LFY類基因在莖端分生組織形成及其活動(dòng)中的作用.doc

LFY類基因在莖端分生組織形成及其活動(dòng)中的作用Expression Pattern of LFY-like Gene and its Function in Shoot Apical Meristem Activity98級(jí)生命科學(xué)學(xué)院 細(xì)胞生物與遺傳學(xué)系 劉曼摘 要 LFY類基因在植物形態(tài)建成過程中具有重要作用，根據(jù)其突變體的特征，曾一度被認(rèn)為是在花分生組織和花序分生組織中特異表達(dá)的“分生組織特征決定基因”，控制花序分生組織向花分生組織的轉(zhuǎn)變。但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)其在營養(yǎng)分生組織甚至胚胎發(fā)生過程中都有所表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)試圖通過啟動(dòng)子活動(dòng)特點(diǎn)研究、mRNA水平上原位雜交分析等各種方法，對(duì)其功能進(jìn)行深入地探討，以期全面地認(rèn)識(shí)該類基因在植物發(fā)育中的作用。Abstract LFY-like genes play important role in plant development, when they were first isolated from mutants of Antirrhinum and Arabidopsis, they were thought to be “SAM-specific-determinating-genes”, regulating the transition from inflorescence to flower meristem. However, further research revealed that LFY-like genes activity can be found in embryogenesis, shoot apices and axillary buds at different stages as well as in flower primordial. We characterized LFY promoters activity and investigated LFY mRNA expression with Whole-mount in situ Hybridization, in order to make their function clearer. 引言 植物形態(tài)建成有與動(dòng)物形態(tài)建成完全不同的特點(diǎn)：其完成生活周期所需的地上部分基本器官類型都是由莖端分生組織（shoot apical meristem, SAM）的活動(dòng)而逐步形成的。因此，莖端分生組織在植物形態(tài)建成中的重要性是不言而喻的。但長期以來，雖然人們始終在努力，而且近十年來出現(xiàn)了分離得到莖端分生組織活動(dòng)相關(guān)基因等重大的突破1，可目前在莖端分生組織的形成變化及其終結(jié)方式等基本問題方面卻仍然沒有得到合乎邏輯的解釋。根據(jù)突變體研究的早期結(jié)果，人們形成了目前占主導(dǎo)地位的觀點(diǎn)，即莖端分生組織在“胚胎發(fā)生”過程中形成，隨后在“胚后發(fā)生”的過程中，被一些“分生組織特征決定基因”控制，逐步由“營養(yǎng)分生組織”改變?yōu)椤盎ㄐ蚍稚M織”和“花分生組織”2。但隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，一些過去被認(rèn)為是在“花分生組織”和“花序分生組織”中特異表達(dá)的“分生組織特征決定基因”，大部分都不用程度地在“營養(yǎng)分生組織”甚至“胚胎發(fā)生”過程中表達(dá)3-7。這些現(xiàn)象是現(xiàn)有的假說所無法解釋的。顯然，這些新的發(fā)現(xiàn)對(duì)現(xiàn)有的觀點(diǎn)提出了不可回避的挑戰(zhàn)。只有通過對(duì)這些基因表達(dá)特征及其功能的深入研究，我們才有可能真正從分子水平上逐步解釋莖端分生組織形成、活動(dòng)及其終結(jié)的分子機(jī)理并從中逐步揭示莖端分生組織在植物形態(tài)建成中所扮演的角色。 LFY類基因正是上述基因中的一種。它的突變導(dǎo)致植物表型發(fā)生一系列的變化。在野生型植物體中應(yīng)發(fā)育成花的部位，在lfy突變體中則發(fā)育出花序，或是僅由萼片和花瓣組成的異常花。而且LFY和APETALA1或APETALA2的雙重突變體會(huì)導(dǎo)致植物的花完全喪失野生型花所具有的縮短節(jié)間、頂端有限生長等特點(diǎn)。根據(jù)以上種種現(xiàn)象，當(dāng)LFY類基因從金魚草和擬南芥的有關(guān)突變體中分離出來時(shí)，被認(rèn)為其在植物發(fā)育中控制莖端分生組織從花序分生組織轉(zhuǎn)變?yōu)榛ǚ稚M織2，8。但隨著該基因的同源序列從其他植物中被陸續(xù)分離，人們發(fā)現(xiàn)在煙草、鳳仙花、豌豆、矮牽牛、水稻、松樹等植物中，LFY類基因的表達(dá)并不局限于花分生組織，而是廣泛地存在于不同發(fā)育階段的莖端分生組織3-6，9，10。更重要的是，后來的研究表明，即使在擬南芥中，LFY基因?qū)嶋H上在其早期的發(fā)育階段，即在花序分生組織形成之前，已經(jīng)在莖端分生組織中表達(dá)11。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)表明，LFY基因表達(dá)量越大，植物開花越早12，13。因此，對(duì)該基因的功能又有了一種新的認(rèn)識(shí)，即它不僅決定花序分生組織轉(zhuǎn)變?yōu)榛ǚ稚M織，而且還影響開花的早晚。 白書農(nóng)教授等在進(jìn)行另一種擬南芥突變體emf的研究中，曾注意到LFY基因在植物早期發(fā)育階段表達(dá)中的特點(diǎn)，并曾利用LFY:GUS轉(zhuǎn)基因植物為材料，對(duì)其在植株“營養(yǎng)生長”階段的表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行過系統(tǒng)的研究白書農(nóng)等，未發(fā)表資料，1998。發(fā)現(xiàn)LFY基因的啟動(dòng)子不僅在種子萌發(fā)后不同階段的莖端分生組織和幼小的器官原基中表達(dá)，而且在早期胚胎發(fā)生過程中也有表達(dá)。最為引人注目的是，LFY基因啟動(dòng)子的活動(dòng)與由根外植體再生植株過程中莖端分生組織的形成及其活動(dòng)存在直接的相關(guān)。據(jù)此白書農(nóng)教授等提出，LFY基因的表達(dá)很可能與莖端分生組織的形成及其活動(dòng)有關(guān)，而它表達(dá)量的增長水平和開花相關(guān)聯(lián)。 但是，有研究表明，以GUS等報(bào)告基因所顯示的啟動(dòng)子活動(dòng)模式可能并不一定反映該啟動(dòng)子對(duì)其原有基因表達(dá)的時(shí)空調(diào)節(jié)模式。因?yàn)榛虻谋磉_(dá)不單需要啟動(dòng)子的活動(dòng)，還和一些其他因子，例如內(nèi)含子等有關(guān)。因此，要真正了解LFY基因在分生組織形成與活動(dòng)過程中的表達(dá)特點(diǎn)，還應(yīng)有對(duì)其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即mRNA進(jìn)行原位檢測的證據(jù)。本課題即是在本實(shí)驗(yàn)室過去工作的基礎(chǔ)上，試圖從正常植株與組培過程再生植株中LFY啟動(dòng)子活動(dòng)方式的檢測和LFY基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的直接檢測兩個(gè)方面，對(duì)LFY類基因早期表達(dá)特點(diǎn)及其可能的功能等關(guān)鍵問題進(jìn)行進(jìn)一步地探討。本課題研究中主要涉及兩種基因表達(dá)的檢測技術(shù)。當(dāng)研究LFY啟動(dòng)子活動(dòng)方式時(shí)，我們采用報(bào)告基因的表達(dá)分析方法。報(bào)告基因通常編碼一個(gè)在離體條件下易于檢測的酶，或者編碼可以在活體條件下進(jìn)行組織化學(xué)定位的蛋白，這樣就可以提供基因表達(dá)定量的和定性的信息。gusA基因是從大腸桿菌（Escherichia coli）中分離出來的，并且目前有一些基因盒可以允許在gusA基因的附近插入啟動(dòng)子區(qū)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄融合基因或翻譯融合基因。我們實(shí)驗(yàn)所用的Plfy:GUS擬南芥和Plfy:GUS煙草、Pnfl:GUS煙草即是在gusA基因前插入LFY或NFL基因的啟動(dòng)子（Plfy或Pnfl），當(dāng)Plfy或Pnfl活動(dòng)時(shí)，帶動(dòng)gusA表達(dá)，利用一個(gè)簡單的組織化學(xué)檢測就可以精確地分析gusA融合基因的時(shí)空表達(dá)模式。用5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸（X-gluc）作為底物可以精確地進(jìn)行GUS活性的定位，這一反應(yīng)分兩步進(jìn)行：首先是切割葡糖醛酸部分，產(chǎn)生無色的吲哚氧基中間產(chǎn)物，隨后吲哚氧基中間產(chǎn)物氧化成為不溶的藍(lán)色沉淀。用GUS進(jìn)行這類實(shí)驗(yàn)有如下優(yōu)點(diǎn)：（1）在大多數(shù)植物組織中GUS活性的本底低；（2）反應(yīng)產(chǎn)物不擴(kuò)散，在表達(dá)基因的植物細(xì)胞內(nèi)積累；（3）通過簡單的擴(kuò)散或真空滲入，底物易被植物細(xì)胞吸收。當(dāng)然，也存在一些缺點(diǎn)：（1）組織化學(xué)染色后植物失去繼續(xù)培養(yǎng)的可能，這樣不能跟蹤檢測同一株植物不同時(shí)期的基因活動(dòng)情況；（2）由于酶和產(chǎn)物非常穩(wěn)定，因而不能真實(shí)的反映出GUS替代的那個(gè)蛋白在穩(wěn)定狀態(tài)下的豐度；（3）人們發(fā)現(xiàn)在GUS表達(dá)水平很高的組織中會(huì)發(fā)生無色反應(yīng)中間產(chǎn)物滲漏的現(xiàn)象，但是，這可以通過在底物溶液中加入氧化劑高鐵氰化鉀或亞鐵氰化鉀或者二者都加（終濃度為5mmol/L），來使這種滲漏減至最少（Stomp 1990; Masarenhas和Hamilton 1992）；（4）同所有的組織化學(xué)方法一樣，其檢測結(jié)果不是定量的。而且，最致命的缺點(diǎn)是，啟動(dòng)子的分析不一定總能反映基因的真實(shí)活動(dòng)情況（如前文所述），這是在運(yùn)用報(bào)告基因方法進(jìn)行基因表達(dá)特征分析時(shí)必須注意的一個(gè)問題。當(dāng)檢測LFY基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物時(shí)，我們用到了原位雜交 （in situ Hybridization, 簡稱ISH）技術(shù)。該技術(shù)最早是由Gall和Pardue (1 969)及John等 (1 969)獨(dú)立發(fā)明的。其基本原理是根據(jù)核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則 （A-T, C-G）,將有放射性或非放射性標(biāo)記的外源核酸 (探針：Probe )與染色體上經(jīng)過變性后的單鏈DNA互補(bǔ)配對(duì) ,結(jié)合成專一的核酸雜交分子 ,再經(jīng)一定的檢測手段 ,將待測核酸在染色體上的位置顯示出來。我們采用的mRNA水平的原位雜交技術(shù)，是將含有目的基因cDNA的質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶從目的片斷的兩端單切，使質(zhì)粒線性化。然后從兩端用不同的轉(zhuǎn)錄酶按照A-U, C-G的互補(bǔ)配對(duì)原則合成一段RNA片斷，其中UTP上標(biāo)記地高辛，這標(biāo)記上的RNA片斷即為探針。當(dāng)目的基因表達(dá)時(shí)，mRNA能和反義探針特異性結(jié)合，在底物的作用下顯色。而正義探針為負(fù)對(duì)照。由于 RNA原位雜交技術(shù)能夠精確確定基因表達(dá)的時(shí)空分布，而植物基因的時(shí)空表達(dá)研究是探討植物生長發(fā)育機(jī)制的重要手段，所以在以研究植物發(fā)育機(jī)制為主的本實(shí)驗(yàn)室，原位雜交成為一項(xiàng)主要的并十分關(guān)鍵的技術(shù)。 目前植物研究中，原位雜交得到了越來越廣泛的應(yīng)用，主要有 3種方法 :一是常規(guī)組織切片RNA原位雜交，廣泛適用于各種組織 ;二是大量細(xì)胞的整體RNA原位雜交 ,已應(yīng)用于花粉管和藻類合子;三是微量細(xì)胞的整體RNA原位雜交 ,用于分離胚囊。我所使用的整體原位雜交技術(shù)，是一種較新的組織RNA原位雜交方法。該方法的實(shí)驗(yàn)材料是具有完整形態(tài)結(jié)構(gòu)的植物器官或其組合，如花、花序等。該技術(shù)能夠直接從整體結(jié)構(gòu)上觀察到基因表達(dá)的空間特征，具有易操作、周期短等特點(diǎn)，并避免了一般在切片上原位雜交所需的三維重構(gòu)步驟。材料和方法1 實(shí)驗(yàn)材料1.1 植物材料野生型擬南芥種子（Columbia）Plfy:GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥種子（由Detlef Weigel提供）野生型煙草種子（Nicotiana tabacun var. Wisconsin 38）Plfy:GUS轉(zhuǎn)基因煙草種子（由本實(shí)驗(yàn)室畢業(yè)博士生劉復(fù)權(quán)構(gòu)建、提供）1.2 菌種和質(zhì)粒大腸桿菌DH5質(zhì)粒：Pnfl:GFP (Kan R )Plfy:antiLFY(Kan R )PDW124-LFY (Amp R )以上質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室已畢業(yè)博士生劉復(fù)權(quán)構(gòu)建，本實(shí)驗(yàn)室保存。 1.3 分子生物學(xué)和生化試劑各種限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa 公司，PCR試劑購自鼎國生物公司，原位雜交地高辛標(biāo)記RNA探針試劑盒及雜交液（DIG easy Hyb）購自Roche生物公司，各種激素和抗生素以及x-Gluc購自北京經(jīng)科生物工程公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.4 PCR引物 以GFP基因?yàn)槟０宓腜CR引物由本人設(shè)計(jì)，上海生工生物工程公司合成。 5GFP (21bp):5-GGT GAA GGT GAT GCA ACA TAC-3 3GFP (18bp):5-GAA AGG GCA GAT TGT GTG-3 1.5 x-Gluc 染色液(1mL) N、N二甲基甲酰胺 50uL x-Gluc 0.5mg 100mM 磷酸緩沖液 pH7.0 980uL 5mM 鐵氰化鉀 10uL 5mM 亞鐵氰化鉀 10uL Triton x-100 1uL 1.6 植物葉綠素透明液 乙醇：乙酸=9：1 1.7 培養(yǎng)基 1.7.1 擬南芥、煙草組織培養(yǎng)基 MS (含3%的蔗糖和0.75%的瓊脂，調(diào)pH=5.8)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Callus-Inducing Medium, CIM）: B5+0.5mg/L 2,4-D + 0.05mg/L KIN (含2%的蔗糖和0.75%的瓊脂，調(diào)pH=5.5)生芽培養(yǎng)基（Shoot-Inducing Medium, SIM）: B5+0.15mg/L IAA + 5mg/L2ip (含2%的蔗糖和0.75%的瓊脂，調(diào)pH=5.5) 1.7.2 細(xì)菌培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基含5克酵母提取物，10克蛋白胨，10克氯化鈉，pH=7.5，固體培養(yǎng)基含1%瓊脂 1.8 原位雜交所需試劑 PBS: 0.13M NaCl, 0.007M Na2HPO4 ,0.003M NaH2 PO4 , 0.27mM KCl, pH 7.4 PBT: PBS+0.1% Tween 20 固定液 (FB): PBT+0.08M EGTA, 5%多聚甲醛, 10% DMSO (pH 7.4) NTE: 500mM NaCl, 10mM Tris-HCl (pH7.5), 1mM EDTA 封阻液 (BS): PBT+ 2% BSA 滲入液 (SB): 100mM NaCl, 50mM MgCl2 , 100mM Tris-HCl (pH9.5), 0.1% Tween 20 停止?jié)B入液 (SSB): PBT+20mM EDTA 2 主要方法2.1 質(zhì)粒載體構(gòu)建部分2.1.1 原質(zhì)粒的酶切將Plfy:antiLFY，Pnfl:GFP用XbaI和SacI雙切，得到Plfy-載體和GFP片斷。2.1.2 從凝膠中分離純化DNA片段(1) 切下含有DNA片段的膠塊，轉(zhuǎn)移到1.5 ml 離心管中, 于70溫育直至膠完全融化. 加1 ml 樹脂(resin), 混合20秒.(2) 去掉注射器上的推進(jìn)器，將Minicolumn安上。(3) 將樹脂/DNA混合液移入注射管中，慢慢插入推進(jìn)器，輕輕將懸浮液推進(jìn)Minicolumn中。(4) 從Minicolumn去掉注射器，取出推進(jìn)器。再安注射管于Minicolumn上。加2m1的80%異丙醇于注射管中洗Minicolumn。插入推進(jìn)器，緩慢將異丙醇推過Minicolumn。(5) 去掉注射器，將Minicolumn放在1.5ml離心管中，離心2分鐘，使樹脂/DNA干燥。(6) 將Minicolumn移入一個(gè)新的離心管，加50ul水或TE，放置1分鐘，離心20秒，溶下DNA片段。(7) 仍掉Minicolumn.純化的DNA儲(chǔ)藏于4或-20。2.1.3 連接在冰上建立如下連接體系: 2*T4 DNA連接酶Buffer 5uL Plfy-載體 1uL GFP 3uL T4 DNA連接酶 1uL輕輕混勻后，4連接過夜。 2.1.4 大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞的制備(1) 從LB平板上挑取E.coli DH5單菌落接種于2mL LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜，取100-200uL菌液于2mL LB中，37振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)后全部轉(zhuǎn)入100LB中，37振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)至對(duì)數(shù)生長期(OD600=0.4左右)。 (2) 無菌條件下轉(zhuǎn)入1.5mL Eppendorf，冰浴10min。(3) 4 4000rpm 8min，回收細(xì)胞。(4) 用400uL冰預(yù)冷的CaCl2 (0.1M)重懸沉淀，置于冰上15-30min。(5) 4 4000rpm 8min，回收細(xì)胞。(6) 用100uL冰預(yù)冷的CaCl2 (0.1M)重懸沉淀，備用。 2.1.5 轉(zhuǎn)化(1) 100uL感受態(tài)細(xì)胞中加入1.5uL質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)，混勻內(nèi)容物，冰上 置30min。 (2) 42水浴90s，不要擺動(dòng)試管。 (3) 快速將試管轉(zhuǎn)移至冰上，冷卻2min。 (4) 每管加入200uL LB，37振蕩45min1hr。 (5) 涂板(Kan)。 (6) 至液體完全吸收后，倒置平板，37培養(yǎng)。 2.1.6 提質(zhì)粒 用小量堿法提取質(zhì)粒：(1) 取1.5mL菌液轉(zhuǎn)移至Eppendorf管，于4，12000rpm離心30”。(2)吸去上清，空氣干燥沉淀。沉淀懸浮于100ul溶液中（25mM Tris-HCl pH8.0, 10mM EDTA, 50mM葡萄糖）中，振蕩混勻室溫放置5分鐘。(3)假如200ul溶液（0.2M NaOH, 1%SDS），放冰浴中5分鐘。(4)再加入150ul溶液（3M NaAc, pH4.8），放冰浴中5-10分鐘，12000rpm 4離心5分鐘。取上清加等量酚：氯仿，振蕩，4，12000rpm 2分鐘。(5)取上清加2倍體積乙醇，振蕩，置2分鐘。(6)4，12000rpm 2分鐘，吸去上清，瀝干。(7)加1mL 70%乙醇洗滌2次。(8)用50ul TE溶解（加入1ul Rnase）。 2.1.7 酶切鑒定及PCR鑒定 所用限制性內(nèi)切酶及PCR引物如前2.1.1及1.4所述。 2.2 GUS活性的組織化學(xué)定位部分 2.2.1 組織培養(yǎng)(1)將植物長出兩周的主根切下成5-10mm的小段，轉(zhuǎn)移至CIM中誘導(dǎo)其長愈傷。(2)三周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至SIM中誘導(dǎo)其長芽。(3)設(shè)未轉(zhuǎn)基因植物作負(fù)對(duì)照，對(duì)照和處理之間的培養(yǎng)條件要完全一致。(4)不論在CIM中還是在SIM中，培養(yǎng)基要每1-2周續(xù)代一次，及時(shí)更新。(5)注意大量培養(yǎng)，在由CIM轉(zhuǎn)移至SIM的同時(shí)，應(yīng)保留一部分材料作CIM續(xù)代，以此作為SIM培養(yǎng)下的處理的另一種對(duì)照。(6)實(shí)驗(yàn)過程中特別要注意無菌操作！ 2.2.2 GUS活性檢測(1)當(dāng)植物的根在CIM中培養(yǎng)時(shí)，每隔2-3天作一次GUS組織化學(xué)染色進(jìn)行跟蹤監(jiān)測。(2)當(dāng)愈傷組織在SIM中培養(yǎng)時(shí)，每隔一周左右作一次檢測。等到長出再生芽和再生根時(shí)，切下芽和根分別作檢測。(3)未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照必須和處理始終同步進(jìn)行。(4)設(shè)置重復(fù)，至少3-5次。(5)具體方法：a. 無菌操作，將要檢測的植物部位小心切下來，轉(zhuǎn)入GUS染液，使材料和染液的體積比1:5。b. 真空處理2-10分鐘。c. 放入37恒溫箱中溫育12-16小時(shí)。d. 待GUS滲入材料中后，材料轉(zhuǎn)入透明液中透明，放置于室溫下3小時(shí)。 2.2.3觀察和照像 經(jīng)透明處理后的植物材料在Motic 解剖鏡下觀察，有GUS表達(dá)的部位顯 現(xiàn)穩(wěn)定、不溶于透明液的藍(lán)色。解剖鏡上接理光XR-X 2000相機(jī)照相， 相片通過Acer ScanPrisa 640U型掃描儀輸入電腦，由Adobe Photoshop 6.0 作適當(dāng)處理。2.3 整體原位雜交2.3.1 探針標(biāo)記 限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒LFY：antisense BamH1Sense KpnI(1)37C 消化2小時(shí)，電泳檢查線性化是否完全；(2)加等體積酚-氯仿，混勻；(3)12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，收集上清，(4)加2倍體積無水乙醇（預(yù)冷），混勻，-20C，30分鐘；(5)12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄上清，(6)加70%乙醇（預(yù)冷），棄上清，(7)真空干燥，沉淀溶于10微升無菌水中；(8)電泳檢測。體外轉(zhuǎn)錄(1)每個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)含：模板4微升，5*緩沖液4微升，DTT2微升，RNA Block 1uL，5*NTP 4微升，Polymerase 2微升，DEPC-H2O 3微升。37C 2小時(shí)。LFY： antisense T3Sense T7(2)Dnase I 于37C處理15分鐘以除去模板，每個(gè)體系加 2.5微升的3M NaAc和75微升的預(yù)冷的無水乙醇，-20C 過夜，(3)4C 下離心15分鐘，13000轉(zhuǎn)；(4)70%預(yù)冷的乙醇沉淀一次，吹干后溶于50微升DEPC-treated H2O。堿性水解(1)50微升探針加50微升碳酸緩沖液，60C 水解，LFY45分鐘， 每管加10微升5%乙酸，置冰上；(2)每管加11微升的3MnaAc，200微升預(yù)冷無水乙醇，-20C 過夜；(3)4C 下離心15分鐘，12000轉(zhuǎn)；(4)70%預(yù)冷的乙醇沉淀一次，吹干后溶于50微升甲酰胺。2.3.2 原位雜交(1)固定FB 30min甲醇 2次 5min乙醇 4次 5min(2)雜交預(yù)處理乙醇 2次 2min1:1 乙醇:二甲苯 30min乙醇 2次 5min甲醇 2次 5min1:1 甲醇:PBT 10minPBT+5%甲醛 30minPBT 3次 2minPBT+40ug/mL 蛋白酶K 10-15minPBT+0.2% 甘氨酸 5minPBT 2次 2minPBT+5% 甲醛 30minPBT 4次 2min1:1 PBT:HS 10minHS 2次 2min預(yù)雜交 2hr 60(3)雜交400uL HS + 3uL RNA probe + salmon tests DNA (100ug/mL)（探針和salmon tests DNA預(yù)先85變性5min）16-20hr 60(4)雜交后處理HS 2次 30min 551:1 HS:NTE 60minNTE 60minNTE 2minNTE+40ug/mL Rnase A 45min 37NTE 15min 37NTE 5次 15min1:1 NTE:PBT 20minPBT 2minBS 至少30min(5)檢測anti-DIG抗體處理a. 等量混合固定后的和新鮮材料+少量冰冷90%丙酮，液氮中磨成細(xì)粉b. 加入更多90%丙酮，使勁混合均勻，4儲(chǔ)存過夜c. 13,000g 5min離心，棄上清。在少量90%丙酮中重懸沉淀，將沉淀分散于一濾紙上，風(fēng)干d. 在30mg干粉中加入400uL BS和20uL anti-DIG Fab fragment，室溫黑暗中24hre. 10,000離心3min信號(hào)檢測BS 100uL中加入1uL e中上清，4過夜新鮮BS 10minPBT 4次 60minSB 2次 5min1mL中加入8uL Roche公司的nitro blue tetrazolium chloride + 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate 5-60min黑暗中顯色顯色完畢后用SSB終止反應(yīng) (6)觀察和照像用甘油:PBS 7:3 溶液封片，在OLYMPUS顯微鏡下觀察并照像，相片通過Acer ScanPrisa 640U型掃描儀輸入電腦，由Adobe Photoshop 6.0作適當(dāng)處理。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. 擬南芥中LFY啟動(dòng)子活動(dòng)特點(diǎn)的驗(yàn)證 白書農(nóng)教授等早年曾利用Plfy:GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥為材料，系統(tǒng)檢測過在植物發(fā)育早期的SAM中和以根為外植體的植株再生過程中Plfy的活動(dòng)特點(diǎn)。我首先重復(fù)了該實(shí)驗(yàn)，以便熟悉各個(gè)步驟和操作，同時(shí)也進(jìn)一步驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。 實(shí)驗(yàn)方法如2.2中所述，結(jié)果見圖1所示。早在幼苗長出的第二天，GUS活動(dòng)就在SAM中表現(xiàn)出來（圖1-A）。而在莖的其他部位、成熟的葉片和根中，沒有Plfy的活動(dòng)（圖1-B）。為了避免SAM中已存在的GUS活性干擾，本實(shí)驗(yàn)以無GUS活動(dòng)的根為外植體進(jìn)行植株再生。當(dāng)將根移入CIM中誘導(dǎo)愈傷時(shí)，第二天就在成熟根外周區(qū)域有細(xì)胞分裂的地方發(fā)現(xiàn)了微弱的GUS表達(dá)（圖1-D）。且隨著愈傷的生長，GUS活性逐漸提高（圖1-E至圖1-J）。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果再次驗(yàn)證了在擬南芥中，Plfy在早期即定位表達(dá)于SAM中，且在根外植體再生過程中有Plfy的活動(dòng)。因?yàn)橹仓暝偕^程中涉及到SAM的重組，我們由以上兩點(diǎn)推測Plfy的表達(dá)與SAM的形成與活動(dòng)直接相關(guān)，但這個(gè)假設(shè)尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證。通過本實(shí)驗(yàn)，我熟練掌握了植物組織培養(yǎng)、GUS組織化學(xué)染色解剖觀察和照相等各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技能，為進(jìn)一步的工作打下了基礎(chǔ)。2. LFY啟動(dòng)子在煙草中與在擬南芥中有相同的活動(dòng)特點(diǎn) 為了驗(yàn)證Plfy在擬南芥中的上述表達(dá)特點(diǎn)是否具有普遍性，我又利用Plfy:GUS轉(zhuǎn)基因煙草為材料，用與擬南芥同樣的方法分析Plfy在早期SAM和根外植體植株再生過程中的活動(dòng)特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。與擬南芥相似的是，轉(zhuǎn)基因煙草的早期SAM（圖2-A、2-B）和再生芽原基（圖2-C、2-D、2-E）以及再生芽分生組織區(qū)域（圖2-F、2-G、2-H）中都有明顯的GUS表達(dá)，但轉(zhuǎn)基因煙草也具有自己的特點(diǎn)，即在莖尖中所檢測到的GUS染色水平與同時(shí)期的擬南芥相比偏低，而且用現(xiàn)有的方法，未能檢測到早期愈傷中的GUS活動(dòng)。 這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明，LFY基因在植物幼苗SAM和葉原基、芽原基中的表達(dá)特點(diǎn)是具有普遍性的。而煙草早期愈傷中未能如擬南芥那樣檢測到GUS反應(yīng)活 性，估計(jì)可能因?yàn)镻lfy在煙草中活動(dòng)強(qiáng)度太低，但該推測尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。3. RNA水平上的LFY表達(dá)特征與GUS檢測結(jié)果相同考慮到現(xiàn)有的文獻(xiàn)中所述現(xiàn)象，啟動(dòng)子的研究不能完全反映基因的真實(shí)表達(dá)情況（詳見引言部分），要想清楚地研究其功能，我們必須直接檢測該基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。所以我試圖用RNA水平整體原位雜交的方法，在擬南芥不同發(fā)育階段SAM中和根外植體植株再生過程中對(duì)LFY基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行直接檢測和定位。如果LFY基因確實(shí)在RNA水平上存在與啟動(dòng)子相同的表達(dá)特點(diǎn)，則表明啟動(dòng)子分析結(jié)果是可靠和有意義的，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了我們關(guān)于LFY基因功能的假說。否則，則表明過去啟動(dòng)子分析的結(jié)果未能反應(yīng)實(shí)際基因表達(dá)的狀況。詳細(xì)流程如實(shí)驗(yàn)方法中所述。首先，要想取得好的原位雜交結(jié)果，先需要一個(gè)高質(zhì)量的探針。我用BamHI和KpnI雙切pDW124-LFY質(zhì)粒，切出LFY基因，檢測了該質(zhì)粒的正確性。然后用BamHI和KpnI分別從兩端單切，使質(zhì)粒線性化。結(jié)果如圖1.1所示。轉(zhuǎn)錄后結(jié)果見1.2，水解后結(jié)果見1.3所示。 圖1：探針制備電泳圖譜1.1: 質(zhì)粒酶切圖譜Lane 1: DL2000 DNA Marker Lane 2: LFY/BamHI+KpnI ，小片段即為切出的LFY基因 Lane 3: LFY/KpnI，已線性化完全 Lane 4: LFY/BamHI，已線性化完全 Lane 5: LFY質(zhì)粒對(duì)照1. 2: 轉(zhuǎn)錄后電泳圖譜（未經(jīng)Dnase處理）Lane 1: LFY/KpnI （T7轉(zhuǎn)錄酶） Lane 2: LFY/BamHI（T3轉(zhuǎn)錄酶） Lane 3: Control 箭頭所示為轉(zhuǎn)錄出的RNA條帶1. 3: 水解后電泳圖譜Lane 1: DL2000 DNA Marker Lane 2: LFY/KpnI Lane 3: LFY/BamHI Lane 4: Control 箭頭所示為水解后的RNA小片段 雜交結(jié)果見圖版3。A-D顯示的是擬南芥發(fā)育過程中的LFY基因表達(dá)狀況。7天大小、14天大小的擬南芥幼苗以及花序中，LFY基因的表達(dá)定位于莖端分生組織和葉原基、花芽原基中，而在莖的其他部分、花梗、成熟的葉片中，檢測不到LFY的表達(dá)信號(hào)。 同樣以無LFY活動(dòng)的根為外植體進(jìn)行植株再生，現(xiàn)已檢測到在CIM中培養(yǎng)4天的根外植體細(xì)胞分裂旺盛的部位中的LFY表達(dá)信號(hào)（圖4-E、圖4-F）。后續(xù)的檢測工作正在進(jìn)一步進(jìn)行。 值得注意的是，用原位雜交和用GUS組織化學(xué)染色檢測的結(jié)果顯示，LFY的活動(dòng)和LFY啟動(dòng)子的活動(dòng)確實(shí)是一一對(duì)應(yīng)的（至少現(xiàn)有的結(jié)果說明了這一點(diǎn)），這初步證明了過去取得的Plfy活動(dòng)結(jié)果具有一定的可靠性。4. Plfy:GFP載體的構(gòu)建 在Plfy:GUS擬南芥根外植體植株再生過程中，愈傷組織中可發(fā)現(xiàn)明顯的GUS活動(dòng)，至于有GUS活動(dòng)的部位是否會(huì)出芽，目前還不得而知，因?yàn)榻M織化學(xué)染色將殺死細(xì)胞，失去繼續(xù)培養(yǎng)、跟蹤觀察的可能。也就是說在莖端分生組織形成之前，我們觀察到了LFY的活動(dòng)；在莖端分生組織形成之后，我們又觀察到了LFY基因的特異表達(dá)。但是莖端分生組織的這團(tuán)細(xì)胞是否來自莖端分生組織形成前有LFY活動(dòng)的細(xì)胞，目前還沒有直接的證據(jù)。針對(duì)這一問題，我打算構(gòu)建Plfy:GFP載體并將其轉(zhuǎn)入擬南芥，從而能在熒光下跟蹤檢測Plfy的活動(dòng)。如果Plfy活動(dòng)部位和出芽部位確有一致性，則為我們的假設(shè)提供了一個(gè)有力的證據(jù)。 目前手頭上已具有Plfy:antiLFY和Pnfl:GFP質(zhì)粒，在antiLFY和GFP兩側(cè)均有XbaI和SacI的酶切位點(diǎn)，我用這兩種限制性內(nèi)切酶將這兩種質(zhì)粒切開，從瓊脂糖凝膠上準(zhǔn)確切下載體-Plfy片斷和GFP片斷，再將二者進(jìn)行連接。 首先，我用酶切的方法和PCR的方法檢測了Plfy:antiLFY和Pnfl:GFP兩個(gè)質(zhì)粒的正確性。對(duì)于Plfy:antiLFY，Plfy是構(gòu)建新載體需要的片段，antiLFY卻是要用酶正確切下以便置換的片段，所以圖3.1，3.2分別對(duì)Plfy和antiLFY進(jìn)行了檢測，切出的Plfy 1Kb左右，antiLFY 1.4Kb左右，均和預(yù)期相符。而對(duì)于Pnfl:GFP，GFP既是新載體需要片段，又是要用酶切下的，而Pnfl并沒有什么作用，所以只用檢測GFP就夠了，這里用了酶切和PCR兩種方法，切出的GFP 750bp左右，PCR條帶500bp左右，和預(yù)期相符。分別如圖3.3，3.4所示。由圖可見，這兩個(gè)質(zhì)粒均是可用的。 連接后，對(duì)重組載體進(jìn)行篩選。圖3.5顯示酶切鑒定Plfy的結(jié)果，切出的片段大小（1Kb左右）與預(yù)期相符，而且通過和Plfy:antiLFY酶切后的結(jié)果并排跑電泳，更充分證明了切出的小片段確實(shí)是來自于Plfy:antiLFY的Plfy。同理，圖3.6，3.7通過與Pnfl:GFP并排作酶切、跑電泳，證明了切出的小片段是來自于Pnfl:GFP的GFP。Plfy:GFP質(zhì)粒構(gòu)建成功。 圖3：質(zhì)粒Plfy:GFP的構(gòu)建圖3.1: 檢測Plfy:antiLFY (Plfy)Lane 1: DNA/EcoRI+HindIII DNA Marker Lane 2: Plfy:antiLFY plasmid Lane 3: Plfy:antiLFY/EcoRI+XbaI Lane 4: Plfy:antiLFY/EcoRI+XhoI Lane 5: Plfy:antiLFY/EcoRI+KpnI Lane 6: Plfy:antiLFY/PstI+XbaI Lane 7: Plfy:antiLFY/PstI+XhoI Lane 8: Plfy:antiLFY/PstI+KpnI Lane 9: DL2000 DNA Marker圖3.2: 檢測Plfy:antiLFY（antiLFY）Lane 1: DNA/EcoRI+HindIII DNA Marker Lane 2: Plfy:antiLFY質(zhì)粒 Lane 3: Plfy:antiLFY/XbaI+SacI Lane 4: Plfy:antiLFY/XhoI+SacI Lane 5: Plfy:antiLFY/KpnI+SacI Lane 6: Plfy:antiLFY/XbaI+BamHI Lane 7: Plfy:antiLFY/XhoI+BamHI Lane 8: Plfy:antiLFY/KpnI+BamHI Lane 9: DL2000 DNA Marker圖3.3：檢測Pnfl:GFP（GFP）Lane 1: DL2000 DNA Marker Lane 2: Pnfl:GFP/XbaI+SacI Lane 3: Pnfl:GFP質(zhì)粒圖3.4：檢測Pnfl:GFP（GFP）Lane 1: 以無菌水為模板的PCR產(chǎn)物（負(fù)對(duì)照） Lane 2: 正對(duì)照 Lane 3: 以Pnfl:GFP為模板的PCR產(chǎn)物 Lane 4: DL2000 DNA Marker圖3.5: 新構(gòu)建的Plfy:GFP酶切鑒定（檢測Plfy）Lane 1: Plfy:antiLFY質(zhì)粒 Lane 2: 新構(gòu)建的Plfy:GFP質(zhì)粒 Lane 3: Plfy:antiLFY/PstI+XbaI Lane 4: Plfy:GFP/PstI+XbaI Lane 5: Plfy:GFP/PstI+BamHI Lane 6: Plfy:antiLFY/EcoRI+XbaI Lane 7: Plfy:GFP/EcoRI+XbaI Lane 8: Plfy:GFP/EcoRI+BamHI Lane 9: DL2000 DNA Marker圖3.6: 新構(gòu)建的Plfy:GFP酶切鑒定（檢測GFP）Lane 1: Pnfl:GFP質(zhì)粒 Lane 2: Pnfl:GFP/XbaI+SacI Lane 3: Plfy:GFP/XbaI+SacI Lane 4: Plfy:GFP質(zhì)粒圖3.7: 新構(gòu)建的Plfy:GFP PCR鑒定（檢測GFP）Lane 1: DL2000 DNA Marker Lane 2: Plfy:GFP PCR產(chǎn)物 Lane 3: Pnfl:GFP PCR 產(chǎn)物 Lane 4: 以水為模板的PCR結(jié)果 Lane 5: DL2000 DNA Marker 討論本實(shí)驗(yàn)的目的是深入研究LFY類基因的