細(xì)胞培養(yǎng)板的選擇與常見問題解答

細(xì)胞培養(yǎng)板的選擇與常見問題解答 細(xì)胞培養(yǎng)板依底部形狀的不同可分為平底和圓底 U 型和 V 型 培養(yǎng)孔的孔 數(shù)有 6 12 24 48 96 384 1536 孔等 根據(jù)材質(zhì)的不同有 Terasaki 板和 普通細(xì)胞培養(yǎng)板 具體選擇時(shí)根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的類型 所需培養(yǎng)體積及不同的實(shí) 驗(yàn)?zāi)康亩?1 平底和圓底 U 型和 V 型 培養(yǎng)板的區(qū)別和選擇 貼壁細(xì)胞一般用平底培養(yǎng)板 懸浮型細(xì)胞的培養(yǎng)一般用 V 型 U 型培養(yǎng)板亦多用于培養(yǎng)懸浮型細(xì)胞 V 型培養(yǎng)板有時(shí)用做免疫學(xué)血凝集的實(shí) 驗(yàn) 不同型狀的板子自然有不同用途 平底的什么類型的細(xì)胞都可用 但當(dāng)細(xì)胞數(shù) 目較少 如做克隆時(shí) 就用 96 孔平底板 另外 做 MTT 等實(shí)驗(yàn)時(shí) 無論貼壁 和懸浮細(xì)胞 一般均用平底板 至于 U 或 V 型板 一般在某些特殊要求時(shí)才使 用 如在免疫學(xué)方面 當(dāng)做兩種不同淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí) 需要二者相互接觸 以刺激 因此 一般需要 U 型板 因細(xì)胞會(huì)由于重力的作用而聚集在一個(gè)很小 的范圍內(nèi) V 型板的用途更少 一般用于細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)時(shí) 為了使效靶細(xì)胞緊 密接觸 常使用 V 型板 但這種試驗(yàn)也可用 U 型板替代 加入細(xì)胞后 低速離 心 如果是養(yǎng)細(xì)胞的話 通常是選用平底的 另外要特別注意材質(zhì) 標(biāo)示 Tissue Culture TC Treated 就是養(yǎng)細(xì)胞用的 圓底的好像沒聽說過拿來養(yǎng)細(xì)胞 圓底的通常是拿來做分析 化學(xué)反應(yīng) 或 是保存樣品用的 因?yàn)閳A底比較好將液體吸得干凈 如果用平底的就不好吸了 不過 如果你是要測(cè)吸光值的話 一定要買平底的才行 大部分細(xì)胞培養(yǎng)都 用平底培養(yǎng)板 便于鏡下觀測(cè) 有明確的底面積 細(xì)胞培養(yǎng)液面高度相對(duì)一致 還便于 MTT 檢測(cè) 圓底培養(yǎng)板主要用于同位素?fù)饺氲膶?shí)驗(yàn) 需要用細(xì)胞收集 儀收集細(xì)胞的培養(yǎng) 如 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 等 2 細(xì)胞培養(yǎng)常見問題與解答 問 我看到培養(yǎng)板有 4 6 12 24 48 96 孔幾種規(guī)格 但不知道到底什么 實(shí)驗(yàn)用哪種規(guī)格 答 要根據(jù)你具體的實(shí)驗(yàn)要求 流式一般用 6 孔 MTT 一般用 96 孔 細(xì)胞爬 片一般用 24 孔等 要具體根據(jù)你實(shí)驗(yàn)來定 問 請(qǐng)問哪位高手知道 Terasaki 板是什么培養(yǎng)板 與普通細(xì)胞培養(yǎng)板有什么區(qū) 別 答 Terasaki plate 主要是用于晶體學(xué)研究 產(chǎn)品設(shè)計(jì)便于對(duì)晶體的觀察與結(jié)構(gòu) 分析 有兩種 sitting 和 handing drop 兩種方法 兩種方法應(yīng)用產(chǎn)品的外形結(jié)構(gòu) 也不同 材料上選擇 crystal class polymer 特殊的材料有利觀察晶體結(jié)構(gòu) 細(xì)胞培養(yǎng)板主要是 PS 材料 材料是 treated sufface 便于細(xì)胞貼壁生長與伸展 當(dāng)然還有浮游細(xì)胞的生長材料 同時(shí)還有 low binding surface 有關(guān)更多實(shí)驗(yàn)材 料上的應(yīng)用與對(duì)材料的選擇 問 我想測(cè)吸光度用酶標(biāo)儀 用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板行嗎 請(qǐng)問酶標(biāo)板 多孔細(xì)胞培 養(yǎng)板有什么區(qū)別 答 用多空細(xì)胞培養(yǎng)板測(cè)吸光度肯定可以拉 我們經(jīng)常用它來做樣品的蛋白定 量和 MTT 檢測(cè) 區(qū)別 酶標(biāo)板一般要比細(xì)胞培養(yǎng)板貴 細(xì)胞板主要做細(xì)胞培養(yǎng) 但也可以用來 測(cè)蛋白濃度 酶標(biāo)板包括包被板和反應(yīng)板 一般不能用做細(xì)胞培養(yǎng) 它主要做 免疫酶聯(lián)反應(yīng)后的蛋白檢測(cè) 它需要更高的要求還需要特定的酶標(biāo)工作液 常 用不同培養(yǎng)板的孔底面積及推薦加液量 不同孔板所加培養(yǎng)液的液面都不宜太 深 一般在 2 3mm 范圍 結(jié)合不同孔的底面積就可算出各培養(yǎng)孔的適宜加液量 若加液量過多會(huì)影響氣體 氧氣 交換 而且在搬動(dòng)過程中易溢出造成污染 具體所加細(xì)胞密度依實(shí)驗(yàn)的目的不同靈活掌握 3 細(xì)胞培養(yǎng)板的密閉和污染問題 細(xì)胞培養(yǎng)板的加樣和操作 細(xì)胞培養(yǎng)板在進(jìn)行細(xì)胞操作時(shí)同樣遵循嚴(yán)格無菌的 原則 各項(xiàng)操作要保證規(guī)范 科學(xué) 不對(duì)細(xì)胞的生長造成額外的影響 這其中 最常見的問題就是如何保證加樣后細(xì)胞的均勻和盡量減少換液對(duì)細(xì)胞生長狀態(tài) 的影響 問 96 24 孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿的蓋子都很松 這樣是方便了透氣 但是細(xì)菌 霉菌等污染物會(huì)不會(huì)也隨著溜進(jìn)去呢 答 1 蓋子很松 屬于半開放培養(yǎng) 這樣的目的是透氣 實(shí)際上是為了使培養(yǎng) 皿外的 co2 能夠與培養(yǎng)皿充分交換 維持培養(yǎng)基的 pH 值 2 凡事有利必有弊 這樣當(dāng)然增加了污染的可能性 此外這樣還會(huì)使培養(yǎng)皿內(nèi) 的液體蒸發(fā) 這對(duì)于精確定量的藥物來說就顯得值得注意了 所以以下二條措 施是必須的 a 培養(yǎng)箱內(nèi)空氣必須清潔 定期紫外線照 酒精擦洗 盡量少開關(guān) 培養(yǎng)箱 b 培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度必須始終保持為 100 培養(yǎng)箱內(nèi)放置無菌蒸餾水的 水槽 就好像培養(yǎng)皿 也是一個(gè)蓋倒扣的容器 也不會(huì)污染 主要是因?yàn)樯w子 L 型邊緣產(chǎn)生氣流負(fù)壓的緣故 灰塵上面才附著有微生物 而氣流攜帶的灰塵是 無法通過產(chǎn)生負(fù)壓的蓋邊緣的 而透氣作用只是通過空氣的擴(kuò)散 不會(huì)產(chǎn)生氣 流 所以只會(huì)透氣不會(huì)透菌 我使用 24 孔板 在其中的某些孔中有操作 在超凈臺(tái)內(nèi) 而其它孔中還有細(xì)胞 要培養(yǎng) 我很擔(dān)心這樣會(huì)污染 不知道要注意什么 大家不知道有什么好的建議 在超凈臺(tái)內(nèi)如果操作規(guī)范的話應(yīng)該可以的 我想你可以充分利用培養(yǎng)版的蓋子 盡量只暴露要操作的孔 將其它孔用蓋子蓋起來 這是我的一點(diǎn)粗淺的見解 拋磚引玉吧 使用前綜合考慮一下 充分使用所以的孔 如果只需要使用少數(shù)的孔可以只用 一邊的 其余用蓋子蓋住 我習(xí)慣于先用右側(cè)的孔 右手加樣方便 其實(shí)自己感覺只要注意無菌操作 一般是不會(huì)污染的 操作時(shí)用幾塊玻片把板 子一側(cè)墊高 不要把蓋子全打開 一般沒問題 4 細(xì)胞分布不均及解決辦法 問 我的細(xì)胞接種培養(yǎng)板 細(xì)胞總是聚集在周邊部分 該如何處理啊 我看園 子里有的戰(zhàn)友的細(xì)胞卻是聚集在中間 是不是板子的質(zhì)量問題啊 答 請(qǐng)問你的細(xì)胞是如何混勻的 是滴管吹打還是振蕩培養(yǎng)板 如果是后者 而且是轉(zhuǎn)圈搖勻的話 很有可能由于離心力的作用使細(xì)胞甩到周邊部分 導(dǎo)致 細(xì)胞中間少 四周多 自己可是試試 周邊一般是相對(duì)會(huì)多一點(diǎn) 但是中間的數(shù)量也不會(huì)很少啊 鋪板的時(shí)候我也沒 有特異去振蕩培養(yǎng)板 大概是板子的質(zhì)量問題吧或者是不是鋪板時(shí)候的細(xì)胞密度太低了 我用的 corning 的板 一個(gè)好辦法 在你培養(yǎng)種板之前 把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里進(jìn)行幾個(gè)小時(shí)的飽和 后再取出 種入細(xì)胞時(shí)力量要輕 可采取用滴頭在培養(yǎng)板孔的側(cè)面慢慢加入讓 細(xì)胞懸液流入板孔中 培養(yǎng)的細(xì)胞基本是均勻生長 記住千萬不要用振蕩器振 蕩 否則你的細(xì)胞就會(huì)想你說得那樣聚積在一起 我今天把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里幾個(gè)小時(shí) 適當(dāng)?shù)陌鸭?xì)胞密度加大了一下 另外 多加了一點(diǎn)培養(yǎng)液 今晚看細(xì)胞鋪的挺好的 我認(rèn)為有兩種可能解決你問題的 辦法 1 加入前吹打均勻 2 從多孔板側(cè)邊或底邊緩慢加入 問 我在做原代培養(yǎng)時(shí)也遇到過這種情況 我一直以為培養(yǎng)皿鋪膠不均勻會(huì)導(dǎo) 致這種現(xiàn)象 因?yàn)榛靹虻难芏渭尤氲脚囵B(yǎng)皿中時(shí) 在相差顯微鏡下血管段均 勻分布在培養(yǎng)皿中 24h 后貼壁的血管段就是周邊多 中間相對(duì)少些 下次我 要試試 hkqu 戰(zhàn)友的方法看能否改變這種現(xiàn)象 答 這種現(xiàn)象很正常呀 不知你仔細(xì)觀察過沒有 孔直徑愈小 這個(gè)現(xiàn)象越明 顯 我試過 24 96 孔板這種現(xiàn)象不可避免 因?yàn)橐后w的附壁使得孔內(nèi)培養(yǎng)液 不是成一個(gè)平面 而是周邊高 就像凹鏡一樣 而使用這兩種孔板由于需要加 干預(yù)等原因而不能加足量培養(yǎng)液 使得細(xì)胞隨培養(yǎng)液一起出現(xiàn) 邊集 現(xiàn)象 如果為了使孔中央也有均勻細(xì)胞而增加接種細(xì)胞數(shù)量的話 這要看你需要觀察 何種指標(biāo) 如果是 MTT 免疫組化的話會(huì)因?yàn)榧?xì)胞成層而影響結(jié)果 5 6 孔板接種和換液問題 問 我的細(xì)胞傳代很正常 但一種到六孔板里 不管加藥和對(duì)照 總有兩三個(gè) 孔 隨機(jī) 細(xì)胞長得不好 很小 像破碎了 有人遇到過這種情況嗎 到底是 啥原因呢 請(qǐng)各位指點(diǎn) 答 可能跟你加液的溫度有關(guān) 如果你細(xì)胞剛剛拿出來換液加液 培養(yǎng)基也是 從 4 度冰箱拿出來不久 很容易細(xì)胞就會(huì)凍死了 建議你最好把培養(yǎng)基先在培 養(yǎng)箱里邊孵育 15min 先 另外 跟你細(xì)胞的生長狀態(tài)也有關(guān) 加藥之前的細(xì)胞可以用高點(diǎn)的血清濃度培 養(yǎng) 保證細(xì)胞狀態(tài)良好 或者放在 37 度水浴鍋里孵育也可以 或者是培養(yǎng)板本身的問題 你再換換其它 培養(yǎng)板試試看 再有可能就是細(xì)胞狀態(tài)問題了 種板時(shí)的血清濃度調(diào)高試一下 問 最近幾天 我用六孔培養(yǎng)板接種細(xì)胞 培養(yǎng) 24 小時(shí)后更換培養(yǎng)基 在更換 培養(yǎng)基之前 顯微鏡觀察到細(xì)胞貼壁 狀態(tài)非常的好 更換了培養(yǎng)基后 立即 用顯微鏡觀察 發(fā)現(xiàn)每個(gè)孔中都近乎有一半的細(xì)胞表現(xiàn)出近乎死亡的狀態(tài) 細(xì) 胞變得非常小 產(chǎn)生大量的碎片 而另一半的細(xì)胞一切正常 異常細(xì)胞與正常 細(xì)胞之間存在一條分水嶺 上半個(gè)圓是好的 下半個(gè)圓就不好 這是怎么一回 事 答 你可以看一下是不是培養(yǎng)板沒放水平 有一回我也出現(xiàn)過這種情況 你的培養(yǎng)液如何 如果培養(yǎng)液過期 細(xì)胞就不會(huì)貼壁 換一點(diǎn)新配制的培養(yǎng)液 試一試 我也經(jīng)常碰到 我想可能是板的問題 換一個(gè)牌子的板或換用培養(yǎng)瓶就沒問題 了 不知樓主所需換液的培養(yǎng)板多不多 換培養(yǎng)基的時(shí)候如果沒有注意風(fēng)機(jī)的影響 特別是所需換液的培養(yǎng)板很多時(shí) 容易使細(xì)胞因風(fēng)吹失水而干縮破裂 如果如 此 換液時(shí)應(yīng)該逐個(gè)培養(yǎng)板進(jìn)行 別怕浪費(fèi)吸管 注意操作的效率 6 24 孔板接種問題 問 把細(xì)胞消化接種到 24 孔板之后 已經(jīng)四天了 老是每孔的中間部分長不滿 每天換液時(shí)都用 PBS 清洗 第二天換液時(shí)都出現(xiàn)同樣的情況 每孔的邊緣長的 很好 中央大量死細(xì)胞 答 我是選擇孔內(nèi)鋪蓋玻片 在玻片上種植 每次換液都用 PBS 洗 必要的步 驟嗎 另外 也有可能和細(xì)胞種類有關(guān)或者和培養(yǎng)液有關(guān) 我想你的培養(yǎng)液可能加的太少了 由于表面張力的作用 培養(yǎng)板的邊緣液體會(huì) 向上走 造成培養(yǎng)液面呈現(xiàn)一個(gè)凹面 就像量筒的液體凹面一樣 中央的細(xì)胞 正好在凹面的最低處 培養(yǎng)液少 細(xì)胞的營養(yǎng)不夠 甚至干涸掉 空氣中的氧 氣也會(huì)造成損傷 即使有增值過來的細(xì)胞也會(huì)死掉 另外 檢查一下培養(yǎng)箱底部的水是否少了 如果少了 箱內(nèi)的空氣濕度不夠 會(huì)造成培養(yǎng)液揮發(fā)加快 這樣即使剛加的液體不少 過一段時(shí)間 由于蒸發(fā) 液體量會(huì)減少 造成中央干涸 并且這樣會(huì)改變了培養(yǎng)液的成分濃度 造成滲 透壓過高 個(gè)人經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為這是物理問題 24 孔板小 細(xì)胞接種進(jìn)去后是很難搖均勻的 結(jié)果 導(dǎo)致細(xì)胞重貼壁后呈現(xiàn)四周密中間稀的狀況 至于中間較多死細(xì)胞 如果是懸浮 狀的話 也一樣是物理問題 接種后比較粗暴的碰撞 似乎對(duì)搖均勻細(xì)胞有一 定效果 在為多孔板培養(yǎng)的細(xì)胞換液時(shí)一定要注意 不要把培養(yǎng)基吸得太干 如果完全 吸取 很容易造成細(xì)胞干涸 這樣的話細(xì)胞會(huì)很快死亡 我有一段時(shí)間總是遇 到這個(gè)問題 一個(gè)板子中總有一兩個(gè)孔出現(xiàn)細(xì)胞大量死亡 后來發(fā)現(xiàn)是上面的 原因 現(xiàn)在我做的時(shí)候如果必須把液體吸干 我會(huì)一個(gè)一個(gè)空來吸取 最多一 次不超過 3 孔 然后馬上加入液體 同時(shí)在作轉(zhuǎn)染時(shí) 我會(huì)在吸液和加液時(shí)將 風(fēng)機(jī)關(guān)掉 這樣基本上會(huì)避免細(xì)胞死亡 同時(shí)你所說的細(xì)胞周圍密而中間稀疏 大約有如下原因 1 培養(yǎng)液加得太少 主要是由于液體張力的問題 2 細(xì)胞接種后震蕩太厲害了 由于離心力作用導(dǎo)致細(xì)胞分布到周圍 細(xì)胞分布均勻與否有一點(diǎn)很關(guān)鍵 即每種細(xì)胞是有個(gè)體差異的 別人的細(xì)胞操 作不一定適合于你 所以要靠自己摸索 且找出專屬于自己細(xì)胞的一套規(guī)律 有 如下經(jīng)驗(yàn) 1 所有待接種的細(xì)胞懸液在種板前一定要用吸管混勻 2 按資料記載 24 孔板的液體量為 1ml 個(gè)人也覺得 1ml 的量足矣 3 接種時(shí) 要慢慢加樣 且記得輕微旋轉(zhuǎn)