NMR)及反雙雜交(reverse two-hybrid)系統(tǒng)分別是以細(xì)胞、靶蛋白及蛋白間的相互作用為靶點(diǎn)的高通量、快速的篩選方法. 另外, 在由活性小分子鑒定靶蛋白的研究中, 三雜交(three-hybrid)系統(tǒng)、功能表達(dá)克隆(functional expression-cloning)及藥物印跡(drug-western)等方法大大加速了靶蛋白的鑒定進(jìn)程; 而展示克隆(display cloning)方法可以直接完成由活性小分子到靶蛋白基因的克隆. 結(jié)合DNA芯片技術(shù), 以基因組為基礎(chǔ)的篩選方法同時(shí)還可以明確小分子參與的一系列生物大分子調(diào)控. 而小分子印跡(small molecular printing)是從組合化學(xué)出發(fā)適應(yīng)人類基因組要求的篩選靶蛋白及活性小分子、研究小分子參與調(diào)控的方法. 概要介紹這幾種最新篩選方法, 并對(duì)中草藥現(xiàn)代化進(jìn)行了初步探討.關(guān)鍵詞靶蛋白 活性小分子 篩選 細(xì)胞印跡 SAR-by-NMR 反雙雜交 三雜交 功能表達(dá)克隆 藥物印跡 展示克隆 小分子印跡 化學(xué)基因?qū)W 中草藥現(xiàn)代化20世紀(jì)90年代, 隨著分子生物學(xué)和有機(jī)化學(xué)的飛速發(fā)展, 人類基因組計(jì)劃的全面展開(kāi), 越來(lái)越多的有機(jī)化學(xué)家嘗試通過(guò)活性有機(jī)小分子來(lái)探索生物大分子的功能及調(diào)控, 從而從分子及化學(xué)鍵的水平揭示生命活動(dòng)的本質(zhì). 于是一門(mén)融合了化學(xué)及生物學(xué)的交叉學(xué)科棗化學(xué)生物學(xué)應(yīng)運(yùn)而生. 與此同時(shí), 隨著人類基因組學(xué)及蛋白組學(xué)的發(fā)展, 以活性有機(jī)小分子為探針來(lái)研究基因表達(dá)及細(xì)胞周期調(diào)控的化學(xué)基因?qū)W(chemical genetics)14正逐步形成. 在這些研究中, 從生物活性小分子出發(fā)尋找它們的生物靶分子, 或從生物靶蛋白出發(fā)尋找高親和性配體分子, 是當(dāng)前研究活性小分子與生物靶分子相互作用、分子識(shí)別、信息傳遞、生命過(guò)程的小分子調(diào)控機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新穎藥物的關(guān)鍵環(huán)節(jié). 最近這一領(lǐng)域出現(xiàn)了一系列新概念、新方法和新技術(shù), 如細(xì)胞印跡, SAR-by-NMR, 反雙雜交技術(shù), 三雜交系統(tǒng), 功能表達(dá)克隆, 藥物印跡, 展示克隆, DNA芯片技術(shù)及小分子印跡等. 本文結(jié)合化學(xué)基因?qū)W, 主要介紹這幾種最新篩選方法的原理、特點(diǎn)及在發(fā)現(xiàn)活性小分子和靶蛋白方面的應(yīng)用.1 活性小分子的篩選有機(jī)化學(xué), 特別是組合化學(xué)可以方便地創(chuàng)造數(shù)量極其龐大的小分子化合物庫(kù), 但是以往如何從這龐大的化合物庫(kù)中篩選到期望的活性分子卻面臨很大的困難, 缺少靈敏、有效且可快速篩選的方法及手段是當(dāng)時(shí)的主要障礙. 下面介紹的最近發(fā)展的幾種高通量、快速而靈敏的篩選活性小分子的方法也許是對(duì)克服上述困難的有益的探索.1.1高通量活性小分子的篩選 棗 細(xì)胞印跡細(xì)胞印跡(cytoblot)5, 即高通量整細(xì)胞免疫檢測(cè)(high-throughput whole-cell immunodetec- tion assay), 是在酶偶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和免疫印跡 (western blotting)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的. 該方法用于快速檢測(cè)小分子對(duì)DNA合成、蛋白翻譯后加工(乙?；?、磷酸化等)及細(xì)胞周期等的影響. 其基本原理與免疫印跡十分類似(圖1), 但是檢測(cè)某一類細(xì)胞中的分子是在多孔培養(yǎng)板上的整細(xì)胞水平進(jìn)行的. 首先以待檢測(cè)的分子作為抗原制備抗體, 即一抗; 然后選擇合適的二抗進(jìn)行檢測(cè), 如采用聯(lián)有辣根過(guò)氧化酶的二抗與一抗偶聯(lián), 形成的復(fù)合物通過(guò)加入氨基苯二酰一肼(luminol)、過(guò)氧化氫和對(duì)碘苯酚進(jìn)行檢測(cè). 若細(xì)胞中有待檢測(cè)的分子(即抗原)存在, 則引發(fā)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)使底片感光; 若不存在, 則無(wú)發(fā)光反應(yīng). 5-溴尿嘧啶是一種化學(xué)誘變劑, 在DNA復(fù)制過(guò)程中, 它的滲入可使原來(lái)的A-T配對(duì)轉(zhuǎn)變?yōu)镚-C配對(duì), 從而導(dǎo)致癌變. 凡是可以阻止5-溴尿嘧啶滲入的化合物在一定程度上具有抗癌作用. Stockwell等人5采用細(xì)胞印跡法在6144孔細(xì)胞培養(yǎng)板上驗(yàn)證了已知的抗癌藥如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-(transforming growth factor )、噻氨酯噠唑(nocodazole)等阻止5-溴尿嘧啶滲入DNA合成的情況, 以此建立了細(xì)胞印跡篩選活性小分子的方法. 其最大的優(yōu)點(diǎn)是能夠進(jìn)行活性小分子的高通量快速篩選, 可以采用組織特異的細(xì)胞在納升到毫升的規(guī)模培養(yǎng). 但該方法一般適合于初篩, 要進(jìn)一步明確所得小分子的活性還需結(jié)合其他篩選方法.圖1 細(xì)胞印跡原理示意圖核仁素(nucleolin)是細(xì)胞核仁中的一種蛋白, 當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂時(shí)核仁素被特異地磷酸化, 而可以抑制有絲分裂的小分子化合物均可以增加磷酸化核仁素的含量. 最近為了尋找不與微管蛋白相互作用的有絲分裂抑制劑, Mayer和Haggarty等人6,7以磷酸化核仁素為抗原制備一抗, 采用細(xì)胞印跡法從合成的16 320種化合物中篩選到139種化合物可以阻止細(xì)胞分裂(圖2). 然后, 采用體外微管蛋白的聚合檢測(cè), 排除其中53個(gè)與微管蛋白相互作用的分子得到了86個(gè)化合物. 進(jìn)一步采用體內(nèi)染色體和微管染色檢測(cè)等方法篩選到一種通過(guò)阻止紡錘體形成而抑制細(xì)胞有絲分裂的活性化合物Monastrol (圖2), 在該化合物的作用下正常紡錘體被星狀單極化. 結(jié)合他們及其他實(shí)驗(yàn)室工作的積累, 進(jìn)一步推斷該化合物很可能至少作用于有絲分裂驅(qū)動(dòng)蛋白(mitotic kinesin)Eg5. 該活性分子作用機(jī)制完全不同于目前廣泛研究的紫杉醇等作用于微管蛋白而抑制有絲分裂的抗癌藥, 其靶蛋白的確定為進(jìn)一步合成、篩選Monastrol的高活性類似物提供了篩選模型, 因此完全有可能發(fā)展成一類像紫杉醇一樣有效但不具有神經(jīng)毒性、細(xì)胞毒性等副作用的新型抗癌藥8. 同時(shí), 從該化合物的篩選到作用機(jī)理的闡明及靶蛋白的鑒定首次提供了一種完全在實(shí)驗(yàn)室中從有機(jī)化學(xué)和生物學(xué)的角度開(kāi)發(fā)新藥的新思路9, 10.圖2 多步篩選獲得新活性化合物Monastrol1.2以靶蛋白為模型篩選小分子配體棗SAR-by-NMRTM圖3 SAR-by-NMR 原理示意圖在明確與疾病相關(guān)的靶蛋白的基礎(chǔ)上, 人們利用現(xiàn)代生物工程結(jié)合NMR技術(shù), 發(fā)展了一種新的具有一定導(dǎo)向性的快速發(fā)現(xiàn)生物大分子高親和性配體的方法棗SAR-by-NMRTM11, 12(structure-activity relationship by nuclear magnetic resonance). 該方法結(jié)合了合理性設(shè)計(jì)中的配體設(shè)計(jì)和優(yōu)化方法和非合理性設(shè)計(jì)(如組合化學(xué))的合理因素, 大大地提高了先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的速度和有效性. 其基本過(guò)程包括5個(gè)步驟(圖3)12: (1) 采用基因工程方法制備15N標(biāo)記的靶蛋白, 通過(guò)二維NMR技術(shù)從某一小分子化合物庫(kù)中篩選出和靶蛋白結(jié)合的第1個(gè)先導(dǎo)小分子. (2) 對(duì)該分子的類似物進(jìn)行篩選, 通過(guò)結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系(SAR)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化. (3) 采用與第1步相同的方法篩選出與前一結(jié)合亞位點(diǎn)相鄰的亞位點(diǎn)結(jié)合的第2個(gè)先導(dǎo)分子. (4) 對(duì)第2個(gè)先導(dǎo)分子的類似物進(jìn)行篩選, 得到第2個(gè)優(yōu)化的先導(dǎo)分子. 在選定兩個(gè)先導(dǎo)分子片段之后, 用多維NMR13, 14等技術(shù)測(cè)定蛋白質(zhì)和兩個(gè)配體的復(fù)合物的完整三維空間結(jié)構(gòu), 確定兩個(gè)配體在靶蛋白上確切的結(jié)合位置及其空間取向. (5) 基于上述三維結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)恰當(dāng)?shù)倪B接橋?qū)蓚€(gè)先導(dǎo)分子連接起來(lái), 使得到的分子和靶蛋白結(jié)合時(shí)保持各自獨(dú)立時(shí)的結(jié)合位置及其空間取向, 最終篩選得到一個(gè)高親和性的配體. 由于采用 NMR技術(shù)可以綜合多種藥物設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì), 能夠在短時(shí)間內(nèi)得到先導(dǎo)化合物, 而且在溶液中檢測(cè)的是小分子與靶蛋白相互作用的真實(shí)情況, 因而大大加快了藥物發(fā)現(xiàn)的速度. 到目前為止采用該方法已成功地發(fā)現(xiàn)了FK506結(jié)合蛋白的高親和性配體12、溶基質(zhì)素的非肽抑制劑15、人乳頭狀病毒(papilloma virus)E2蛋白的抑制劑16SH結(jié)構(gòu)域的高親和性配體17及rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶ErmAM的抑制劑18等. 最近的研究表明, 采用低溫核磁共振探測(cè)技術(shù)19, SAR-by-NMR可用于活性小分子的快速、高通量篩選.1.3利用靶蛋白-蛋白相互作用篩選活性小分子棗反雙雜交系統(tǒng)圖4 反雙雜交系統(tǒng)篩選活性小分子原理示意圖圖中右側(cè)酵母生長(zhǎng)情況的陰影斑代表酵母細(xì)胞正常生長(zhǎng), 空白斑代表酵母細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)或非正常生長(zhǎng). DB 代表DNA 結(jié)合蛋白; AD 代表活化蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白-蛋白的相互作用是生命活動(dòng)中廣泛而重要的相互作用, 與許多疾病相關(guān), 因此以蛋白-蛋白的相互作用為靶體篩選活性小分子是藥物篩選的另一重要途徑3, 20. 酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白與蛋白(或多肽)間相互作用的常用技術(shù)2123, 而最近由此發(fā)展的反雙雜交系統(tǒng)(reverse two-hybrid system)就是利用蛋白-蛋白的相互作用為靶體在細(xì)胞水平上來(lái)篩選活性小分子的高通量篩選方法. 酵母雙雜交技術(shù)的基本原理是融合于DNA結(jié)合域(DB)的蛋白X與融合于轉(zhuǎn)錄活化域(AD)的蛋白Y的相互作用導(dǎo)致BD與AD空間上的接近, 從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá). 反雙雜交基本原理與酵母雙雜交技術(shù)相似(圖4), 只是報(bào)告基因所導(dǎo)致的細(xì)胞生長(zhǎng)表型正好相反, 即只有在X與Y不發(fā)生相互作用的情況下報(bào)告基因不被啟動(dòng), 細(xì)胞才能生長(zhǎng). 當(dāng)采用與疾病有關(guān)的一對(duì)可發(fā)生相互作用的蛋白作為X與Y, 采用反雙雜交系統(tǒng)來(lái)篩選活性小分子時(shí), 若小分子有活性, 抑制了X與Y的相互作用, 報(bào)告基因不被轉(zhuǎn)錄, 細(xì)胞正常生長(zhǎng); 若待篩選小分子無(wú)活性, 不影響X與Y的相互作用, 這時(shí)啟動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄, 產(chǎn)生的蛋白分解培養(yǎng)基中的某一特定化合物產(chǎn)生細(xì)胞毒性(如URA324分解5-氟乳清酸, 5-fluoro-orotic acid), 酵母細(xì)胞就不能生長(zhǎng). 將轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-I受體作為反雙雜交系統(tǒng)中的X融合到DB上, FK506結(jié)合蛋白12(FKBP12) 作為Y融合到AD上25, 采用該系統(tǒng)可以檢測(cè)到FK506的活性3, 25, 26. 最近, Young等27采用N型鈣離子通道亞基間相互作用建立的反雙雜交系統(tǒng)對(duì)156 000個(gè)合成的化合物庫(kù)進(jìn)行了系統(tǒng)的篩選, 獲得了一個(gè)較好的抑制N型鈣離子通道的活性小分子, 它有可能發(fā)展成一類新型的、有潛在治療意義的鈣離子通道拮抗劑.由于該方法在細(xì)胞水平篩選, 因此小分子的通透性及細(xì)胞毒性同時(shí)在篩選的內(nèi)容之列. 但正是由于這一點(diǎn), 像其他細(xì)胞水平的篩選方法一樣, 小分子通透性往往影響其活性的檢測(cè), 同時(shí)樣品的用量也較大. 盡管蛋白-蛋白的相互作用在各種疾病中起重要作用, 但目前以此為模型篩選活性小分子還未得到廣泛的應(yīng)用3. 反雙雜交系統(tǒng)在觀念上完全適應(yīng)高通量快速篩選的需要, 隨著人類基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究的進(jìn)展, 越來(lái)越多的與疾病相關(guān)的蛋白間相互作用的闡明必將促進(jìn)反雙雜交系統(tǒng)在活性小分子篩選中的推廣與發(fā)展.2 靶蛋白的鑒定到目前為止, 大約每1 000個(gè)人體蛋白中只有一個(gè)成為藥物篩選的靶蛋白. 現(xiàn)在90%以上的新藥是由大量化合物通過(guò)這些靶蛋白的篩選而獲得的. 據(jù)估計(jì), 人體至少應(yīng)有200 000個(gè)蛋白可以作為藥物篩選的靶蛋白2. 特別是進(jìn)入后基因組時(shí)代, 大量的靶蛋白易于得到, 但如何確定其活性或功能仍是利用其進(jìn)行藥物篩選的前提. 因此, 尋找和確定與疾病相關(guān)的靶蛋白, 進(jìn)而利用這些靶蛋白來(lái)篩選新的活性化合物有很大的發(fā)展?jié)摿?自20世紀(jì)80年代中期, 人們就開(kāi)始利用分離到的活性天然產(chǎn)物來(lái)鑒定靶蛋白, 主要包括利用一些特殊的生化性質(zhì)28,29及細(xì)胞篩選30等, 而親和色譜3140是最常用的方法. 這幾種方法的一個(gè)共同點(diǎn)是在蛋白水平上篩選, 由于很多靶蛋白在生物體中含量較少, 常常給分離鑒定造成很大困難. 最近, 幾種新方法的出現(xiàn)可望解決這個(gè)問(wèn)題.2.1三雜交系統(tǒng)圖5 三雜交系統(tǒng)由活性小分子鑒定靶蛋白原理示意圖三雜交系統(tǒng)(three-hybrid system)41是近幾年在酵母雙雜交技術(shù)21, 22的基礎(chǔ)上發(fā)展的由活性小分子鑒定靶蛋白的方法. 其基本原理與酵母雙雜交類似(圖5), 只是在“鉤”與“魚(yú)”之間加了“餌”構(gòu)成三雜交中的3個(gè)組分: 其中的“餌”是一種修飾過(guò)的活性小分子, 是由活性小分子和配體A連接而成; “鉤”是由配體A的受體蛋白與DB融合而成; “魚(yú)”是由cDNA庫(kù)中的蛋白融合在AD上構(gòu)成. 當(dāng)待篩選靶組織的cDNA庫(kù)中的某一蛋白與小分子相互作用時(shí)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄被啟動(dòng), 這時(shí)細(xì)胞可被明顯檢測(cè). 用地塞米松(一種甾體激素)修飾后的FK506作為餌, 糖皮質(zhì)激素受體與DNA結(jié)合蛋白融合作為鉤, 采用該方法從人cDNA庫(kù)中篩選到FK506的靶蛋白FKBP-1241. 最近在哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞中采用三雜交系統(tǒng)篩選活性小分子的靶蛋白已獲得成功42.2.2功能表達(dá)克隆圖6 功能表達(dá)克隆由活性小分子鑒定靶蛋白原理示意圖與其他方法相比, 通過(guò)功能表達(dá)克隆(functional expression cloning)由活性小分子鑒定靶蛋白具有其獨(dú)特性. 首先, 活性小分子不需衍生或修飾; 其次所用的表達(dá)系統(tǒng)可以是哺乳動(dòng)物或人的組織細(xì)胞, 因此表達(dá)出的靶蛋白通常是經(jīng)過(guò)正常修飾的, 這一點(diǎn)對(duì)于膜蛋白尤其重要. 該方法一個(gè)前提條件是必須明確活性小分子作用的靶組織及小分子作用后引起的靶組織細(xì)胞功能的改變, 以此選擇表達(dá)體系及確定檢測(cè)手段. 辣椒素(capsacin)是紅辣椒的活性成分, 研究推測(cè)其作用于神經(jīng)元的某受體而產(chǎn)生熱疼感. 生理研究發(fā)現(xiàn)辣椒素可導(dǎo)致Ca2+大量流入這些神經(jīng)元細(xì)胞43, 44, 而Ca2+大量流入細(xì)胞可以通過(guò)一定的方法45結(jié)合顯微觀察檢測(cè). 在此基礎(chǔ)上, Clapham等人4648等人采用功能表達(dá)克隆方法由辣椒素篩選到其受體蛋白(圖6), 首先建立神經(jīng)元細(xì)胞的cDNA庫(kù), 將其分為幾個(gè)亞庫(kù), 分別轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞衍生株HEK293(本身不含神經(jīng)元細(xì)胞的基因); 然后用辣椒素分別與之相互作用, 通過(guò)熒光顯微檢測(cè), 顯示信號(hào)的即是含有受體蛋白的亞庫(kù). 將該亞庫(kù)進(jìn)一步分為幾個(gè)次級(jí)亞庫(kù), 采用相同方法進(jìn)行篩選, 如此循環(huán)往復(fù). 每經(jīng)過(guò)一輪篩選, 庫(kù)中顯示信號(hào)的克隆比例得到一次提高, 直至庫(kù)中所用克隆均顯示信號(hào)說(shuō)明篩選完成. 進(jìn)一步的研究證明該靶蛋白是一個(gè)熱傷害敏感的非選擇性陽(yáng)離子通道, 可以直接被辣椒素活化. 這就揭示了辣椒產(chǎn)生熱疼感的本質(zhì), 從分子水平闡明了小分子參與的該生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)過(guò)程.圖7 藥物印跡由活性小分子鑒定靶蛋白原理示意圖2.3藥物印跡藥物印跡(drug-western)是以免疫印跡為基礎(chǔ), 采用標(biāo)記的活性小分子(或藥物)為探針鑒定靶蛋白及其基因的有效方法. 其基本原理48, 49如圖7所示. 首先采用l 噬菌體構(gòu)建靶組織的cDNA庫(kù), 轉(zhuǎn)染大腸桿菌, 這樣培養(yǎng)平板上每一個(gè)菌斑中均表達(dá)cDNA庫(kù)中的一種蛋白; 然后把這些蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上, 將經(jīng)牛血清蛋白(BSA)交聯(lián)的活性小分子與轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白充分作用; 經(jīng)過(guò)適當(dāng)淋洗后, 用BSA抗體-辣根過(guò)氧化酶(HRP)與之作用, 經(jīng)相應(yīng)的化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè). Tanaka等人49采用該方法, 用一種抗腫瘤的磺胺藥從人胎盤(pán)cDNA庫(kù)的200萬(wàn)個(gè)菌落中篩選到10個(gè)與之相互作用, 其中6個(gè)與已知的蛋白毫無(wú)同源性, 剩余4個(gè)分別是生長(zhǎng)激素, 促性腺激素, 轉(zhuǎn)錄因子NF-Y的B亞基和胸腺素-10. 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)后面兩個(gè)正是該藥物發(fā)揮作用的靶蛋白.上述3種由活性小分子篩選靶蛋白的方法與傳統(tǒng)方法相比有很大改進(jìn). 由于結(jié)合了基因的表達(dá)克隆, 大大提高了檢出低豐度靶蛋白的能力; 同時(shí)由于與基因相關(guān)聯(lián), 也加快了由蛋白到基因的速度. 但嚴(yán)格地說(shuō), 3種方法仍是蛋白水平上篩選的改進(jìn). 因此, 一步完成活性小分子到靶蛋白基因水平的鑒定將更適應(yīng)化學(xué)基因?qū)W發(fā)展的要求.2.4展示克隆展示克隆(display cloning)是綜合了親和層析、噬菌體展示和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 技術(shù)發(fā)展的一種由活性小分子直接鑒定細(xì)胞中靶蛋白及其編碼基因的新方法. 該方法一般需要5個(gè)基本步驟(圖8)50: (1) 制備生物素標(biāo)記的活性小分子化合物的探針, 利用生物素結(jié)合蛋白與生物素的親和作用將該探針固定在固相支持物上形成柱體; 同時(shí)構(gòu)建待篩選靶組織細(xì)胞的cDNA噬菌體蛋白展示庫(kù), 并通過(guò)柱體. (2) 洗柱. 由于噬菌體表面所展示的靶蛋白與小分子的相互作用, 展示靶蛋白的噬菌體被牢牢吸附, 而展示非靶蛋白的噬菌體被洗脫. (3) 生物素淋洗. 將生物素標(biāo)記的活性小分子連同結(jié)合的靶蛋白-噬菌體一起由親和柱洗下. (4) 洗下的噬菌體轉(zhuǎn)染大腸桿菌, 含靶蛋白的基因的噬菌體得到大量擴(kuò)增. (5) 分析鑒定. 采用PCR方法對(duì)擴(kuò)增的噬菌體中靶蛋白(或靶蛋白結(jié)構(gòu)域)的基因進(jìn)行擴(kuò)增、分析, 必要的情況下進(jìn)行第2輪篩選.圖8 展示克隆由活性小分子鑒定靶蛋白原理示意圖由于結(jié)合了噬菌體展示和PCR方法, 該方法減少了多步篩選造成的高背景及不確定性等問(wèn)題, 可以一步完成由活性小分子到靶蛋白基因的克隆; 理論上不僅可以獲得與天然產(chǎn)物作用最強(qiáng)的靶蛋白, 而且同時(shí)還能得到一系列與天然產(chǎn)物相互作用的靶蛋白或靶蛋白的結(jié)構(gòu)域. 利用該方法, Sche等50成功地實(shí)現(xiàn)了由免疫抑制劑 FK506直接篩選出FK506結(jié)合蛋白(FKBP12)基因. 他們利用生物素標(biāo)記的FK506分子為探針, 選用新型的T7噬菌體展示系統(tǒng)51構(gòu)建人腦的cDNA展示庫(kù). 該系統(tǒng)中由于外源的待展示基因插入在包被蛋白cp10的C端, 不影響正常表達(dá)及展示, 同時(shí)該展示系統(tǒng)具有良好的分泌性. 經(jīng)過(guò)洗柱、淋洗及轉(zhuǎn)染之后, 根據(jù)噬菌體已知的DNA序列設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增cDNA的插入片段進(jìn)行分析. 篩選前擴(kuò)增產(chǎn)物雜亂無(wú)章; 經(jīng)過(guò)第1輪篩選, 可以得到特異性很強(qiáng)的幾組, 說(shuō)明這些基因所編碼的蛋白或結(jié)構(gòu)域與該天然產(chǎn)物有或強(qiáng)或弱的相互作用; 經(jīng)過(guò)第2輪篩選, 可以得到單一的擴(kuò)增產(chǎn)物, 經(jīng)DNA順序分析表明與FKBP12的編碼基因一致, 說(shuō)明該基因編碼的蛋白與FK506有更強(qiáng)的相互作用.展示克隆方法一經(jīng)提出立即引起了人們極大的興趣52, 雖然目前還沒(méi)有其他成功范例的報(bào)道, 但無(wú)論從創(chuàng)新性和實(shí)用性方面考慮, 該方法在觀念上都不失為一種現(xiàn)代分子生物學(xué)與有機(jī)化學(xué)的完美結(jié)合, 它將為人們由活性小分子到靶蛋白的篩選提供一種嶄新的思路與手段. 但是該方法對(duì)展示系統(tǒng)的要求較高, 因?yàn)樯矬w中許多靶蛋白要經(jīng)過(guò)翻譯后加工, 如磷酸化、酰基化及糖基化等, 另外多亞基蛋白的組裝也是展示系統(tǒng)面臨的挑戰(zhàn)之一. 因此, 發(fā)展新型的、對(duì)展示蛋白能夠進(jìn)行修飾及組裝且具有普適性的展示系統(tǒng)是該方法未來(lái)的發(fā)展方向之一, 如桿狀病毒(Baculovirus)展示系統(tǒng)52或新型的酵母展示系統(tǒng)5356等.2.5以基因組為基礎(chǔ)的靶蛋白鑒定及小分子參與的生物大分子調(diào)控DNA芯片及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展及在鑒定靶蛋白、了解小分子參與方面的應(yīng)用適應(yīng)了人類基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及化學(xué)基因組學(xué)發(fā)展的需要, 因?yàn)閷?duì)小分子作用后的細(xì)胞進(jìn)行基因組水平的分析, 探明小分子對(duì)基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的影響是具有普適性的方法之一, 同時(shí)可以提供有關(guān)代謝過(guò)程及基因組方面的信息57. 其最基本的實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)活性小分子作用后靶組織細(xì)胞中mRNA豐度的增加或減少, 最基本的工具是DNA芯片. 首先, 分別從靶組織細(xì)胞及小分子處理后的靶組織細(xì)胞中提取mRNA, 標(biāo)記, 然后將之與cDNA陣列(或芯片)58或寡核苷酸芯片59雜交. 通過(guò)檢測(cè)已知基因表達(dá)的變化, 可以闡明小分子參與所引發(fā)的一系列代謝及調(diào)控過(guò)程; 而未知基因表達(dá)的變化可以以不同的小分子為探針, 通過(guò)指紋對(duì)比研究基因、蛋白的功能.最近, 采用DNA芯片技術(shù), 將酵母基因組與小分子參與的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜(transcriptional or expression profiling)相結(jié)合, 可以用來(lái)鑒定靶蛋白. 原理48如圖9所示. 首先構(gòu)建缺失某一假定靶蛋白基因的酵母突變株, 將野生型及突變株分別用活性小分子處理, 提取處理前后的mRNA, 反轉(zhuǎn)錄為熒光標(biāo)記的cDNA; 然后與DNA芯片雜交以確定每一樣品的mRNA豐度. 在第1組實(shí)驗(yàn)中, 對(duì)野生型酵母經(jīng)小分子處理前后進(jìn)行比較(A比B); 第2組實(shí)驗(yàn)中, 未經(jīng)小分子處理的野生型酵母與突變株酵母進(jìn)行比較(A比C). 若缺失的是活性小分子的靶蛋白基因, 則兩組實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜相似; 反之若缺失的不是靶蛋白基因, 二者轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜明顯不同. 如用FK506處理后酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄分布圖與缺失鈣調(diào)磷酸酶(Calcineurin)后的酵母突變株轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜十分類似, 進(jìn)一步證明鈣調(diào)磷酸酶確是FK506的靶蛋白之一60. 該方法的一種改進(jìn)法是將缺失某一假定靶蛋白基因的酵母突變株經(jīng)活性小分子作用前后的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行比較(C比D), 若缺失的是靶蛋白基因, 則轉(zhuǎn)錄表達(dá)沒(méi)有變化, 圖上無(wú)信號(hào); 反之若缺失的不是靶蛋白基因, 二者變化明顯. 當(dāng)用FK506處理缺失鈣調(diào)磷酸酶后的酵母突變株, 發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)與處理前相比有幾處變化, 說(shuō)明在酵母細(xì)胞中還有其他靶蛋白60. 該方法最大的優(yōu)越性是活性小分子不需衍生化, 且可以揭示小分子參與的代謝及調(diào)控過(guò)程, 研究基因、蛋白的功能. 但對(duì)靶組織有嚴(yán)格的要求, 即靶組織中的蛋白必須是可以通過(guò)基因缺失而完全失活. 目前滿足這一要求的有細(xì)菌、酵母、果蠅、線蟲(chóng)及小鼠等.圖9 轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜與基因組相結(jié)合鑒定靶蛋白若前者信號(hào)強(qiáng)顯示紅色, 在圖中以圈表示; 后者信號(hào)強(qiáng)顯示綠色, 以點(diǎn)表示; 二者信號(hào)相同無(wú)顯示最近Stockwell等人61綜合多種篩選方法篩選活性小分子, 再進(jìn)一步由活性小分子鑒定靶蛋白, 研究小分子參與的調(diào)控, 是化學(xué)基因?qū)W取得成功的明顯例子. 首先在細(xì)胞水平對(duì) 16 000種化合物進(jìn)行了初篩61, 62, 得到4種活性小分子; 進(jìn)一步以細(xì)胞印跡篩選它們, 從中獲得兩個(gè)活性化合物. 分別提取這兩種活性分子處理前后酵母細(xì)胞的mRNA, 反轉(zhuǎn)錄為熒光標(biāo)記的cDNA, 與酵母基因的DNA芯片雜交, 研究其差異表達(dá)譜的變化. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)分子對(duì)酵母基因表達(dá)沒(méi)有明顯影響, 另一個(gè)活性小分子增加5個(gè)基因的表達(dá), 其中3個(gè)是已知的, 分別編碼熱休克蛋白HSP26、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZRT1及依賴于銅的鐵氧化酶FET3, 在酵母中它們與維持金屬離子的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有關(guān); 另外兩個(gè)新基因YDR534C和YOL155C可以被細(xì)胞內(nèi)Cu2+, Fe3+及Zn2+的含量所調(diào)控; 其編碼的蛋白還有待于進(jìn)一步研究.3 適應(yīng)于化學(xué)基因?qū)W的靶蛋白與活性小分子篩選棗小分子印跡隨著新技術(shù)的引入63, 64, 化學(xué)家結(jié)合固相合成方法65合成了大量天然產(chǎn)物的類似物作為篩選蛋白配體的小分子庫(kù), 但是如何充分利用已有的各種靶蛋白來(lái)快速篩選其中可能含有的所有活性配體及利用已有的活性小分子來(lái)快速確定某一細(xì)胞、組織或生物體中所有的小分子參與的蛋白調(diào)控仍是問(wèn)題的關(guān)鍵. 最近, 借鑒DNA芯片技術(shù), 人們發(fā)展了一種稱為小分子印跡(small molecule printing, SMP)的技術(shù)來(lái)篩選靶蛋白的小分子配體及研究小分子參與的蛋白調(diào)控66. 首先, 將應(yīng)用組合化學(xué)在固相載體上合成的有機(jī)小分子分別溶解在適當(dāng)溶劑中, 采用高精度的機(jī)器人58將1 nL含有每一種有機(jī)小分子的樣品溶液精確定位點(diǎn)樣于一塊經(jīng)過(guò)處理的載片上. 所有化合物均含有共同的連接反應(yīng)官能團(tuán), 可以通過(guò)共價(jià)鍵的形式將小分子固定在載片上, 這樣每一種有機(jī)小分子就被固定在特定的位置上形成高密度的小分子陣列(目前可以達(dá)到1 000個(gè)點(diǎn)/cm2). 在此基礎(chǔ)上, 這些小分子可以依次被多種標(biāo)記的靶蛋白分別進(jìn)行篩選, 當(dāng)某一小分子與某種靶蛋白發(fā)生結(jié)合時(shí)可通過(guò)熒光偶聯(lián)檢測(cè). 該方法選擇性好, 靈敏度高, 不僅可用于靶蛋白配體的有效篩選, 結(jié)合親和層析還可用于靶蛋白的純化及測(cè)定小分子配體與靶蛋白的結(jié)合動(dòng)力學(xué). 目前SMP在3類已知的靶蛋白配體篩選中得到初步驗(yàn)證66. 該方法另一個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)是有機(jī)小分子用量少(每一個(gè)直徑為425 m的聚苯乙烯固相單體上合成的量可至少產(chǎn)生7 200個(gè)點(diǎn)), 因此用盡可能多的、功能明確的活性有機(jī)小分子依次排列制成的高密度小分子陣列來(lái)篩選任何感興趣的細(xì)胞、組織或生物體中的所有蛋白, 理論上凡是有小分子參與的對(duì)所有靶蛋白的調(diào)控均可以檢測(cè)到, 這對(duì)于功能基因組及化學(xué)基因?qū)W的研究有重要的意義.SMP的提出是現(xiàn)代有機(jī)化學(xué)、生物學(xué)、藥物化學(xué)及DNA芯片技術(shù)等現(xiàn)代科技發(fā)展的必然結(jié)果, 是一種觀念上各學(xué)科精髓的高度綜合, 適應(yīng)了人類基因組計(jì)劃發(fā)展的需要. 與其他方法相結(jié)合, 其進(jìn)一步發(fā)展必然為后基因組時(shí)代的研究提供有效的工具.4 展望: 化學(xué)基因?qū)W與中草藥現(xiàn)代化當(dāng)歸龍薈丸是中國(guó)傳統(tǒng)中藥, 具有瀉火通便的功效67, 近來(lái)發(fā)現(xiàn)可用于治療慢性白血病, 其中靛玉紅(indirubin)是主要的活性成分68, 可以抑制 DNA的合成69, 其許多類似物具有良好的抗腫瘤活性70, 但作用機(jī)理一直不清楚. 以往的研究發(fā)現(xiàn)依賴于細(xì)胞周期蛋白的激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)對(duì)細(xì)胞周期的起始具有決定性作用, 同時(shí)參與細(xì)胞周期的分裂循環(huán)71. 而CDKs的化學(xué)抑制劑往往具有很好的抗腫瘤活性, 還可用于心血管疾病等的治療72. 最近, 德、法、英3國(guó)科學(xué)家在從中國(guó)傳統(tǒng)中藥藥用植物中尋找抗腫瘤化合物時(shí), 發(fā)現(xiàn)靛玉紅及其類似物可選擇性地抑制CDK2而阻斷細(xì)胞的分裂73. 他們還通過(guò)兩種靛玉紅類似物與CDK2復(fù)合物的晶體X射線衍射分析闡明了抑制劑與CDK2的ATP結(jié)合口袋的相互作用是該類化合物具有生物活性的根本原因. 這一機(jī)理的闡明把人們對(duì)中草藥的認(rèn)識(shí)提高到一個(gè)新的層次, 同時(shí)該靶蛋白模型的確證也為進(jìn)一步篩選高效低毒的抗腫瘤藥物奠定了基礎(chǔ).圖10 中草藥現(xiàn)代化設(shè)想示意圖中草藥是中國(guó)人民在長(zhǎng)期與疾病作斗爭(zhēng)中積累的經(jīng)驗(yàn)總結(jié), 在中華民族的發(fā)展及人民健康事業(yè)中起了重要作用. 但由于中藥缺乏系統(tǒng)的現(xiàn)代科學(xué)基礎(chǔ)研究, 未能進(jìn)入國(guó)際天然藥物市場(chǎng)的主流. 中藥在國(guó)際市場(chǎng)上未得到廣泛承認(rèn)的主要原因之一是大多數(shù)中草藥的作用機(jī)制不清楚, 有效成分不明確, 或缺少嚴(yán)格的質(zhì)量指標(biāo). 要使中草藥走向世界, 與世界現(xiàn)代醫(yī)學(xué)接軌, 并打開(kāi)國(guó)際市場(chǎng), 就必須加強(qiáng)基礎(chǔ)研究, 在中草藥研究中發(fā)展并廣泛應(yīng)用高新技術(shù), 結(jié)合當(dāng)前人類基因組研究、蛋白質(zhì)組研究的最新成果, 在細(xì)胞、分子及化學(xué)鍵水平上闡明其治療的科學(xué)原理, 實(shí)現(xiàn)中草藥現(xiàn)代化. 綜合應(yīng)用有機(jī)化學(xué)、分子生物學(xué)結(jié)合現(xiàn)代波譜學(xué)等手段建立并發(fā)展研究中草藥中活性有機(jī)小分子與生物大分子間相互作用、相互識(shí)別的高技術(shù), 不僅可以闡明許多中草藥的作用機(jī)制, 促進(jìn)中草藥現(xiàn)代化, 而且對(duì)于開(kāi)發(fā)具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新藥具有重要意義(圖10).隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)展, 蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)代的到來(lái), 一個(gè)新的融合有機(jī)化學(xué)、分子生物學(xué), 以研究活性有機(jī)小分子和靶蛋白相互作用、尋找和篩選新藥為目的的化學(xué)基因?qū)W正在形成. 如果人類基因組計(jì)劃的目標(biāo)是“分析人體所有基因”, 蛋白組學(xué)研究的目標(biāo)是“確定每一個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物及其功能”, 那么化學(xué)基因?qū)W研究的最終目標(biāo)就是“鑒定每一個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物的小分子參與物”74. 由于有機(jī)化學(xué)、分子生物學(xué)、基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)等研究提供了充足的小分子及靶蛋白, 人們可以根據(jù)需要隨意地以活性小分子為探針鑒定靶蛋白, 通過(guò)它們之間的相互作用來(lái)研究其結(jié)構(gòu)與功能, 從本質(zhì)上理解小分子對(duì)生命活動(dòng)調(diào)節(jié)、作用的機(jī)理; 同時(shí)結(jié)合組合化學(xué), 利用靶蛋白來(lái)進(jìn)一步篩選更為有效的藥物先導(dǎo)化合物. 這樣人們對(duì)于生命的理解必然進(jìn)入一個(gè)新的層次, 因而有可能從更深刻理解分子相互作用原理上控制嚴(yán)重威脅人類健康的疾病.唐功利（中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生命有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海200032.）麻錦彪（中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生命有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海200032.）吳厚銘（中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生命有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海200032.）陳海寶（中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生命有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海200032.）參 考 文 獻(xiàn)1，Mitchison T J. 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