培養(yǎng)觀察細菌的簡易方法.doc

培養(yǎng)觀察細菌的簡易方法一、牙垢中的細菌 用消毒牙簽，在自己牙齒縫里挑下一些碎屑，放在潔凈載玻片上的水滴中，調勻，制成涂片。待涂片干燥后，在酒精燈火焰上徐徐來回掠過34次，細菌外面的一些膠質粘著在載玻片上，使細菌固定、稍冷，加一滴亞甲基藍溶液，染色12分鐘后，用清水沖洗，然后蓋上蓋玻片。置顯微鏡下，先用低倍鏡觀察，再換高倍鏡，可觀察到桿菌、弧菌、球菌等。若使用油鏡觀察，效果更清楚明顯。 二、糞池里的細菌 在糞池用吸管吸取一滴漚過的糞混合液上層液體，滴在潔凈的載玻片上，蓋上蓋玻片。置顯微鏡下觀察，先用低倍鏡，后用高倍鏡?？梢姷交畹穆菪皸U菌。注意在觀察時光線應暗些，效果好。 三、酸萊、酸奶中的細菌 取酸菜液上部的白色薄膜或酸奶澄清液，制成臨時裝片，放在高倍鏡下觀察，可看到乳酸桿菌。 四、根瘤菌的觀察 取豆科植物大豆、蠶豆、花生的根瘤用刀片切開，用針挑取一小塊內容物，放在載玻片上的水滴中，制成涂片，晾干后，用酒精燈火焰烘烤固定，然后滴一滴亞甲基藍溶液，染色23分鐘，清水沖洗，蓋上蓋玻片，吸干后，用500倍高倍鏡觀察，可見到短桿狀根瘤菌。 五、枯草桿菌的培養(yǎng)和觀察把25克新鮮干草切成小段，放在盛200毫升清水燒杯中，加熱煮沸15分鐘，待溶液呈暗褐色時，倒入燒瓶，放在黑暗、2030的溫暖環(huán)境中。23天后，液體混濁，表面形成薄膜。用吸管吸取浮在上層的液體，制成臨時涂片，放在高倍鏡下觀察，可看到連成線的枯草桿菌。若將培養(yǎng)液放在低溫處12天，再取出制成臨時涂片，用600倍或更高倍數(shù)的顯微鏡觀察還能看到枯草桿菌的芽孢。微生物學實驗 細菌細胞的生化反應實驗 一、實驗目的 了解并掌握細菌鑒定中常用生理生化反應的原理和方法。 二、實驗原理 各種細菌由于具有不同的酶系統(tǒng)，致使它們能利用不同的底物，或雖然可以利用相同的底物，卻產生不同的代謝產物，因此可以利用各種生理生化反應來鑒別細菌。 糖發(fā)酵是最常用的生化反應，存在于大多數(shù)細菌中。不同的細菌在糖的分解能力上存在很大的差異。有些細菌能分解某種糖并產生酸性物質(如乳酸、丙酸、醋酸等)和氣體(如二氧化碳、氫、甲烷等)，而有些細菌只產生酸不產生氣體。例如大腸桿菌分解乳糖和葡萄糖產酸并產氣，普通變形桿菌分解葡萄糖產酸產氣，但不能分解乳糖。酸的產生可利用指示劑來判斷。在培養(yǎng)基中加入溴甲酚紫(pH52為黃色，pH68為紫色)，當發(fā)酵產酸時，使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。氣體的產生可由發(fā)酵試管中倒置的德漢氏小管中有無氣泡的出現(xiàn)來驗證 三、試劑與器材1.材料大腸桿菌、普通變性桿菌、產氣桿菌、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。2.試劑甲基紅試劑、40KOH、5a一萘酚、乙醚、吲哚試劑。3.實驗器材德漢氏小管、試管、接種環(huán)、恒溫培養(yǎng)箱。 四、實驗內容培養(yǎng)基配制編號試管接種培養(yǎng)觀察結果 五、關鍵步驟及注意事項1.要嚴格按照培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基。2.觀察結果時要注意滴加藥量及反應時間。 六、思考題1.哪些生理生化試驗可用于區(qū)別大腸桿菌和產生腸桿菌?結果如何?2.做糖發(fā)酵試驗時應注意哪些問題?3.甲基紅試驗和伏一普試驗的最終產物如何?為什么會出現(xiàn)不同的最終產物?微生物學實驗 微生物直接計數(shù)法及測微技術 一、實驗目的1.了解血球計數(shù)板計數(shù)原理，并掌握計數(shù)方法。2.掌握用測微尺測定微生物大小的方法。 二、實驗原理 顯微鏡直接計數(shù)法是將一定稀釋的菌體或孢子懸液注入血球計數(shù)板的計數(shù)室中，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。因為計數(shù)板是一塊特別的載玻片。其上由四條槽構成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網，每個方格網共分為九個大方格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格(見圖2344)；另一種是一個大方格分成16個中方格，每個中方格又分成25個小方格，無論哪種每個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為01mm，所以計數(shù)室的容積為01mm3。計數(shù)時，通常只用5個中格內的菌體(孢子)數(shù)即可。然后求出每個中方格的平均值，再乘上25或16，得出一個大方格中的總茵數(shù)，再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。若設5個中方格中總菌數(shù)為N，菌液稀釋倍數(shù)為M，如果是25個中方格計數(shù)板，則計算方法為：lml菌液中的總菌數(shù)=平均每個中格中菌的個數(shù)25104M=50000NM(個)微生物細胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據之一。微生物大小的測定，需要在顯微鏡下，借助于特殊的測量工具測微尺，包括目鏡測微尺和鏡臺測微尺。鏡臺測微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般是將1mm等分為100格，每格長001mm(即10pm)。鏡臺測微尺并不直接用來測量細胞的大小，而是用于校正目鏡測微尺每格的相對長度。 三、試劑與器材1.材料 釀酒酵母、藤黃微球菌和大腸桿菌的染色標本片、釀酒酵母24h馬鈴薯斜面培養(yǎng)物。2.實驗器材 細胞計數(shù)板、顯微鏡、蓋玻片、無菌毛細滴管、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、載玻片、蓋玻片、顯微鏡等。 四、實驗內容1.微生物直接計數(shù)法 菌懸液制備鏡檢計數(shù)室加樣品顯微鏡計數(shù)清洗血細胞計數(shù)板2.微生物測微技術 裝目鏡測微尺校正菌體大小測定 五、關鍵步驟及注意事項1.防止加樣空氣泡產生。2.調節(jié)顯微鏡光線的強弱適當。 六、思考題1.根據你的體會，說明用血細胞計數(shù)板計數(shù)的誤差主要來自哪些方面?應如何盡量減少誤差、力求準確?2.某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請設計12種可行的檢測方法。3.為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微尺進行校正?微生物學實驗 酵母菌的形態(tài)觀察及死活細胞的鑒定 一、實驗目的1.觀察酵母菌的形態(tài)特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌與細菌形態(tài)特征的區(qū)別。2.學習鑒別死活細胞的實驗方法。 二、實驗原理 酵母菌是單細胞的真核微生物，菌體比細菌大而且不運動。酵母菌的繁殖方式分為無性繁殖和有性繁殖兩種，以無性繁殖為主。芽殖是酵母菌普遍的無性繁殖方式，少數(shù)為裂殖；有性繁殖是產生子囊和子囊孢子。本實驗是通過美藍染液水浸片和水一碘液水浸片來觀察酵母的形態(tài)和芽殖方式。 美藍是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍色，還原型無色。用美藍對酵母活細胞染色時，由于細胞的新陳代謝作用，細胞內具有較強的還原能力，能使美藍由藍色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，而對代謝作用微弱或死細胞，無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍染成藍色或淡藍色。因此，不僅用此法可觀察酵母細胞形態(tài)，也可用來鑒別酵母菌的死細胞和活細胞。 三、試劑與器材1.材料 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡爾酵母(Saccharomyces calsbergensis)培養(yǎng)2天左右的麥芽汁(或豆芽汁)液體培養(yǎng)物。2.試劑 0.05和O.1呂氏堿性美藍染色液、革蘭氏染色用的碘液。3.器材 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、灑精燈等。 四、實驗內容1.美藍浸片觀察 酵母培養(yǎng)制片染色鏡檢30分鐘后再鏡檢2.水-碘浸片觀察 五、關鍵步驟及注意事項1.染液不宜過多或過少，否則，在蓋上蓋玻片時，菌液溢出或出現(xiàn)大量氣泡。2.用鑷子取一塊蓋玻片，先將一側與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下，使其蓋在菌液上，蓋玻片不宜平著放下，避免氣泡產生。 六、思考題1.呂氏堿性美藍染液濃度和作用時間的不同，對酵母菌死細胞數(shù)量有何影響?試分析其原因。2.在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特征區(qū)別于一般細菌?微生物學實驗 常用培養(yǎng)基的制備、滅菌與消毒 一、實驗目的了解培養(yǎng)基的配制原理；掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟；了解常見滅菌、清毒基本原理及方法；掌握干熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法。 二、實驗原理培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長繁殖和合成代謝產物所需要的營養(yǎng)物質的混合物。培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因素和水。根據微生物的種類和實驗目的不同，培養(yǎng)基也有不同的種類和配制方法。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細胞生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質，所以可供微生物生長繁殖之用。干熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質變性從而達到殺死微生物的效果。 三、試劑與器材1.器材 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養(yǎng)基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、吸管、培養(yǎng)皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過濾器、鑷子等。2.試劑 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂 四、實驗內容1.稱量溶化調pH過濾分裝加塞包扎滅菌無菌檢查2.干熱滅菌：裝入待滅菌物品升溫恒溫降溫開箱取物3.高壓蒸汽滅菌：加水裝物品加蓋加熱排冷空氣加壓恒壓降壓回零排汽取物無菌檢查4.過濾除菌：組裝滅菌連接壓濾無菌檢查清洗滅菌 五、關鍵步驟及注意事項1.要嚴格按配方配制。2.調pH不要過頭。3.干熱滅菌要注意物品不要堆放過緊，注意溫度的時間控制，70C以下放物、取物。4.高壓滅菌要注意物品不要過多，加熱后排除冷空氣，到時降壓回零取物。5.過濾除菌要注意各部件滅菌，壓濾時，壓力要適當，不可太猛太快，濾膜要注意清洗保存。 六、思考題1.培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌?如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的?2.在配制培養(yǎng)基的操作過程中應注意些什么問題?為什么?3.培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基應具備哪些條件?為什么?4.培養(yǎng)基的配制原則是什么?如何做好鞭毛染色細菌鞭毛染色制片技術是微生物學的重要實驗。鞭毛著生的位置和數(shù)目是種的特征，對細菌分類具有重要意義。鞭毛是細菌的運動“器官”。細菌的鞭毛極為纖細，一般直徑只有1020m，只有用特殊的鞭毛染色法進行染色，才能在光學顯微鏡下觀察；鞭毛染色法的原理是借助媒染劑和染色劑的沉淀作用，使染料沉淀在鞭毛上，使鞭毛直徑增加并著色。 鞭毛染色前幾年多用利夫森（Leifson）氏鞭毛染色法，近年來多用硝酸銀染色法。不論用哪種方法都具有實驗技術要求高、過程復雜、難度較大的特點，故鞭毛染色常常效果不太理想。下面就如何做好鞭毛染色談幾點意見供參考。 1要選好菌種。一般用周生鞭毛菌（如普通變形桿菌Proteus vulgaris）較好，這類菌的鞭毛多而長易于觀察。 2要注意培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間：用點接法在新配制的牛肉膏蛋白胨半固體平板上接種。一般一個平板點接34處。經比較用半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)出來的菌體活動度大，鞭毛長且多，易于染色，這可能與半固體培養(yǎng)基更適于菌體運動、鞭毛生長較好有關。用點接種法在平板上接種更易于挑取邊緣幼齡的菌體。培養(yǎng)時間要嚴格掌握，一般培養(yǎng)912h較好，菌齡超過15h，鞭毛染色效果較差，這可能與老齡菌體活動度降低、鞭毛易脫落有關。冰箱長期保存的菌種不宜直接用于鞭毛染色，需用新制備的斜面連續(xù)轉接23次后再染色。 3所用玻片的準備：用過的舊載片要選擇光滑無劃痕的，放入已加入洗衣粉的蒸餾水中煮沸（如能預先過濾去渣更好），煮畢冷卻后，清水洗凈，放入濃洗液中浸泡24h，取出用清水沖洗殘酸，最后用蒸餾水洗凈，瀝干水并放于95乙醇中脫水，取出后燒去酒精，即可使用。新的載片雖沒有油污、劃痕，但含游離堿較多，所以要用2鹽酸浸泡幾小時，用自來水沖洗干凈，然后再用蒸餾水洗凈，瀝干后再用效果較好。 4染色液一定要新鮮，特別是硝酸銀染色法中更是如此，A染液和B染液最好都現(xiàn)用現(xiàn)配，A液一般不能放置。 5染色過程中的細節(jié)也應充分注意：取菌要取菌落邊緣的幼齡菌體。取菌后的接種環(huán)在載片上的蒸餾水中輕輕沾幾下即可，不要用力太猛，更不能用接種環(huán)大幅度涂開；將載片稍傾斜，使菌液散開即可，否則鞭毛易脫落，造成染色失敗。鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用熱風吹干，不能熱固定，這是由于加熱后菌體易變形，鞭毛易脫落，影響觀察。A染液染35min，其后用蒸餾水（自來水效果差）沖洗時一定要充分，否則加B染液后，背景很臟，鞭毛不易被觀察到，影響實驗效果。加B染液后，將玻片稍加熱（但不能太熱，更不能沸騰或蒸干）使其微冒蒸汽，3060s，染色效果較不加熱為好。B染液染完后，用蒸餾水沖洗比用自來水沖洗效果好。微生物實驗 霉菌的形態(tài)觀察 一、目的要求 掌握觀察霉菌形態(tài)的基本方法，并觀察其形態(tài)特征。 二、基本原理 霉菌菌絲較粗大，細胞易收縮變形，而且孢子很容易飛散，所以制標本時常用乳酸石炭酸棉藍染色液。此染色液制成的霉菌標本片其特點是：(a)細胞不變形；(b)具有殺菌防腐作用，且不易干燥，能保持較長時間；(c)溶液本身呈藍色，有一定染色效果。 霉菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài)，常用載玻片觀察，此法是接種霉菌孢子于載玻片上的適宜培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后用顯微鏡觀察。此外，為了得到清晰、完整、保持自然狀態(tài)的霉菌形態(tài)還可利用玻璃紙透析培養(yǎng)法進行觀察。此法是利用玻璃紙的半透膜特性及透光性，將霉菌生長在覆蓋于瓊脂培養(yǎng)基表面的玻璃紙上，然后將長菌的玻璃紙剪取一小片，貼放在載玻片上用顯微鏡觀察。 三、器材 曲霉（Aspergillussp），青霉（Penicillium sp），根霉（Rhizopus sp），毛霉（Mucor sp）； 乳酸石炭酸棉藍染色液，20甘油，查氏培養(yǎng)基平板，馬鈴薯培養(yǎng)基；無菌吸管，載玻片，蓋玻片，U形棒，解剖刀，玻璃紙，濾紙等。 四、操作步驟 1一般觀察法 于潔凈載玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉藍染色液，用解剖針從霉菌菌落的邊緣處取小量帶有孢子的菌絲置染色液中，再細心地將菌絲挑散開，然后小心地蓋上蓋玻片，注意不要產生氣泡。置顯微鏡下先用低倍鏡觀察，必要時再換高倍鏡。 2載玻片觀察法 (1)將略小于培養(yǎng)皿底內徑