常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué)課件

常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 1 實用組織化學(xué)技術(shù) 2 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 細胞化學(xué)和組織化學(xué)cytochemistryandhistochemistry是以細胞學(xué) 組織學(xué)為基礎(chǔ) 運用物理的和化學(xué)的技術(shù)方法顯示細胞組織結(jié)構(gòu)中各種化學(xué)成分 并對這些化學(xué)物質(zhì)進行定性 定位 定量 半定量 從而分析研究生物在生理或病理狀態(tài)下細胞組織的代謝 機能及形態(tài)變化規(guī)律 其在醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用價值 3 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 細胞和組織化學(xué)方法其原則上是運用已知的化學(xué)反應(yīng)過程使細胞組織內(nèi)的各種化學(xué)物質(zhì)在原位形成可見的最終有色產(chǎn)物 光學(xué)顯微鏡觀察 顯微鏡細胞組織化學(xué)電子顯微鏡觀察 電鏡細胞化學(xué)免疫技術(shù)方法 免疫組織化學(xué)免疫電鏡細胞化學(xué)用細胞和組織化學(xué)方法顯示細胞組織結(jié)構(gòu)中各種酶的定性 定位 定量 酶組織化學(xué)酶組織化學(xué) 宏觀酶組織化學(xué)光鏡酶組織化學(xué)電鏡酶組織化學(xué) 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 4 小腦挫傷 蘇木素 伊紅染色 HE 5 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 酶組織化學(xué)染色 脫氫酶 NBT NBT 6 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 酶組織化學(xué)染色 SDH 7 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 細胞和組織化學(xué)方法研究的范圍1 組織細胞中的無機物質(zhì) 主要包括鉀 鈣 鋅 銅 汞等金屬 氯化物 磷酸鹽等鹽類 以及各種無機放射性物質(zhì)等 2 組織細胞中的有機物質(zhì) 主要包括中性脂肪 磷脂類 膽固醇 中性和酸性粘多糖類 糖原 粘液蛋白 淀粉 類淀粉物質(zhì) 黑色素 脂褐素 膽色素 氨基酸 肽 蛋白質(zhì) DNA RNA 各種維生素等 3 組織細胞中各種酶類 如堿性磷酸酶 酸性磷酸酶 膽堿酯酶 細胞色素氧化酶 琥珀酸脫氫酶 乳酸脫氫酶等 蛋白質(zhì) 8 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 細胞和組織化學(xué)方法的特點 1 必須最大限度地保存細胞和組織中各種化學(xué)成分和 或酶的活性 以保證定性 定量研究 2 必須最有效地保持細胞組織固有的形態(tài)結(jié)構(gòu) 以保證化學(xué)成分和各種酶在細胞組織中的定位 3 必須掌握被檢測的化學(xué)物質(zhì)特性 如水溶性 脂溶性 溶解度及特異反應(yīng)等 4 必須掌握被檢測各種酶的特性 如酶的功能 酶存在的特定部位 酶反應(yīng)的適宜溫度和酸堿度 酶的特異激活劑和抑制劑 影響酶活性的因素等 5 必須做對照實驗 借助陽性和陰性對照 正確分析實驗結(jié)果 注意識別假陽性結(jié)果 9 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 細胞和組織化學(xué)方法的基本技術(shù) 取材固定水洗脫水透明浸蠟與包埋切片染色 脫蠟 脫苯 水化 染色 脫水 透明封片 10 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 一 取材 基本要求 取材是否正確 恰當(dāng) 直接影響切片的制作及正確診斷 1 取材越快越新鮮越好 防止組織自溶 腐敗 2 取材刀要鋒利 切取時刀口垂直地切取 嚴禁擠壓 嚴禁用鉗鑷鉗夾 以免使組織或細胞變形造成人為的損傷 3 取材大小 一般長l 3厘米 寬1 2厘米 厚度為0 3 0 5厘米 科研用光鏡標本不超過1cm 1cm 1cm 電鏡標本直徑約0 5mm 過大材料在短時間內(nèi)不易固定透 影響效果 4 要兼顧病變部位與正常部位 5 盡可能在低溫條件下操作 0 4 11 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 各器官取材方法 腦 取材應(yīng)能反應(yīng)出腦各部位的變化 一般采用冠狀切面法 全腦包括 橋腦 延腦 小腦和脊髓頸段及脈絡(luò)叢 取材部位如下 額極 中央前后回 海馬 內(nèi)囊 丘腦 枕葉 脈絡(luò)叢 中腦 橋腦 延髓 小腦 脊髓頸段 取材時要包括軟腦膜 室腦膜或軟脊膜 刀要鋒利 垂體 取垂體時注意前 中 后葉和垂體柄都要兼顧 從前向后縱切 12 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 心 一般悄況下將心房 瓣膜 心室一起取下 也可分別取一塊病變部位連同正常組織 也可單獨取心室肌 乳突肌組織 肺 常規(guī)取材應(yīng)包括左 右兩肺 五個肺葉 可根據(jù)病變需要決定取材塊數(shù) 特殊情況下為區(qū)別在哪個肺葉上取的材可用形狀做標志 在記錄時記清楚 腎 取材包括被膜 皮質(zhì) 髓質(zhì)和腎盂 并要求區(qū)別左 右腎 胰 常規(guī)取胰體部 為長方形必要時加取胰頭 胰尾 肝 取長方形或三角形均可 帶被膜 脾 取材帶被膜 13 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 管腔臟器 取材時注意方向大 小腸 考慮環(huán)行肌肉 沿腸管的長軸取 縱切 食管 以橫切面為宜 胃 常規(guī)取材以胃底為好 氣管 橫切 縱切均要有 總之管腔臟器的各層構(gòu)造都要取到 為了防止標本入固定液后變形 將材料取下后 如剪開的大小腸 胃等組織 將漿膜面鋪在濾紙上 然后入固定液內(nèi) 這樣能防止或減少組織受壓變形與收縮 14 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 二 組織固定 組織固定的意義 組織固定是做好切片的重要步驟之一 如果首次固定失敗 再重新固定也不如一次固定成功好 無法補救 處死動物立即取材 這時組織及細胞在一定時間內(nèi)仍然延續(xù)著生命活力 迅速將其固定能有效地防止組織及細胞發(fā)生死后的一系列變化 固定的關(guān)鍵在于取材后盡可能地及時地將取到的材料進行固定 抑制其死后變化的進展 盡力使組織接近于生前狀態(tài) 另外 在標本制做過程中經(jīng)過許多步驟 為了防止組織成份的溶解消失 有必要及時轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì) 從而有利于保存 15 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 組織固定的目的 阻止死后變化 防止組織的自溶與腐敗 使組織的結(jié)構(gòu)保存下來 如蛋白質(zhì) 脂肪 糖元 酶等各種成份與生活時的形態(tài)相仿 便于染色 同時對組織有媒染作用 使不同的組織成份對染料有不同的親和力 使細胞各部易于受色 能使組織硬化 為做薄切片打下基礎(chǔ) 16 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 組織固定的注意事項 材料塊不能過大 固定器皿不易過小 固定液量不易過少 大約是固定材料體積的20 40倍 根據(jù)檢驗?zāi)康牟煌x擇不同固定液 如做糖元檢查就不能用含水的固定液 做電鏡檢查就必須用鋨酸固定液等 17 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 固定液 用以固定組織的藥劑 固定液分為兩大類 單純固定液 僅由一種藥劑組成 混合固定液 或復(fù)合固定液 由二種以上的藥劑組成的固定液 固定液選擇標準 具有強的穿透力 固定均勻 能迅速滲透組織內(nèi)部 使組織細胞結(jié)構(gòu)保持生活時期的相仿狀態(tài) 不使組織過度收縮與膨脹而變形 能迅速使組織中的蛋白質(zhì) 糖 脂肪等物質(zhì)凝固而成為不溶性物質(zhì) 使組織達到一定的硬度 便于切片制作 染色 價格便宜 容易買到 同時要配制方便 18 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 常用的單純固定液乙醇 酒精 alcohol甲醛 福爾馬林 緩沖液配制 formalin重鉻酸鉀potassiumbichromate苦味酸picricacid鋨酸osmicacid丙酮acetone冰醋酸glacialaceticacid多聚甲醛緩沖固定液paraformaldehyde戊二醛磷酸緩沖固定液glutaricdialdehyde 19 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 1 乙醇 酒精 Alcohol它是一種還原劑 不能與氧化劑混合使用 固定用酒精最好濃度在70 80 酒精濃度愈大 組織收縮愈嚴重 反之 濃度太低起不到固定作用 由于酒精能沉淀白蛋白 球蛋白和核蛋白 而后者的沉淀物易溶于水 所以用酒精固定的標本細胞核染色不佳 酒精還可溶解脂肪 血紅蛋白和多種色素 所以做脂肪染色必須要用冰凍切片 20 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 乙醇優(yōu)點 使用方便 經(jīng)濟 國內(nèi)市售有 95 的乙醇和無水乙醇 100 能硬化組織 起固定作用 也是一種最常用的脫水劑缺點 穿透力小 由于表面硬化 固定液不容易滲透到組織中去 所以用乙醇固定的組織材料要小 組織收縮嚴重 染色效果一般 21 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 2 甲醛 福爾馬林 formalin是一種還原劑 不能與氧化劑混合使用 它是一種最常用的固定液 可應(yīng)用于組織學(xué) 酶組織化學(xué) 免疫組織化學(xué)等染色 最好臨用時現(xiàn)配 目前認為甲醛是一種致癌劑 致畸劑等 甲醛液是一種無色透明極易揮發(fā)有強烈刺激性氣味的液體 商品甲醛為37 40 甲醛水溶液 也即福爾馬林 一般固定用配制的濃度為4 8 習(xí)慣上稱為10 或20 的福爾馬林 此液可按前述取材大小在常溫下固定24小時 48小時 若需要快速固定 可加溫到70 80 或者加溫煮沸10分鐘即可達到固定要求 這種快速固定組織塊不宜過厚或過大 缺點是組織收縮較嚴重 22 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 配法 將商品甲醛1份與9份自來水 最好用PBS等緩沖液配制 混合即為4 濃度的甲醛固定液 優(yōu)點 滲透力較強 組織收縮小 細胞核染色較好 缺點 一般質(zhì)量較差的Formalin在低溫下久存容易產(chǎn)生一種白色的沉淀物 稱為三聚甲醛 即付醛 后者經(jīng)氧化便成為甲酸而使溶液呈酸性 可影響細胞核的嗜鹼性染色 糾正辦法 可在備用甲醛溶液中放入適量的碳酸鈣 碳酸鎂或簡便的辦法可在溶液中投入適量的大理石或者白粉筆作為中和劑 另外酸性福爾馬林固定的組織多易產(chǎn)生一種褐色或黑色素稱福爾馬林色素 在切片上見到的是黑色小顆粒 這種色素顆粒即不溶于水也不溶于酒精 影響染色效果和切片的觀察 23 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 除掉福爾馬林色素顆粒的辦法 Schridde氏法25 氨水lml75 酒精200ml切片脫蠟后經(jīng)70 酒精時用上液浸泡半小時或稍長一些時間 然后水洗再行染色 Verocay氏法l 氫氧化鉀lml70 酒精100ml切片脫蠟后經(jīng)80 酒精時入上液處理10分鐘 再經(jīng)70 酒精入水 24 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 3 鋨酸 四氧化鋨 osmicacid 它并不是酸 實際上是一種金屬氧化物 其水溶液呈中性反應(yīng) 為淡黃色結(jié)晶 價昂貴 只適用于特殊染色中 如制作電鏡超薄切片前的小組織塊固定 鋨酸為強氧化劑 不可與酒精及甲醛混用 鋨酸極易揮發(fā) 氣味有強烈的刺激性和固定作用 用時必須十分小心 要有防護措施 特點 它固定的組織必須小而薄 其主要優(yōu)點是能將組織固定與生活時期相仿 鋨酸為脂肪及類脂質(zhì)的優(yōu)良固定劑 特別對顯示線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器有良好的效果 配制 電鏡超薄切片的小組織塊后固定用鋨酸濃度為1 0 2mol L磷酸緩沖液pH7 2 7 410ml 2 四氧化鋨水溶液10ml 25 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 4 丙酮acetone丙酮能使蛋白質(zhì)沉淀 其滲透力強但對組織收縮嚴重 對細胞核的固定欠佳 目前在組織化學(xué)中 特別是酶的保存方面多采用冷丙酮固定法 主要用于磷酸酶及氧化酶的固定 有時也用于混合固定液中 26 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 5 多聚甲醛緩沖固定液paraformaldehyde多聚甲醛4g 加入0 1mol L磷酸緩沖液pH7 2100ml中 加熱60 80 溶解 固定15min 24h 0 4 主要用于科研組織標本的固定 尤其用于免疫組織化學(xué)染色的組織固定 保護抗原決定簇不被封閉 6 戊二醛磷酸緩沖固定液glutaricdialdehyde25 戊二醛10ml 加入0 1mol L磷酸緩沖液pH7 2 7 490ml中 固定時間為60min 0 4 主要用于科研組織標本的固定 尤其用于電鏡超薄切片的小組織塊標本的初固定 27 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 常用混合固定液 種類很多 可根據(jù)檢查目的不同選擇不同的固定液 1 Zenker固定液 重鉻酸鉀2 5g升汞 氯化高汞 HgCl2 5g蒸餾水100ml冰醋酸 臨用時加入 5ml 28 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 配制方法 首先將重鉻酸鉀 升汞和蒸餾水混合后加溫溶解 冷卻后過濾 置于棕色玻璃瓶中避光保存 這種配制的液體一般稱為Zenker氏干液 儲存液 底液 此液較為穩(wěn)定 即使配制1 2年后仍有固定作用 待組織取材時則在Zenker干液100ml中加入5ml冰醋酸即可使用 但加入冰醋酸后必須立即使用 否則失去固定作用 特點 對細胞核 胞漿染色均較清晰 也較穩(wěn)定 對肌組織及結(jié)締組織染色效果好 材料厚度不超過2mm固定3 4小時即可 一般固定為12 24小時 但必須經(jīng)流水洗12 24小時后再經(jīng)酒精脫水 29 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 2 Carnoy固定液純酒精 或者95 6份氯仿3份冰醋酸1份優(yōu)點 此液穿透速度快 小塊組織l 2小時即可 此固定液可固定細胞漿及糖原 冰醋酸對染色質(zhì)有固定作用 同時能抵消由于酒精引起的過度收縮與硬化 為了減少組織的收縮 可采用冷Carnoy液 Carnoy液隨組織一起放置冰箱中固定一般固定時間以不超過12 18小時為好 經(jīng)此液固定的組織可直接入95 或者100 酒精脫水 現(xiàn)用現(xiàn)配為佳 它既可以用于一般組織學(xué)固定 可為組織化學(xué)常用固定劑 特別是用于糖原 DNA和RNA的固定 30 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 組織固定方法 1 原位固定法在動物活體情況下 采用快速邊取材邊滴加固定液 取出標本后再浸泡固定30min 1h 這樣有益于組織結(jié)構(gòu)的保存 以上操作應(yīng)在0 4 下進行 2 浸透固定法預(yù)先冷藏固定液0 4 固定液量應(yīng)是樣品40倍以上 浸泡30 90min或更長 應(yīng)根據(jù)組織和固定液的不同而定 3 培養(yǎng)細胞和涂片固定法單層細胞培養(yǎng)瓶只需將培養(yǎng)內(nèi)蓋片取出浸透固定即可 懸液培養(yǎng)細胞應(yīng)離心濃縮后涂片 或離心管內(nèi)加入固定液2000r min約20min離心成團后制作切片 也可以向離心管內(nèi)加入膠凍再離心 切取離心管尖端膠凍固定 31 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 4 灌注固定法通過心血管途徑將固定劑灌注到全身或某一器官 使生活的細胞在原位迅速固定后再取材 可達到非常好的固定效果 尤其對于腦等需要很長取材時間的器官更有意義 麻醉或頸椎脫臼處死動物后 立即打開胸腹腔和心包 滴溜注射針刺入左心室或主動脈內(nèi) 剪開右心耳排血 立即用含有適量肝素的生理鹽水或緩沖液灌注 清洗血液 然后很快用固定液繼續(xù)灌注 灌注量及灌注壓應(yīng)根據(jù)灌注血管不同而定 大小鼠心灌注時其壓力約為100 150mmHg 灌流量約為5 10ml min 灌注時間一般在5 20min左右 一般以觀察動物肝質(zhì)地變硬為準 灌注固定完成后 也可用緩沖液繼續(xù)灌注清除固定劑 取材 并可用固定液后固定2小時 灌注固定快速均勻 可保存細胞組織的微細結(jié)構(gòu) 但必須掌握操作技術(shù)才可能達到固定目的 32 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 三 水洗 用水道流水洗滌 目的是將組織塊中的固定液取代出來 水洗一定要充分 水洗時間數(shù)小時至24小時 根據(jù)材料多少 大小可靈活掌握水洗工具 可用水洗筐或用紗布包裹 要防止水流大將組織塊沖掉或丟失 科研用小材料也可用PBS液多次浸泡洗滌 但要保證至少4 6小時的洗滌時間 33 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 四 脫水 組織塊固定后雖然已經(jīng)硬化 但達不到切薄片的硬度 必須進行除固定液以外的其它處理 脫水就是繼固定后的重要步驟 經(jīng)固定和水洗后的組織含大量水份 在這種情況下首先必須除去組織內(nèi)部的水份 這種除水的過程叫做脫水 脫水使用的藥劑稱為脫水劑 脫水必須逐漸依次從低濃度酒精開始到高濃度酒精 否則會引起組織強烈收縮變脆 不利制片 但脫水不徹底也很難浸蠟 34 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 常用脫水劑 酒精 丙酮 正丁醇等 1 酒精一股是從70 酒精開始 經(jīng)80 90 95 100 I一100II 每步驟脫水時間根據(jù)材料大小而靈活掌握 一般數(shù)小時到12小時 更換一次酒精 無水乙醇不適合用來配低濃度酒精 價格較貴 取95 酒精70ml加蒸餾水25ml 配成70 酒精95ml 80 酒精取95 酒精80ml加蒸餾水至95ml即可 依次類推 2 丙酮脫水作用與酒精相似 雖然其脫水作用比酒精強 但對組織塊的收縮較嚴重 且價錢較貴 故不宜用于一股組織脫水 丙酮既有脫水作用 又有透明作用 用丙酮固定的材料要小 脫水1一8小時即可 35 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 五 透明 組織塊脫水后需要透明 因為水與蠟不能相交換 需要借助石蠟誘導(dǎo)劑的過渡 石蠟誘導(dǎo)劑滲入之后組織塊往往呈現(xiàn)透明狀態(tài) 習(xí)慣上將石蠟誘導(dǎo)劑滲入組織內(nèi)的過程叫透明 而這種藥劑稱為透明劑 透明的時間依組織塊的大小而定 一般采用20分鐘至1小時左右 如組織塊過大可延長透明時間 透明好的材料如同油炸的感覺 呈透明狀 36 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 最常用的透明劑為二甲苯 氯仿 甲苯 香柏油等 二甲苯 是無色透明的一種有機溶媒 有很強的刺激氣味 易揮發(fā) 長期接觸對粘膜有刺激作用 二甲苯透明組織的作用很強 可使組織收縮變形 故透明時間不宜過長 透明過程中如遇到組織塊內(nèi)部或某一個部位呈白色混濁狀態(tài)時 說明脫水不徹底 進而造成透明不徹底 無法下一步浸蠟 應(yīng)退回到100 酒精中重新徹底脫水 37 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 六 浸蠟與包理 浸蠟的目的是為了能制備一菲薄的切片做準備 將透明好的組織塊浸到石蠟中 使石蠟滲透到組織細胞內(nèi) 將組織細胞內(nèi)的二甲苯完全徹底地取代出來 然后再用石蠟將組織包埋起來 冷卻后 切成小塊 修整好切面 再用切片機切極薄的切片 將這一過程稱為浸蠟與包埋 38 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 蠟的種類 主要有兩類 蜂蠟 是動物體內(nèi)提取的蠟 顏色微黃 故也稱為黃蠟 溶點在54 左右 特點是潤滑帶有粘性 冬天用量比夏天多 石蠟 是由礦物質(zhì)中提取 質(zhì)地較疏松 色白 根據(jù)蠟的溶點不同又可分為軟蠟及硬蠟 溶點在50 以下的石蠟稱為軟蠟 溶點在50 以上的石蠟稱為硬蠟 兩種蠟可以摻合在一起使用 沒條件的情況下可用蠟燭來代替 上海生物制品廠出的石蠟熔點有52 54 56 58 58 60 60 62 這幾種 39 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 具體操作 1 浸蠟將石蠟箱溫調(diào)至58 60 左右 內(nèi)有標明I II III等字樣的蠟杯或蠟缸 組織塊從透明的二甲苯II取出之后 本身帶有少量二甲苯 放入I號蠟杯中2 3小時左右 再將組織塊移入II號蠟杯 純蠟 2 4小時 最后移入III號蠟杯中 純蠟 半天或者稍降蠟箱溫度過夜 注意 浸蠟時蠟杯不要顛倒順序 以免脫苯不徹底 如遇特殊情況需要延長浸蠟時間時可降低蠟箱溫度或關(guān)閉蠟箱需要時再開 溫度越高 時間越長 組織塊收縮越嚴重 而且材料脆 不易切片 40 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 2 包埋 包埋的方法多種 最常用的是石蠟包埋法 除此之外還有火棉膠包埋法 炭蠟包埋法 明膠包埋法及環(huán)氧樹脂包埋法 電鏡用 冰凍切片采用水包埋法或特殊專用包埋劑包埋等 包埋時用純石蠟溶解后 60 倒入包埋框內(nèi)或者用紙盒代替也可 迅速將浸好的組織塊依次擺入框內(nèi) 待蠟逐漸冷卻凝固后就將組織材料一并凝結(jié)在石蠟內(nèi) 然后按大小組織塊切成蠟塊 組織四周蠟邊留0 1厘米左右即可 包埋時組織塊的切面向下 放平 如果操作不熟練或在冬天包埋時最好有一酒精燈 在材料包入石蠟之前稍在酒精燈上過一下 稍加一下溫 以免材料與包埋蠟溫度不符造成材料與包埋蠟有一痕跡 切片時產(chǎn)生分離現(xiàn)象 蠟塊上要燙上標記年號例號等字樣的紙片以長期保存 切完的蠟塊表面要用燙片板燙一下 封閉材料面 隔離空氣接觸 可長期保存材料不干 目前主要用不同規(guī)格的包埋框包埋材料 在包埋機上操作 方便 快捷 41 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 七 切片 載玻片的準備 粘附劑的使用 商品化準備好的載玻片 兩端帶有 標志 無須處理 直接使用 比較昂貴 常規(guī)載玻皮的處理 鉻硫酸浸泡24小時 流水沖洗12小時 蒸餾水洗3遍 烘干 備用 玻片較干凈時 也可用稀鹽酸浸泡 蛋白甘油 用雞蛋清 不要雞蛋黃 用玻璃棒充分攪拌后用數(shù)層紗布過濾后加等量的甘油攪均勻加數(shù)顆麝香草酚 防腐 載玻片上薄層涂抹后晾干 備用 主要用于常規(guī)組織學(xué) 組織化學(xué)染色用 42 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 多聚賴氨酸 poly L lycine PLL 多聚賴氨酸 M W 300kD 0 5g蒸餾水100ml配制方法 稱取多聚賴氨酸 配制0 5 的水溶液 充分混合即可 也可適當(dāng)稀釋配成0 01 0 5 濃度 4 保存 也可在 20 備用 多聚賴氨酸可反復(fù)冰凍 效果無大影響 工作液常用稀釋10 50倍 主要用于免疫組織化學(xué) 原位雜交 TUNEL染色等 43 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) APES粘片劑 Vectabong試劑 3 Aminopropyltriethoxysilane 是一種新型玻片粘附劑 通過對玻璃表面的化學(xué)修飾作用 改變其表面的化學(xué)物理特性 使組織切片牢固地粘貼于玻璃片上 貼上后不易脫落 保留時間較久 一個試劑盒7ml可配成350ml 丙酮 工作液 程序 干凈載玻片 丙酮5min APES 1ml 50ml丙酮 將玻片用鑷子夾住浸入APES試劑1 2次 純丙酮洗2次 干燥 37 過夜 用鋁箔包好 RT存放 備用 鉻礬明膠液 略 甲醛 明膠液 略 注意 備用載玻片均要避免污染 尤其注意防塵 一般可保存半年以上 44 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 制作切片需要的工具 切片刀 磨切機 水浴鍋 干燥箱或烤片機 可用蠟箱代替使用 還需載玻片 手術(shù)刀 毛筆一支 彎鑷子一個 托盤一個 大平皿一個 展片使用 烤片盒或烤片架 蛋白甘油等 切片機 1 切片機種類 有輪轉(zhuǎn)式切片機 滑行式切片機 滑動式 冰凍切片機 超薄切片機 電鏡用 等 2 構(gòu)造 任何一個類型的切片機都是由四個基本部分組成 刀臺 標本臺 旋轉(zhuǎn)輪 控制切片厚度的微動裝置 標有l(wèi) 25或1一50的數(shù)字 每一數(shù)字代表一個微米用 來顯示 可根據(jù)需要厚度來調(diào)節(jié) 一般組織片都采用7 以上四部分共裝在一個鐵制的臺坐上 這樣就組成了各種類型的切片機 最常用的是石蠟切片機 45 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 切片操作 將切割修整好的蠟塊用普通刀片先將蠟塊切面暴露出來 修平 固定在切片機標本臺上并擰緊螺旋 切片刀固定于刀臺上 擰緊固定刀的螺絲 同時調(diào)整刀與蠟塊的切片距離 使刀與蠟塊貼緊后再固定刀臺螺絲 刀的角度為25度角 調(diào)節(jié)微動裝置 調(diào)至切片所需厚度 一般為6 7微米 修材 右手握旋轉(zhuǎn)輪搖把 按順時針方向均勻地搖動直到組織塊切面完整為止 如果以上各部操作正常 此時能切出一條完整的連續(xù)的蠟帶 用毛筆輕輕將蠟帶順刀口挑下 放在托盤內(nèi)待用 46 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 水浴鍋展片 撈片通電后將平皿內(nèi)水溫升至45 左右 將已切好的薄片切割數(shù)片輕漂水中展平 不平時可用小彎鑷子輕輕展平 然后用涂有蛋白甘油等粘附劑的載片在水中選擇完整的切片以一定角度進行撈片 注意事項 1 切片刀要鋒利 否則切片有切痕或組織破碎 甚至切不下來 2 展切片時水溫要適當(dāng) 水溫低展不平切片 影響效果 有皺折 水溫過高切片入水后蠟片及組織熔化 47 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 八 染色 染色前準備工作染色用的工具 12個染色缸或者盛各種不同濃度的酒精染色筐廣口瓶 染色缸及脫蠟 透明用的各二個二甲苯缸 蓋片 帶磨口蓋的樹膠瓶一個 鑷子等 48 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 染色需要的試劑及染色液的配制 鹽酸 酒精 主要是染色分色時用 一般采用0 5 1 的濃度 即在100ml的70 80 酒精中加人0 5或者1ml的濃鹽酸 蘇木素 Hematoxylin 蘇木素為細胞核的染料 不經(jīng)氧化的蘇木素是不具有染色能力的 蘇木素的配方很多 一般組織化學(xué)染色所配制的蘇木素有二類 一類是自然氧化的蘇木素 另一類是加入氧化劑加速氧化的蘇木素 伊紅 曙紅 Eosin 是細胞質(zhì)最常用的染料之一 外觀是紅色粉末 分兩種 一種是酒溶性伊紅 另一種為水溶性伊紅 使用前要看說明以免配錯 一般組織病理學(xué)切片染色 染細胞核用蘇木素 染細胞質(zhì)用伊紅 故稱之為HE染色 蘇木素 伊紅染色法 是諸多染色法的最基本染色法之一 49 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 蘇木素的配方 自然氧化Ehrlieh氏蘇木素蘇木精2g銨明礬3g無水酒精100ml甘油100ml蒸餾水100ml將上述藥品配在一起后裝入玻璃瓶中 敞口罩上數(shù)層紗布以防灰塵落入染液 暴露于陽光中或空氣中自然氧化 此過程也稱為成熟 時間約6 8周以上 染液配制越久其染色能力越強 這種配方一次可以大量配制以備用 50 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) Delafield氏蘇木素蘇木素4g無水酒精25ml銨明礬飽和水溶液400ml銨明礬飽和水溶液有兩種配法 一為10 銨明礬水溶液 另一為1份銨明礬加蒸餾水11份 蘇木精溶入酒精后 加入銨明礬液 倒入玻璃瓶中敞開瓶口 罩以數(shù)層紗布 置光線充足處3至5天過濾 再加入甘油100ml 甲醇100ml 再置光線充足處經(jīng)l個半月至兩個月后成熟 此液可保存多年不壞 染色時多采用蒸餾水稀釋的染色液 51 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 加氧化劑的蘇木素配方 Harris氏蘇木素 液蘇木精lg無水酒精10ml 液鉀 銨 明礬20g蒸餾水200ml先將 用玻璃棒攪拌使蘇木素溶解 再將 液煮沸溶化去火 速加入 液 再加火 煮沸后去火 立即加入氧化汞0 5g 再煮沸迅速冷卻后加入冰醋酸8ml 過濾使用 此液為組織病理學(xué)常用染色液 52 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 伊紅染液的配制 Eosin 配法 0 5 水溶性伊紅取伊紅0 5g加蒸餾水100ml即可 待徹底溶解后使用 0 5 酒溶性伊紅取伊紅0 5g加70 酒精100ml即可 待徹底溶解后使用 53 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 染色方法及步驟 以HE染色為例 1 脫蠟 將干燥的切片入二甲苯I10 20分鐘 然后移入二甲苯 10 20分鐘 2 脫苯 用無水乙醇I脫苯2 5分鐘 再經(jīng)無水乙醇II2 5分鐘 3 水化 再經(jīng)95 90 80 70 酒精各1分鐘 入蒸餾水浸洗數(shù)分鐘 每步操作要輕 4 染細胞核 將切片移入蘇木素染液中染10 20分鐘 5 水洗 水洗一下 將浮在表面的染液去掉 6 l 鹽酸酒精分化 時間幾秒鐘 肉眼觀察切片組織材料呈粉紅色即可 54 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 7 蘭化 水道流水洗 半小時 24小時 切片從粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)轷r艷的蘭色 這過程也稱為蘭化的過程 必要時放入氨水的低堿液中浸幾分鐘 8 染細胞質(zhì) 用0 5 或者l 伊紅水溶液進行染色 1 5分鐘 9 切片脫水 是由低濃度酒精到高濃度酒精 將切片入70 80 90 95 酒精 時間幾秒鐘 時間長了 伊紅易脫色 注意伊紅與蘇木素的對比染色的色調(diào)適合 10 徹底脫水 100 酒精I5 10分鐘 再入100 II酒精5 10分鐘 11 透明 入二甲苯I2 5分鐘 再入二甲苯II2 5分鐘 55 常規(guī)病理組織學(xué)和組織化學(xué) 用中性樹膠進行封固 細胞核經(jīng)蘇木素染成鮮艷的蘭色 細胞質(zhì) 核仁 肌纖維 膠原纖維 紅細胞等呈紅色 HE染色程序 二甲苯I 二甲苯II 脫蠟 無水酒精I 無水酒精II 95 90 80 70 水