反轉(zhuǎn)錄病毒 課件.ppt

逆轉(zhuǎn)錄病毒Retroviruses 1 醫(yī)學交流課件 逆轉(zhuǎn)錄病毒 Retroviruses 歸類于逆轉(zhuǎn)錄病毒科 包括一大類含有逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA病毒 分為腫瘤病毒亞科 Oncovirinae 慢病毒亞科 Lentivirinae 和泡沫病毒亞科 Spumavirinae 每一亞科又有若干個屬 2 醫(yī)學交流課件 逆轉(zhuǎn)錄病毒的分類 3 醫(yī)學交流課件 逆轉(zhuǎn)錄病毒共同的生物學特性 病毒呈球形 有包膜 直徑80 120nm 病毒基因組由兩條相同的單正鏈RNA形成的二聚體組成 病毒的核心含有逆轉(zhuǎn)錄酶 RNA水解酶和整合酶 復制有一個獨特的逆轉(zhuǎn)錄和與宿主細胞的整合過程 病毒基因組RNA先逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA 然后整合到宿主細胞的染色體DNA中 具有gag pol和env3個結(jié)構(gòu)基因 4 醫(yī)學交流課件 第一節(jié)人類免疫缺陷病毒1981年美國疾病控制中心科學家發(fā)現(xiàn)獲得性免疫缺陷綜合癥 1983年法國巴斯德研究所Montagnier等首次從一例慢性淋巴腺病的男性同性戀病人血液中分離到的一株新逆轉(zhuǎn)錄病毒 稱為淋巴腺病相關病毒 LAV 1984年 美國Gallo等亦從艾滋病人中分離到相似的逆轉(zhuǎn)錄病毒 稱之為人類嗜T淋巴細胞病毒 型 HTLV 1986年 國際病毒分類委員會將LAV HTLV 統(tǒng)一命名為人類免疫缺陷病毒 humanimmunodeficiencyvirus HIV 5 醫(yī)學交流課件 HIV是獲得性免疫缺陷綜合征 acquiredimmunodeficiencysyndrome AIDS 的病原體 HIV分HIV 1型和HIV 2型 前者引起全球AIDS流行 后者主要分離自西部非洲的艾滋病患者 我國自1985年發(fā)現(xiàn)首例AIDS以來 感染人數(shù)逐年快速增長 6 醫(yī)學交流課件 根據(jù)編碼包膜蛋白的env基因和編碼殼蛋白的gag基因序列的同源性 HIV 1型又進一步分為3個組 M亞型組 main即主要組 O亞型組 outline即外圍組 和N亞型組 new ornon M non O新組或非M非O組 其中M組有A B C D E F G H I J K11個亞型 O組是1990年從喀麥隆和加蓬分離到的 與M組其他亞型的氨基酸序列只有50 的同源性 N組是最近才從兩名喀麥隆病人分離到的 在系統(tǒng)樹上 既不屬于M組 也不屬于O組的一組新病毒 故稱N組 7 醫(yī)學交流課件 不同組甚至不同亞型在全球流行是不均一的 HIV 1的O組 N組和HIV 2型只局限在非洲某些局部地區(qū)流行 而HIV 1的M組病毒呈全球性流行 到目前為止 全球流行的絕大多數(shù)毒株是HIV 1M組中的A C亞型毒株 接著是B亞型毒株 然后是A E和A G亞型重組毒株 進一步的分子流行病調(diào)查表明 在非洲幾乎流行了HIV的所有亞型 但以A和C亞型為主 8 醫(yī)學交流課件 HIV 1型M亞型組A B C D E F G H I J K共11個亞型O亞型組N亞型組HIV 2型A B C D E F G共7個亞型 9 醫(yī)學交流課件 一 生物學性狀HIV為20面體對稱結(jié)構(gòu) 球形 電鏡下可見一致密圓錐狀核心 內(nèi)有病毒RNA分子和酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 整合酶和蛋白酶 HIV的最外層為脂蛋白包膜 膜上有表面蛋白 gp120 和鑲嵌蛋白 gp41 兩種糖蛋白 gp120為刺突 gp41為跨膜蛋白 包膜內(nèi)面為P17構(gòu)成的基質(zhì)蛋白 其內(nèi)為衣殼蛋白 P24 包裹的RNA 10 醫(yī)學交流課件 HIV結(jié)構(gòu)模式圖 11 醫(yī)學交流課件 HIV基因組由兩個拷貝的正鏈單股RNA組成 在其5 端可通過氫鍵結(jié)合構(gòu)成二聚體 HIV的基因組成較其他逆轉(zhuǎn)錄病毒復雜 全長約9 2kb 含有gag pol和env三個結(jié)構(gòu)基因 以及tat rev nef vif vpr和vpu等調(diào)控基因 12 醫(yī)學交流課件 HIV的復制過程 首先借助其包膜糖蛋白刺突gp120 與易感細胞表面的CD4分子結(jié)合并進一步介導包膜與宿主細胞膜的融合 核衣殼進入細胞 于胞質(zhì)內(nèi)脫殼釋放出RNA 13 醫(yī)學交流課件 HIV LifeHistory EntryintothecellT4 CD4 cellsaremajortarget HumanHeLaCell HumanHeLaCelltransfectedwithCD4antigen NOTINFECTED INFECTED 14 醫(yī)學交流課件 CD4 cell HIVgp120bindstoCD4 co receptor 15 醫(yī)學交流課件 HIV LifeHistory CD4 CD4 CD4 HIV CCR5 CCR5 chemokine MutantCCR5 macrophage 16 醫(yī)學交流課件 HIV復制 在病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和病毒體相關的DNA多聚酶的作用下 病毒RNA先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 構(gòu)成RNA DNA中間體 其中的RNA再經(jīng)RNA酶H水解 而以剩下的負鏈DNA復制成雙股DNA 插入宿主DNA 成為細胞染色體的一部分 即前病毒 當前病毒活化 在宿主RNA聚合酶的作用下 病毒的DNA轉(zhuǎn)錄為RNA并分別經(jīng)拼接 加帽或加尾形成HIV的mRNA或子代病毒RNA mRNA在宿主細胞核糖體上翻譯蛋白質(zhì) 子代RNA則與病毒結(jié)構(gòu)蛋白裝配成核衣殼 從宿主細胞釋出時獲得包膜 成為具有感染性的子代病毒 17 醫(yī)學交流課件 18 醫(yī)學交流課件 HIV的變異HIV具有高度變異性 主要取決于env nef ltr及pol等基因 不同病毒株間在上述基因的變異率各不相同 env基因編碼包膜糖蛋白抗原 此類抗原的變異與HIV的流行和逃避宿主的免疫應答密切相關 根據(jù)env基因序列的不同 將國際上流行的HIV 1分為M N和O群 其中M又有A K等11個亞型之分 19 醫(yī)學交流課件 培養(yǎng)特性在體外 HIV只感染CD4 T細胞和巨噬細胞 新鮮分離的正常人T細胞 病人自身分離的T細胞培養(yǎng)或某些T細胞株 感染后細胞出現(xiàn)不同程度的病變 培養(yǎng)液中可測到逆轉(zhuǎn)錄酶活性 而培養(yǎng)細胞中可查到病毒的抗原 動物接種 恒河猴 黑猩猩 20 醫(yī)學交流課件 二 致病性與免疫性1 傳染源 HIV攜帶者和艾滋病患者2 傳播途徑 性接觸傳播 輸血或血制品傳播 母 嬰垂直傳播 21 醫(yī)學交流課件 3 致病機制 1 損傷CD4 細胞 以CD4 細胞為中心的免疫功能全面障礙 其他細胞損傷 如單核 巨噬細胞 小神經(jīng)膠質(zhì)細胞等 2 其他免疫細胞功能異常 CD4 細胞是重要的免疫調(diào)節(jié)細胞 其數(shù)量和功能的改變都將影響其他免疫細胞的狀態(tài) 3 HIV具有高度變異性 影響機體抗感染免疫和疫苗的研究 22 醫(yī)學交流課件 1 PUNCTUREDMEMBRANE 1 病毒增殖導致胞膜通透性增加 23 醫(yī)學交流課件 UninfectedCD4cellgp120negative CellsFuse 2 形成多核巨細胞而導致細胞死亡 InfectedCD4cellgp120positive WhydoallT4cellsdisappear 24 醫(yī)學交流課件 3 損傷CD4 T細胞 WhydoallT4cellsdisappear 25 醫(yī)學交流課件 4 臨床特征 1 原發(fā)感染急性期 2 無癥狀潛伏期 3 AIDS相關綜合征期 4 典型AIDS期 AIDS的診斷標準已由CDC確定 26 醫(yī)學交流課件 感染艾滋病毒的早期癥狀1 艾滋病一般性癥狀持續(xù)發(fā)燒 盜汗 虛弱 全身淺表淋巴結(jié)腫大 體重下降在三個月之內(nèi)可達10 以上 最多可降低40 病人消瘦特別明顯 2 消化道癥狀食欲下降 厭食 惡心 嘔吐 腹瀉 嚴重時可便血 通常用于治療消化道感染的藥物對這種腹瀉無效 3 神經(jīng)系統(tǒng)癥狀頭暈 頭痛 反應遲鈍 智力減退 精神異常 抽風 偏癱 癡呆等 4 皮膚和粘膜損害彌漫性丘疹 帶狀皰疹 口腔和咽部粘膜炎癥及潰爛 5 腫瘤可出現(xiàn)多種惡性腫瘤 位于體表的卡波希氏肉瘤可見紅色或紫紅色的斑疹 丘疹和浸潤性腫塊 27 醫(yī)學交流課件 因此建議在高危行為的6周或三個月后去做HIV抗體檢測 只有在艾滋病病毒感染的潛伏期 發(fā)現(xiàn)艾滋病病毒感染才有可能治療并控制病情發(fā)展 否則一旦發(fā)展為艾滋病病人 就很難挽回了 28 醫(yī)學交流課件 CD4細胞 l 10005002502001000 41015年 500 250 250 100 淋巴結(jié)腫口腔白斑白色念珠菌感染帶狀皰疹結(jié)核PcPKaposi肉瘤消耗病弓形體病CMV感染非典型分枝桿菌淋巴瘤 CD4 T細胞進行性下降與并發(fā)癥之間的關系 29 醫(yī)學交流課件 5 免疫性在HIV感染過程中 機體可產(chǎn)生高效價的抗HIV多種蛋白的抗體 包括抗gp120的中和抗體 這些抗體主要在急性期降低血清中的病毒抗原數(shù)量 但不能清除細胞內(nèi)病毒 HIV感染也可引起細胞免疫應答 包括特異性CTL和非特異性NK細胞的殺傷作用 其中CTL對HIV感染細胞的殺傷十分重要 但也不能徹底清除潛伏感染的病毒 30 醫(yī)學交流課件 三 微生物學檢查法1 檢測特異性抗體檢查血清中抗gp120的抗體 可用ELISA IFA RIA 適用于篩查 HIV的gpl20與淋巴細胞膜上的MHC 類分子有同源區(qū) 所以會出現(xiàn)假陽性反應 檢出陽性標本 再用蛋白印跡法 westernblottest 等方法復核確診 2 病毒分離培養(yǎng)敏感細胞有T淋巴細胞株 新鮮分離的正常人淋巴細胞 31 醫(yī)學交流課件 HIV抗體篩查檢測流程 32 醫(yī)學交流課件 3 病毒抗原測定常用ELISA法檢測HIV的核心蛋白P24 此抗原特異性高 常出現(xiàn)于急性感染期 而在潛伏期常為陰性 但發(fā)展為AIDS時 P24抗原又可重新升高 4 測定病毒核酸 1 原位雜交 2 RT PCR 3 病毒載量5 CD4 T細胞計數(shù) 33 醫(yī)學交流課件 四 防治原則1 非醫(yī)療措施 廣泛開展宣傳教育 普及AIDS的傳播途徑和預防知識 建立和加強對HIV感染的監(jiān)測體系 加強進出口管理 嚴格國境檢疫 對供血者作HIV及其抗體檢測 保證血源的安全性 34 醫(yī)學交流課件 2 疫苗研制新一代疫苗的必要條件安全性 產(chǎn)生CTL反應和抗體反應 以本地流行毒株組分為主 包含盡可能多的抗原決定簇 避免帶有可能誘發(fā)增強抗體和自身免疫反應的組分 難題是病毒包膜蛋白的高度變異性 35 醫(yī)學交流課件 3 抗病毒藥物治療抗HIV的藥物包括三大類 核苷類藥物 非核苷類藥物 蛋白酶抑制劑聯(lián)合交替使用 三合一 2種HlV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和1種蛋白酶抑制劑即所謂 雞尾酒療法 可有效抑制病毒在體內(nèi)的復制 因而能減輕病人癥狀及延長感染者和病人的生命 36 醫(yī)學交流課件 4 治療措施抗病毒治療機會感染重建免疫功能抗腫瘤 37 醫(yī)學交流課件 舉例 HIV AIDS的實驗室檢查 HIV AIDS的實驗室檢測主要包括 HIV抗體 HIV核酸 CD4 T淋巴細胞 HIV基因型耐藥檢測等 HIV1 2抗體檢測是HIV感染診斷的金標準HIV核酸定量 病毒載量 檢測和CD4 T淋巴細胞計數(shù)是判斷疾病進展 臨床用藥 療效和預后的兩項重要指標HIV基因型耐藥檢測可為高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療方案的選擇和更換提供科學指導 38 醫(yī)學交流課件 HIV1 2抗體檢測篩查試驗 含初篩和復檢 酶聯(lián)免疫吸附試驗 ELISA 化學發(fā)光或免疫熒光試驗快速檢測 斑點ELISA和斑點免疫膠體金或膠體硒快速試驗明膠顆粒凝集試驗 免疫層析試驗 HIV1 2抗體檢測確證試驗常用的方法 免疫印跡法 WB 39 醫(yī)學交流課件 人類免疫缺陷病毒 HIV1 2 抗體診斷試劑盒 膠體金法 說明書 本試劑是根據(jù)免疫學金標法 雙抗原夾心和免疫層析原理制成 先在硝酸纖維膜上包被基因重組HIV1 2型抗原 EnV16 再在玻璃纖維上吸附膠體金標記的HIV重組抗原 EnV18 組合制成試紙條 檢測時樣品中如有抗HIV抗體 則與膠體金標記的基因重組 HIV 1 2型抗原蛋白 Ag Au 形成復合物 由于層析作用復合物沿膜帶移動 與檢測區(qū)包被的基因重組 HIV 1 2型抗原形成雙抗原夾心免疫復合物 呈現(xiàn)一條紅色線 即可判定為HIV抗體陽性 如樣品中無抗HIV抗體 則無此反應 顯示陰性結(jié)果 該方法可用于檢測人血清或血漿中的HIV1 2型抗體 適用于無償獻血的現(xiàn)場篩查 產(chǎn)品組成1 HIV1 2抗體診斷試紙條50人份2 說明書1份標本采集標本為血清樣品 按臨床常規(guī)方法采集 使用方法1 從袋中取出試紙條 于非樣品端作好標記 2 于試紙條的樣品端滴加2滴樣本 約100微升 亦可將試紙條浸于樣本液中 注意液面不能超過標志線 否則檢測結(jié)果無效 3 反應30分鐘判定結(jié)果 結(jié)果判斷陽性 可見兩條紫紅色區(qū)帶顯色 既反應線 T 和質(zhì)控線 C 陰性 僅見一條紫紅色區(qū)帶 即質(zhì)控線 C 顯色 無效 無任何色線出現(xiàn)或僅反應帶顯色 應換新試紙條重測 40 醫(yī)學交流課件 篩查試驗陰性 可出具HIV1 2抗體陰性報告見于未被HIV感染的個體但處于窗口期的新近感染者也可呈陰性反應 41 醫(yī)學交流課件 篩查試驗 陽性 應用原有試劑和另外一種不同原理或不同廠家的試劑進行重復檢測或另外兩種不同原理或不同廠家的試劑進行重復檢測如兩種試劑復測均呈陰性反應 則為HIV抗體陰性如有一種或兩種試劑呈陽性反應 需進行HIV抗體確證試驗 42 醫(yī)學交流課件 確診試驗 出現(xiàn)HIV1 2抗體特異帶 但不足以判定陽性 報告HIV1 2抗體不確定 可在4周后隨訪 如帶型沒有進展或呈陰性反應 則報告陰性如隨訪期間發(fā)生帶型進展 符合HIV抗體陽性判定標準則為HIV抗體陽性如帶型仍不滿足陽性標準 繼續(xù)隨訪到8周 如帶型沒有進展或呈陰性反應則報告陰性 43 醫(yī)學交流課件 確診試驗 滿足HIV陽性診斷標準則報告陽性 不滿足陽性標準可視情決定是否繼續(xù)隨訪經(jīng)確證試驗HIV 1 2抗體陽性者 出具HIV 1 2抗體陽性確認報告 并按規(guī)定做好咨詢 保密和報告工作 44 醫(yī)學交流課件 實驗室檢查 病毒載量測定 病毒載量一般用血漿中每毫升HIVRNA的拷貝數(shù) copies ml 或每毫升國際單位 IU ml 來表示 45 醫(yī)學交流課件 實驗室檢查 病毒載量測定 病毒載量測定常用方法反轉(zhuǎn)錄PCR系統(tǒng) RT PCR 核酸序列依賴性擴增 NASBANucliSens 技術分枝DNA信號放大系統(tǒng) bDNA 實時熒光定量PCR擴增技術 real timePCR 46 醫(yī)學交流課件 實驗室檢查 病毒載量測定 病毒載量測定的臨床意義預測疾病進程提供開始抗病毒治療依據(jù)作為HIV感染早期診斷的參考指標小于18月齡的嬰幼兒HIV感染診斷可以采用核酸檢測方法 以2次核酸檢測陽性結(jié)果作為診斷的參考依據(jù)18月齡以后再經(jīng)抗體檢測確認 47 醫(yī)學交流課件 實驗室檢查 病毒載量測定 推薦病毒載量檢測頻率對于已接受抗病毒治療6個月以上 病毒持續(xù)抑制的患者 可每6個月檢測一次 HAART治療6個月內(nèi)或病毒載量抑制不理想或需調(diào)整治療方案時病毒載量的檢測頻率需根據(jù)患者的具體情況由臨床醫(yī)生決定 如條件允許 建議未治療的無癥狀HIV感染者每年檢測一次 ART初始治療或調(diào)整治療方案前 初治或調(diào)整治療方案初期每4 8周檢測一次 以便盡早發(fā)現(xiàn)病毒學失敗 病毒載量低于檢測下限后 每3 4個月檢測一次 對于依從性好 病毒持續(xù)抑制達2 3年以上 臨床和免疫學狀態(tài)平穩(wěn)的患者可每6個月檢測一次 48 醫(yī)學交流課件 CD4 T淋巴細胞檢測 CD4 T淋巴細胞是HIV感染最主要的靶細胞 HIV感染人體后 出現(xiàn) CD4 T淋巴細胞進行性減少CD4 CD8 T細胞比值倒置現(xiàn)象細胞免疫功能受損進行HAART治療 CD4 T淋巴細胞在病程的不同階段可有不同程度的增加 49 醫(yī)學交流課件 目前常用的CD4 T淋巴細胞亞群檢測方法為流式細胞術可以直接獲得CD4 T淋巴細胞數(shù)絕對值或通過白細胞分類計數(shù)后換算為CD4 T淋巴細胞絕對數(shù)如果進行HAART治療 CD4 T淋巴細胞在病程的不同階段可有不同程度的增加 50 醫(yī)學交流課件 CD4 T淋巴細胞計數(shù)的臨床意義是了解機體的免疫狀態(tài)和病程進展確定疾病分期和治療時機判斷治療效果HIV感染者的臨床合并癥 51 醫(yī)學交流課件 CD4 T淋巴細胞計數(shù)的檢測間隔時間需根據(jù)患者的具體情況由臨床醫(yī)生決定一般建議對于CD4 T淋巴細胞數(shù) 350 mm3的HIV無癥狀感染者 每6個月應檢測一次對于已接受ART的患者在治療的第一年內(nèi)應每三個月進行一次CD4 T淋巴細胞數(shù)檢測 治療一年以上且病情穩(wěn)定的患者可改為每半年檢測一次 52 醫(yī)學交流課件 HIV基因型耐藥檢測 HIV耐藥檢測結(jié)果可為艾滋病治療方案的制定和調(diào)整提供重要參考 耐藥測定方法有基因型和表型 目前國外及國內(nèi)多用基因型推薦在以下情況進行HIV基因型耐藥檢測抗病毒治療病毒載量下降不理想或抗病毒治療失敗需要改變治療方案時如條件允許 進行抗病毒治療前 最好進行耐藥性檢測 以選擇合適的抗病毒藥物 取得最佳抗病毒效果對于抗病毒治療失敗者 耐藥檢測需在病毒載量 1000拷貝 ml且未停用抗病毒藥物時進行 如已停藥需在停藥4周內(nèi)進行基因型耐藥檢測 53 醫(yī)學交流課件 HIV基因型耐藥檢測 HIV基因型檢測出現(xiàn)HIV耐藥表示該感染者體內(nèi)病毒可能耐藥 同時需要密切結(jié)合臨床 充分考慮HIV感染者的依從性 對藥物的耐受性及藥物的代謝吸收等因素綜合進行評判改變抗病毒治療方案需要在有經(jīng)驗的醫(yī)師指導下才能進行HIV耐藥結(jié)果陰性抗表示該份樣品通過基因型耐藥檢測未檢出耐藥性 不能確定該感染者不存在耐藥情況 54 醫(yī)學交流課件 我國抗病毒治療面臨的挑戰(zhàn) 整體治療水平低 監(jiān)測能力受限制藥物種類少 長期治療的毒副作用越來越突出特殊人群的治療 HCV HBV TB 孕婦 兒童 病毒耐藥帶來更大的治療困難 55 醫(yī)學交流課件 56 醫(yī)學交流課件 核苷類藥物被細胞編碼的磷酸激酶作用后 摻入子代病毒DNA中造成病毒基因組缺陷 不能正常進行復制和轉(zhuǎn)錄 疊氮胸苷Zidovudine AZT 齊多呋定用于治療艾滋病獲得性免疫缺陷綜合征 病人有合并癥 卡氏肺囊蟲病或其他感染 時尚需應用對癥的其他藥物聯(lián)合治療 成人常用量 次 每 小時 次 按時間給藥 有貧血的病人 可按 次 給藥 57 醫(yī)學交流課件 國際上現(xiàn)有的抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物 核苷類似物AZT zidovudine Retrovir疊氮胸苷ddI didanosine VidexEC地達諾新ddC zalcitabine Hivid扎西他賓d4T stavudine Zerit司他夫定3TC lamivudine Epivir拉米夫定abacavir Ziagen阿巴卡韋FTC emtricitabine Emtriva恩曲他濱8 tenofovir Viread泰諾福韋 58 醫(yī)學交流課件 非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 9 delavirdine Rescriptor地拉韋啶10 nevirapine Viramune奈韋拉平11 efavirenz Sustiva依法韋侖12 etravirine Intelence依曲偉林 59 醫(yī)學交流課件 13 indinavir Crixivan r茚地那韋14 saquinavirInvirase