普通遺傳學 細菌和病毒的遺傳.ppt

第七章細菌和病毒的遺傳 本章要點 細菌和病毒在遺傳研究中的優(yōu)越性 溫和噬菌體 烈性噬菌體 原噬菌體 溶原性細菌與溶原性生活周期 F 菌株 F 菌株 Hfr菌株 F因子 F 因子 轉化 接合 性導與轉導的概念與基本原理 酵母 三個字母表明基因功能 后面的數字表示基因座 啤酒酵母基因 GAL4 CD28蛋白質 GAL4 CDC28非洲粟酒酵母基因 gal4 cdc2蛋白質 Gal4 Cdc2 基因和基因產物的符號 細菌 用三個引文字母表示 表型第一個字母大寫 用正體 基因型三個字母都小寫 用斜體 肩上的符號表示野生型 突變型 抗性或敏感性 如 表型野生型Gal 突變型Gal 或Gal基因型野生型gal 突變型gal 或gal表型AmpRAmpS基因型ampramps 果蠅 以1 4個字母表示 基因 white w tailless tll hedgehog hh 蛋白 White Tailless Hedgehog植物 沒有慣用法 大多數用1 3個小寫字母表示 Arabidopsis基因用果蠅的方法命名但用大寫字母 如基因AGAMOUS AG 蛋白AGAMOUS 脊椎動物 一般以1 4個小寫字母表示其基因功能 例如 基因sey myc 蛋白Sey Myc人類 方法如脊椎動物但需大寫 例如基因MYC SRY 蛋白MYC ENO1 基因產物的命名無統(tǒng)一的規(guī)定 現在一般都用正體 全部大寫 或第一個字母大寫 如Gal或GAL 第一節(jié)細菌和病毒遺傳研究的意義 一 細菌的生物學特征二 病毒的生物學特征三 細菌和病毒在遺傳研究中的優(yōu)越性四 細菌和病毒的擬有性過程五 細菌遺傳的實驗研究方法 一 細菌的生物學特征 1 細菌是單細胞生物 完成每個世代只需20分鐘 而且容易得到它的生化突變型 2 結構 鞭毛 細胞壁 質膜 間體 核質體 擬核 核糖體3 涂布和繁殖 每個細胞在較短時間內能裂殖107 稱為肉眼可見的菌落 圖7 1大腸桿菌 圖7 2細菌的細胞結構與涂布繁殖 一 細菌的生物學特征 4 其遺傳物質DNA主要以單個主染色體的形式存在 這種DNA與真核生物的DNA不同 它不與組蛋白相結合 也不形成核小體的結構是一個封閉的大環(huán) 通常還有一個或多個小染色體 質粒 5 研究細菌遺傳的方法 主要是對細菌菌落形態(tài)的遺傳研究 如圖 霉菌菌落 圖7 3霉菌菌落 5 菌落形態(tài)性狀的突變包括 菌落的形狀 顏色和大小等 6 生理特性的突變包括 喪失合成某種營養(yǎng)物質能力的營養(yǎng)缺陷型 7 抗性突變包括 抗藥性或抗感染性 二 病毒的生物學特征 1 病毒是比細菌更為簡單的生物 它們也只有一條染色體 即單倍體 有些病毒的染色體是DNA 還有一些病毒是RNA 2 病毒主要是由蛋白質外殼及其包被的核酸所組成的顆粒 病毒可根據宿主 動物 植物 細菌 或遺傳物質 DNA或RNA 來分類 細菌病毒 Bacterialphage 稱為噬菌體 phage 如圖 是目前經過廣泛研究 了解比較清楚的一種病毒 圖7 4噬菌體 圖7 5煙草花葉病毒腺病毒T4噬菌體愛滋病病毒RNADNADANRNA 圖7 6愛滋病病毒 三 細菌和病毒在遺傳研究中的優(yōu)越性 世代周期短 繁殖世代所需時間短 易于操作管理和進行化學分析 純培養(yǎng)與代謝產物累積 便于研究基因的突變 表現與選擇 便于研究基因的作用 突變型生長條件與基因作用 便于研究基因的重組 重組群體大 選擇方法簡便有效 遺傳物質比較簡單 可作為研究高等生物的簡單模型 四 細菌和病毒的擬有性過程 雖然細菌和病毒不具備象真核生物配子進行融合的有性過程 但它們的遺傳物質也能從一個細胞傳遞到另一個細胞 并且也能形成重組體 細菌獲取外源遺傳物質有四種不同的方式 轉化 接合 轉導和性導 擬有性過程的存在是細菌 病毒作為真核生物的模型研究遺傳重組和基因結構的重要前提 五 細菌遺傳的實驗研究方法 1 細胞計數 培養(yǎng)物細胞濃度 2 建立純系的方法3 選擇培養(yǎng)法鑒定突變型與重組型4 突變型與重組型的批量篩選方法 1 細胞計數 培養(yǎng)物細胞濃度 培養(yǎng)物中微生物計數方法是微生物學的基本實驗技術 其基本思路是 對原培養(yǎng)物進行連續(xù)稀釋 進行平板涂抹培養(yǎng) 由于每個細胞形成一個菌落 計數菌落數 根據稀釋倍數計算原培養(yǎng)物中的細胞濃度 圖7 7細胞計數 培養(yǎng)物細胞濃度 Resultsoftheserialdilutiontechniqueandsubsequentcultureofbacteria 圖7 8細菌培養(yǎng) 2 建立純系的方法 純培養(yǎng) 挑取由單個細胞繁殖而來的菌落進行培養(yǎng)就可以獲得由一個細胞繁殖而來的純系 通常采用平板表面涂布法或劃線法可以獲得單菌落 這種方法獲得的純系 稱為 菌種純 有時采用顯微操縱器進行菌絲尖端切割等方法從單個細胞直接培養(yǎng)建立純系 采用這種方法獲得的純系稱為 菌株純 圖7 9細菌培養(yǎng) 3 選擇培養(yǎng)法鑒定突變型與重組型 許多細菌的突變都與培養(yǎng)基營養(yǎng)成分及培養(yǎng)條件有關 營養(yǎng)缺陷型的篩選 鑒定 選擇培養(yǎng)法是根據菌株在基本培養(yǎng)基和營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長表現將菌株分為原養(yǎng)型 也稱為原生營養(yǎng)型 與營養(yǎng)缺陷型 在基本培養(yǎng)基上不能正常生長 只能在相應的營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長 營養(yǎng)突變型的篩選 鑒定方法與紅色面包霉生化突變型的鑒定方法基本一致 4 突變型與重組型的批量篩選方法 選擇培養(yǎng)法一次可鑒定 篩選一種突變型 但要檢測分離含有多種突變型的混和菌株 效率太低 為高效檢測 分離混和群體中不同突變型 黎德伯格夫婦設計了影印培養(yǎng)法 該方法原理與選擇培養(yǎng)法一致 但是采用影印法將在完全培養(yǎng)基上單菌落同時接種到不同選擇培養(yǎng)基上同時對所有菌落進行選擇培養(yǎng) 鑒定效率大大提高 圖7 10影印培養(yǎng)法 圖7 11影印培養(yǎng)法 注意 1 最初的培養(yǎng)基必須是非選擇性的 即各種突變型都能夠在其上生長 2 必須采用適當的方法如涂布或劃線法 以使培養(yǎng)物菌落之間要分開 第二節(jié)噬菌體的遺傳分析 一 烈性噬菌體二 溫和噬菌體三 噬菌體 T2 的基因重組 一 烈性噬菌體 遺傳學上應用較廣泛的是大腸桿菌的T偶數系列噬菌體 它們的外貌都象蝌蚪狀 如圖 T偶數系列噬菌體具有六角形的頭部 其內部含有雙鏈DNA分子 尾部包括一個中空的針狀結構及外鞘 末端是基盤 由尾絲及尾針組成 圖7 12 一 烈性噬菌體 T偶數系列噬菌體的尾絲附著在大腸桿菌表面時 通過尾鞘的收縮將噬菌體DNA經中空尾部注入寄主細胞 破壞寄主細胞的遺傳物質 并合成大量的噬菌體DNA和蛋白質 組成許多新的子噬菌體 最后使細菌裂解 釋放出無數個子噬菌體 所以這樣的T偶數系列噬菌體稱為烈性噬菌體 圖7 13烈性噬菌體 T4噬菌體從大腸桿菌中釋放 圖7 14烈性噬菌體 圖7 15烈性噬菌體 圖7 16噬菌體的溶解性周期 二 溫和噬菌體 溫和噬菌體侵入細菌后 細菌并不裂解 即它們有溶原性的生活周期 例如 和P1噬菌體可代表略有不同的溶原性類型 噬菌體附著在大腸桿菌染色體的gal和bio位點之間的att 座位上 它能通過交換而整合到細菌染色體上 整合的噬菌體稱為原噬菌體 圖 溶原性細菌是帶有原噬菌體基因組的細菌 如乳酸菌溶原性具有完整的噬菌體基因組而不被裂解的細菌稱為溶原性細菌 用溫和噬菌體感染細菌并使之成為溶原性細菌的過程稱為 溶原化 圖7 17 噬菌體 圖7 18 圖7 19 噬菌體特定位點的整合 圖7 20噬菌體的溶原性 lysogenic 周期及溶解性 lytic 的轉變 表7 1幾種病毒染色體的特點 1 噬菌體遺傳學的建立與發(fā)展 1 1946年 BeadlrA D andTatum宣布了 一基因一酶 學說 2 LederbergJ 細菌雜交實驗報告 3 HersheyA D andLuriaS 宣布發(fā)現了r h突變體 4 DelbrukeM D andHersheyA D 各自發(fā)現噬菌體重組 三 噬菌體 T2 的基因重組與遺傳作圖 2 噬菌體的突變 噬菌斑的形態(tài)宿主范圍 1 噬菌斑突變 T噬菌體的r 突變體 速溶 正常噬菌體 r 產生的菌斑小而邊緣模糊突變噬菌體 r 產生的菌斑大兩倍而邊緣清晰 2 宿主范圍突變 T2噬菌體的h 突變體正常噬菌體 h 只能以EcoliB株 Ttor 為宿主突變噬菌體 h 能以EcoliB株和B 2株 Ttos 為宿主 3 T2噬菌體的基因重組 將兩種不同的T2突變體進行雜交 對其雜交子代進行重組分析 雜交方法 將Ttor和Ttos兩種大腸桿菌細胞混合 同時接種高濃度的T2噬菌體的h r 和h r 兩種突變體 保證絕大多數細菌都被一個以上噬菌體感染 兩種不同的噬菌體DNA可能在宿主細胞內進行重組 從而產生非親本型子代h r 和h r 親本型重組型 圖7 21 圖7 22 T2噬菌體的基因重組 h r h r 接種在同時長有B和B 2株的培養(yǎng)基上h r h r h r h r 混濁 大透明 小混濁 小透明 大 圖7 23h r h r 培養(yǎng)所產生的四種噬菌斑 圖7 24噬菌斑 4 T2的環(huán)形遺傳圖 Hershey根據h r h r 的雜交結果推測T2的染色體是線性的 多個T2噬菌體的雜交結果顯示 ra rb rc有4種不同的排列形式 rxh r h出現的4種噬菌斑的數目和求得的重組值 rx代表不同的r基因 不同的快速溶菌突變型在表型上不同 記作ra rb rc 將這幾種快速溶菌突變型 rxh 與宿主范圍突變型 r h 雜交 結果如下表 去掉 的重組值可作為基因間的圖距 用來作基因連鎖圖 圖7 25噬菌體T2的環(huán)狀基因連鎖圖 三個r基因與h基因的連鎖圖 4種不同的基因順序 rc rb rc rb 第三節(jié)細菌的染色體作圖 一 轉化 transformation 二 接合 conjugation 三 性導 transduction 四 轉導 sexduction 一個細菌細胞的DNA與另一個細菌細胞的DNA的交換重組可以通過4種方式進行 一 轉化 轉化 transformation 指某些細菌 或其它生物 能通過其細胞膜攝取周圍介質中的DNA片段 并將此外源DNA片段整合到自己染色體組中的過程 轉化現象在細菌中是一種普遍現象 不同細菌轉化過程有一定差異 但是它們都存在幾個共同特征 一 轉化過程 1 感受態(tài)與感受態(tài)因子 感受態(tài)指細菌能夠從周圍環(huán)境中吸收DNA分子進行轉化的生理狀態(tài) 感受態(tài)主要受一類蛋白質 感受態(tài)因子 影響 感受態(tài)因子可以在細菌間進行轉移 從感受態(tài)細菌中傳遞到非感受態(tài)細菌中 可以使后者變?yōu)楦惺軕B(tài) 一般認為感受態(tài)出現在細菌對數生長后期 并且某些處理過程可以誘導或加強感受態(tài) 以大腸桿菌為例 用Ca2 處理對數生長后期的大腸桿菌可以增強其感受能力 2 供體 donor DNA與受體 receptor 細胞結合 binding 結合發(fā)生在受體細胞特定部位 結合點 對供體DNA片段有一定要求 結合過程是一個不可逆過程 3 DNA攝取 當細菌結合點飽和之后 細菌開始攝取外源DNA 細菌在攝取外源DNA時 由DNA移位酶降解其中一條鏈 并利用降解這條鏈產生的能量 將另一條鏈拉進細胞中 4 聯會 synapsis 與外源DNA片段整合 integration 整合就是指單鏈的轉化DNA與受體DNA對應位點的置換 從而穩(wěn)定地摻入到受體DNA中的過程 實際上就是一個遺傳重組的過程 因而研究整合的分子機制事實上也為遺傳重組的分子機制作出了貢獻 自然轉化 naturaltransformation 在自然轉化中細菌可以自由地吸收DNA 通過它來進行遺傳轉化 枯草桿菌中的轉化屬于自然轉化 工程轉化 engineeredtransformation 在這種轉化中 細菌發(fā)生改變使得它們能攝入并轉化外源DNA E coli轉化就屬于工程轉化 本實驗采用質粒pUC18轉化大腸桿菌DH 5a 通過氨芐青霉素抗性篩選轉化子 我們通過一個重要的分子生物學實驗來介紹細菌工程轉化的過程 一 實驗材料大腸桿菌DH 5a質粒pUC18 ampicillin AmpR 二 培養(yǎng)基和試劑1 LB液體培養(yǎng)基 2 LB固體培養(yǎng)基3 抗生素 氨芐青霉素配制成100mg ml備用 4 0 1mol LCaCl2溶液 實驗材料和試劑 三 器材接種針10ml移液管50ml塑料離心管5ml移液管90mm培養(yǎng)皿1ml移液管1 5mlEppendorf管200ml吸頭三角瓶15 150試管冰塊試管鋁帽封膜紗布蓋線繩硫酸紙 四 儀器凈化工作臺搖床機恒溫水浴鍋離心機培養(yǎng)箱 二 細菌的轉化1 取大腸桿菌DH 5a新鮮感受態(tài)細胞100ml于1 5mlEppendorf管中 加入50 100ng質粒pUC18DNA 輕輕旋轉以混合內容物 在冰浴中放置30min 2 42 熱休克120s 不要搖動Eppendorf管 3 加入LB液體培養(yǎng)基900ml 37 保溫60min 4 取100ml轉化液涂布在含氨芐青霉素 Amp 100mg ml的LB固體平板上 37 倒置培養(yǎng)16 24h 5 觀察平板 長出的菌落可能就是轉化子 可進一步提取質粒鑒定 實驗步驟 以下均需無菌操作 一 感受態(tài)細胞的制備 二 共同轉化與遺傳圖譜繪制 利用共同轉化繪制細菌連鎖遺傳圖譜的基本原理 相鄰基因發(fā)生共同轉化的概率與兩者的距離間成正向關系 基因間距離越近 發(fā)生共同轉化的頻率越高 反之越低 因此可能通過測定兩基因共同轉化的頻率來指示基因間的相對距離 共轉化供體一條DNA片段上的兩個基因同時轉化的現象稱為共轉化 應用 兩個基因同時轉化的效率 連鎖或不連鎖 基因定位 遺傳作圖 枯草桿菌 轉化實驗 trp2 his2 tyr1 轉化trp2 his2 tyr1 trp2 his2 tyr1 轉化trp2 his2 tyr1 實驗 3660 二 接合 一 接合現象的發(fā)現和證實 二 F因子及其在雜交中的行為 三 中斷雜交試驗作圖 一 接合現象的發(fā)現和證實 1 Lederberg和Tatum大腸桿菌雜交試驗 材料 大腸桿菌 Escherichiacoli K12菌株的兩個營養(yǎng)缺陷型品系 A 甲硫氨酸缺陷型met 和生物素缺陷型bio B 蘇氨酸缺陷型thr 和亮氨酸缺陷型leu 方法 將A B混和 在基本培養(yǎng)基 固體 上涂布培養(yǎng) 結果 平板上長出原養(yǎng)型菌落 圖7 30 2 幾種可能解釋及其分析 對上述試驗結果原養(yǎng)型菌落可能產生于 親本細菌A或B發(fā)生了回復突變 兩品系細胞通過培養(yǎng)基交換養(yǎng)料 互養(yǎng)作用 兩品系間發(fā)生了轉化作用 發(fā)生細胞融合 形成了異核體或雜合二倍體 為了驗證這些原養(yǎng)型菌落產生的可能而進行的研究最終表明 這些解釋均不成立 回復突變可能的排除 Lederberg和Tatum采用的是雙營養(yǎng)缺陷型菌株 已基本排除A或B品系發(fā)生回復突變產生原養(yǎng)型細菌的可能 理論分析 單基因回復突變的頻率約為10 6 雙基因回復突變的頻率則為10 12 頻率很低 但試驗中產生原養(yǎng)型菌落產生的頻率非常高 因此基本可以排除回復突變的可能 對照實驗 單獨接種 未產生原養(yǎng)型菌落 互養(yǎng)作用及其排除 試驗材料 A品系 A B T1S met bio thr leu T1S B品系 A B T1R met bio thr leu T1R 試驗方法 將A B品系混合接種在基本培養(yǎng)基表面 短時間后噴T1殺死A品系 使其不能持續(xù)產生 thr leu供B品系生長結果與結論 仍然出現原養(yǎng)型菌落互養(yǎng)并非前述原養(yǎng)型菌落出現的原因 而可能發(fā)生了遺傳重組 轉化作用及其排除 Lederbery和Tatum曾把品系A的培養(yǎng)液經過濾后 加入到B品系的培養(yǎng)物中 未得到原養(yǎng)型菌落 表明原養(yǎng)型菌落可能不是由轉化作用產生戴維斯 Dawis 1950 的U型管試驗結果 沒有得到原養(yǎng)型細菌結論 細胞直接接觸是原養(yǎng)型細菌產生的必要條件 圖7 31 異核體和雜合二倍體的可能性 出現原養(yǎng)型菌落的另一種可能是 細胞融合產生異核體或雙雜合二倍體 類似二倍體生物的雜合體可產生原養(yǎng)型菌落 異核體指由于細胞融合而在細胞內含有遺傳組成不同的兩個或多個細胞核 雙雜合二倍體則是異核體進一步發(fā)生核融合 形成二倍體細胞核 核內含有兩種遺傳物質 但細菌為單倍配子體生物 異核體和二倍體只能暫時存在 繼續(xù)培養(yǎng)將發(fā)生分離 對試驗中得到的原養(yǎng)型菌落后代研究表明 后代沒有出現預期的性狀分離現象 經過上述分析可以認為 在Lederbery和Tatum及其它類似試驗中 發(fā)生了一種不同于轉化的遺傳重組方式 稱之為接合 細菌的同宗配合 homothallic 與異宗配合 heterothallic 認為細菌接合是一個彼此交換遺傳物質的過程 即細菌同宗配合 3 W Hayes的實驗 1952 鏈霉素處理A菌完全培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時間洗滌離心B菌重組體未減少基本培養(yǎng)基鏈霉素處理B菌完全培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時間洗滌離心A菌無重組體產生基本培養(yǎng)基該實驗說明細菌接合過程中遺傳物質的轉移是單向的 即遺傳物質從A株轉移到了B株 Hayes 1952 研究表明 大腸桿菌兩種不同菌株 品系 接合過程中遺傳物質的轉移是單向的 異宗配合 從而認為大腸桿菌存在兩種類型品系 雌性與雄性分別作為接合過程中遺傳物質的受體與供體 接合 conjugation 遺傳物質從供體 donor 雄性 轉移到受體 receptor 雌性 的重組過程 圖7 32細菌的接合 二 F因子及其在雜交中的行為 1 F因子 細菌染色體外的一個決定細菌雄性性別的共價環(huán)狀DNA 質粒 Hayes等進一步研究發(fā)現 大腸桿菌在接合中作供體的能力受細胞內一種致育因子 fertilityfactor F因子 sexfactor 性因子 控制 攜帶F因子的菌株稱供體菌或雄性 用F 表示 沒有F因子的菌株稱為雌性 用F 表示 A strs 冰箱放置一年 B strs A strs 不育A strr A strs 誘變 B strs A strr 可育 F因子的發(fā)現 F因子實際上是一種微小的質粒 一種封閉的環(huán)狀DNA 全長約94 5kb F因子結構包含3個區(qū)域 復制起點或原點 O oriT和oriV致育基因區(qū) 這些基因使它具有感染性 其中一些基因編碼生成F纖毛的蛋白質 配對區(qū) 這一區(qū)域有4個插入序列 insertionsequence IS 通過和宿主染色體上的IS同源重組或轉座 F因子可以整合到宿主的不同位點 圖7 33F因子的結構 圖7 34F因子與細菌結構 生理差異 F因子可以在細菌細胞間進行轉移并傳遞遺傳物質 沒有F因子的細菌稱為F F 細菌經吖啶橙處理而丟失 成為F F因子一經丟失 細胞中便不再出現 F 可以和F 雜交 而不能和F 雜交 F F 的雜交后代皆為F 而且可以10 7頻率獲得重組體后代 F因子的存在狀態(tài) 以大腸桿菌為例 F因子能夠以自主狀態(tài)存在于細胞質中或整合到細菌的染色體上 以三種狀態(tài)存在 沒有F因子 即F 包含一個自由狀態(tài)的F因子 即F 包含一個整合到自己染色體組內的F因子 即Hfr highfrequencyrecombination 如圖 圖7 35F因子的存在狀態(tài) 圖7 36F因子的存在狀態(tài) Hfr與F 的異同 相同點 1 和F 雜交產生重組后代 2 雜交是通過接合管和受體菌相連 3 用高劑量鏈霉素處理不影響雜交 不同點 1 產生重組子的頻率不同 2 F F 的后代常為F 而Hfr F 后代皆為F 3 經吖啶橙處理后 F 會變成F Hfr仍為Hfr 圖7 36F因子的存在方式 圖7 37自主狀態(tài)時F因子獨立進行分裂 2 F因子及其在雜交中的行為 當F 細菌和F 細菌接合時 F F F因子的新拷貝能在接合過程中轉移到F 細胞中去 使F 細胞轉變成F 細胞 在接合管形成后 F DNA雙鏈之一被切斷 從斷端轉移到F 細胞 在那里發(fā)生DNA復制 當F因子復制完成后 F 變成F 圖 圖7 38F因子的雜交 當Hfr F 接合時 F 細菌很少轉變成Hfr 這是因為當Hfr與F 接合時 整合的FDNA從一端被內切酶切成單鏈切口 細菌染色體由這一小段單鏈的F因子作為前導轉移到F 受體 一邊進入一邊合成 在大多數情況下 只有一小部分細菌染色體轉移 接合即出現中斷 受體細胞仍保持為F 因為F因子仍留在供體內 103 當F 或Hfr的細菌染色體進入F 后 在一個短時期內 F 細胞中對某些位點來說總有一段二倍體的DNA 這樣的細菌稱為部分二倍體或部分合子 部分供體染色體的DNA稱為供體外基因子 而宿主的染色體則稱為受體內基因子 部分二倍體中發(fā)生單數交換 可使環(huán)狀染色體打開 產生一個線性染色體 這種細胞不能成活 只有發(fā)生偶數的交換 才能產生遺傳的重組體和片段 圖 圖7 39F因子的遺傳重組 三 用中斷雜交試驗作染色體連鎖圖 Jacob F等人在1961年設計了中斷雜交試驗 以證明接合時遺傳物質從供體細胞的轉移是直線式進行的 他們把Hfr菌株與F 菌株混合在一起進行雜交培養(yǎng) Hfr菌株的基因型是 thr leu strsazirtonArlac gal F 菌株的基因型是 thr leu strrazistonAslac gal str代表鏈霉素 s代表敏感性 r代表抗性 代表原養(yǎng)型或抗性 代表營養(yǎng)缺陷型 每隔一定時間取樣 把菌液放在食物攪拌器內攪拌 以中斷雜交 經過稀釋 接種到含有鏈霉素的完全培養(yǎng)基上 這樣將殺死所有Hfr細胞 然后對形成菌落的F 細胞用影印培養(yǎng)法測試其基因型 以便確定每個基因轉移到F 細胞的時間 如圖 圖7 40中斷雜交試驗作圖 三 中斷雜交試驗作圖 圖7 41 上圖表示利用這個方法所獲得的結果 thr 最先進入F 細胞 結合8min后出現重組體 leu 隨后0 5min出現 混合9min后取樣時 開始出現少量對疊氮化物有抗性的菌落 說明抗疊氮化物的基因此時已進入F 細胞中 但對T1噬菌體來說 全部F 細胞還屬于敏感型 說明tonA基因還沒有進入F 細胞中 混合11min后 才開始出現抗噬菌體T1的F 細菌 混合18min和24min取樣時 又分別出現乳糖發(fā)酵和半乳糖發(fā)酵的基因 這說明Hfr菌株的基因是按一定的線性順序依次進入F 菌株 也就是說 染色體從原點開始以直線方式進入F 細胞的 根據中斷雜交實驗作出的大腸桿菌直線連鎖圖 0 lllll 8 59111825 azitonlacgalF 根據中斷雜交的實驗 以Hfr基因在F 細胞中出現的時間為標準 可以作出大腸桿菌的連鎖遺傳圖 用不同的Hfr菌株進行中斷雜交實驗所作出的大腸桿菌基因連鎖圖 其基因進入F 細胞的轉移的順序不大相同 這個實驗進一步說明F因子和細菌染色體都是環(huán)狀的 而Hfr細胞染色體的形成 則因F因子插入環(huán)狀染色體的不同位置 因而形成了不同的轉移原點和轉移方向 表7 2不同Hfr菌株的基因轉移順序 HfrHthr pro lac pur gal his gly thiHfr1pro lac pur gal his gly thi thrHfr2lac pur gal his gly thi thr proHfr3gal his gly thi thr pro lac pur thr pro lac pur gal his gly thl 1 圖7 42大腸桿菌染色體作圖 這種方法是根據兩個基因作為重組子在受體菌中出現 以時間分鐘作為兩個基因間圖距單位的 大腸桿菌大片段染色體的遺傳學圖就是用這種方法 以隨意的起始點用時間分鐘為單位完成的 如果兩個基因間的轉移時間小于2min 用中斷雜交法所得的圖距不太可靠 應采用傳統(tǒng)的重組作圖法 例如 有兩個緊密連鎖的基因lac 乳糖不發(fā)酵 和ade 腺嘌呤缺陷型 為了求得兩個基因間的距離 可采用Hfrlac ade 和F lac ade 的雜交實驗 用完全培養(yǎng)基但不加腺嘌呤 可以選出F ade 的菌落 四 重組作圖 由于ade進入F 細胞的順序較lac為晚 因此只要ade進入F 細胞 lac自然也已經進入 如果選出ade 同時也是lac 說明lac和ade間沒有發(fā)生過交換 如果是lac 說明兩者之間發(fā)生過交換 圖7 43 圖7 44 兩基因間的重組值約等于22 而這兩個位點間的時間單位約為1min 可見1個時間單位 min 大約相當于20 的重組值 根據大腸桿菌接合實驗的研究 利用中斷雜交 基因重組等方法已繪制出大腸桿菌K12的環(huán)狀遺傳圖 圖7 45大腸桿菌K12的環(huán)狀遺傳圖 三 性導與F 因子 1 性導是指接合時由F 因子所攜帶的外源DNA整合到細菌染色體的過程 2 F 因子的產生 F因子整合到宿主細菌染色體過程是可逆的 當發(fā)生環(huán)出時 F因子又重新離開染色體 然而F因子偶然環(huán)出時不夠準確 它攜帶有大腸桿菌染色體的一些基因 這種F因子稱為F 因子 圖 圖7 46 圖7 47F lac 3 雅科等發(fā)現一個特殊的Hfr菌株能把lac 等位基因高頻率地轉移到Flac 受體 解釋 F 因子攜帶lac 基因進入受體細胞 在lac位點成為部分二倍體 即F lac lac 它的表現型是lac 部分二倍體F lac lac 不穩(wěn)定 如果發(fā)生單交換 就會導致F 因子整合到受體染色體上而形成Hfr品系 如果發(fā)生雙交換 則只是F 因子的細菌基因和受體染色體上的等位基因之間發(fā)生互換 如果這種部分二倍體不發(fā)生重組 那么F 因子自主復制 在細菌細胞中可延續(xù)下去 4 F 和F因子不同 F 品系轉變成Hfr品系的頻率要高于F F 變成Hfr時 F 因子整合到相同位點上 而F 變成Hfr時刻整合到不同位點 F F 高頻傳遞特定基因 形成部分二倍體 而F F 要么產生F 但不轉移任何基因 要么以10 7將宿主的基因按順序轉入受體 但受體仍為F 所轉移的基因是不同的 由性導產生的部分二倍體 一方面為確定等位基因顯隱性關系提供了重要方法 另一方面由于分離出大量的F 因子 每個F 因子攜帶不同的大腸桿菌的基因 包括全部染色體基因 因此 并發(fā)性導是建立遺傳圖的另一手段 即兩個位點必須密切相連才能處在同一個F 因子上 這樣通過兩個位點間重組頻率的計算就可以獲得每個片段的連鎖群 5 性導的遺傳學應用 性導所形成的部分二倍體可用作不同突變型之間的互補測驗 以確定這兩個突變是屬于同一個基因或者是兩個不同的基因 例如在精氨酸合成中 包括有12個不同的基因 argA argB argC等 它們的突變都會產生相同的表型 其生長依賴精氨酸 其中有4個基因在大腸桿菌的遺傳學圖譜中靠得很近 很難通過重組將它們分開 圖7 48 圖7 49 相反 如果這兩個突變株是由同一基因突變引起的 結果會是怎樣的呢 如果我們將含有性因子的細菌稱為雄株 那么我們已經知道了三種不同的雄株 有哪三種 致育因子在三種雄株間是如何轉換的 它們與F 菌株雜交結果會怎樣 四 轉導 轉導是指以溫和噬菌體為媒介所進行的細菌遺傳物質的重組過程 黎德伯格等1956年在傷寒沙門氏菌中發(fā)現了轉導現象 他們用一個不能合成苯丙氨酸 色氨酸和酪氨酸的營養(yǎng)缺陷型和另一個不能合成甲硫氨酸和組氨酸的營養(yǎng)缺陷型雜交 結果在基本培養(yǎng)基上出現原養(yǎng)型菌落 一 轉導的發(fā)現 LA22LA2phe trp tryr met his phe trp met his 基本培養(yǎng)基培養(yǎng)是否形成原養(yǎng)型的菌落 否是否 單獨培養(yǎng) 單獨培養(yǎng) 混合培養(yǎng) 黎德伯格將上述兩種菌株分別放在戴維斯U型管的兩臂內 中間用玻璃濾板隔開 以防止細胞接觸 但可以允許比細菌小的物質通過 結果也獲得了野生型重組體 這樣確定 這種野生型重組體是通過一種過濾性因子實現的 以后的研究工作表明 這種過濾性因子是噬菌體P22 P22的遺傳信息可以整合到宿主的染色體中 二 普遍性轉導 噬菌體P22可以轉導沙門氏菌染色體組的任何不同的部分 因此稱為普遍性轉導 普遍性轉導 generalizedtransduction 指通過噬菌體可以轉移細菌染色體上的任何基因 如P22 P1 P22侵染細菌后 細菌染色體斷裂成片段 在形成噬菌體顆粒時 偶爾錯誤地把細菌染色體片段包裝在噬菌體蛋白質外殼內 其中并不包含有噬菌體的遺傳物質 這種假噬菌體稱為轉導顆粒 由于決定噬菌體感染細菌的能力是噬菌體的外殼蛋白質 所以轉導顆?？梢晕降郊毦?并將它的內含物注入受體細菌后 形成部分二倍體 導入的基因經過重組 整合到宿主的染色體上 圖7 50普遍性轉導的機制 轉導子 是指那些通過轉導作用能表達外基因子的受體細胞 轉導頻率 轉導子數 侵染受體的P1顆粒數 轉導子數 噬菌斑數 轉導子數 利用普遍性轉導制作細菌遺傳學圖 僅需要溫和噬菌體和攜帶不同遺傳標記的細菌菌株 采用兩點或三點轉導實驗 一個典型的轉導實驗是首先篩選出含一個供體標記的轉導子 transductant 然后再分析其它供體標記的存在與否 利用普遍性轉導制作細菌遺傳學圖 例如從一個a b 供體到一個ab受體的轉導會產生下列不同類型的轉導子 如a b ab a b 如果篩選到其中一個作為供體標記 我們就能夠獲得這兩個基因之間的連鎖資料 如果選擇a 轉導子作供體標記 則a b間的重組率為 如果選擇b 轉導子作供體標記 則a b間的重組率為 RFab 單個轉導子數 總轉導子數 即 一個以上的基因同時被轉導的現象稱為共轉導 共轉導也可以用來作圖 兩個共轉導基因之間的距離可以通過轉導來確定 建立精細的結構圖 中斷雜交實驗方法復雜 且結果不精確 重組作圖構建交互突變的品系也很不容易 而采用共轉導的方法既簡單又精確 共轉導 contransduction 例如 如何讓利用大腸桿菌P1噬菌體轉導產生的部分二倍體來確定基因間的圖距和制作細菌染色體連鎖圖 供體thr leu azir受體thr leu azis P1噬菌體