基因工程(全英).ppt

全國(guó)高等醫(yī)藥教材建設(shè)研究會(huì)衛(wèi)生部規(guī)劃教材全國(guó)高等學(xué)校教材供七 八年制臨床醫(yī)學(xué)等專業(yè)用醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)MedicalMolecularBiology主編馮作化人民衛(wèi)生出版社2005年8月第一版課件制作 吳耀生 版權(quán)所有 廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室2009 12 第十三章 基因工程與基因體外表達(dá) GeneEngineeringandGeneExpression 目的與意義 1 獲得感興趣的目的基因 2 研究基因結(jié)構(gòu)特征 3 表達(dá)基因產(chǎn)物 4 研究基因功能 基本要素 1 目的基因 targetgenes 2 工具酶 toolenzymes 3 載體 vectors 4 宿主細(xì)胞 hostcells Maincontents 工具酶 DNA載體 基因克隆過(guò)程 真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染 基因改造 克隆基因表達(dá) 電子克隆 基本概念及背景 ForExample 如何從植物中克隆法呢基焦磷酸合酶 FPS 1 查資料認(rèn)識(shí)FPS 2 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案 3 可行性分析 ForExample FPS克隆 RT PCR 3 RACE 5 RACE 改進(jìn)的異硫氰酸胍一步法提取三七根部總RNA RT PCR擴(kuò)增fps部分保守序列 3 RACE及克隆測(cè)序 5 RACE及克隆測(cè)序 序列拼接 mRNA 5 AAAAAA3 TTTTTTT 接頭 cDNA OligodT接頭 基因特異性引物 3 FullRACE原理圖 5 FullRACE原理圖 1 5 端磷酸化RT Primer 逆轉(zhuǎn)錄 RNA分解 用RNAligase進(jìn)行環(huán)化或形成首尾連接物 1stand2ndPCR 5 端磷酸化RTprimer部位 包含未知的5 上游區(qū)域的擴(kuò)增產(chǎn)物 2 3 4 ThankYou DNA重組DNArecombination Someconcernedconcepts DNA重組技術(shù)DNArecombinationtechnique 分子克隆Molecularcloning 基因工程Geneticengineering 克隆Cloning 三大理論基礎(chǔ) 1953年 Watson和Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制原理 解決了基因的自我復(fù)制和傳遞的過(guò)程 40年代 O T Avery等通過(guò)肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的攜帶者是DNA而不是蛋白質(zhì) 50年代末到60年代初 相繼提出了 中心法則 和操縱子學(xué)說(shuō) 成功破譯了遺傳密碼 闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問(wèn)題 三大技術(shù)發(fā)明 DNA分子的體外切割與連接技術(shù)1970年Smith Wilcox流感嗜血桿菌 Haemopbilusinfluenzae HindII1972年BoyerEcoRI GAATTC 1967年世界上5個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了DNAligase1970年T4DNAligase 大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立 復(fù)制工廠 基因工程載體的使用 plasmid phage viruses 1978年Nobel醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎(jiǎng) TheNobelPrizeinMedicinewasawarded in1978 toDanielNathans WernerArber andHamiltonSmithforthediscoveryofrestrictionendonucleases TheirdiscoveryleadtothedevelopmentofrecombinantDNAtechnologythatallowed forexample thelargescaleproductionofhumaninsulinfordiabeticsusingE colibacteria Over3000restrictionenzymeshavebeenstudiedindetail andmorethan600oftheseareavailablecommerciallyandareroutinelyusedforDNAmodificationandmanipulationinlaboratories DNAligaserepairingchromosomaldamage ligaseI DNA ATP dependent 第一節(jié)基因克隆是利用工具酶進(jìn)行操作 工具酶 Toolenzymes 用于對(duì)DNA分子進(jìn)行定點(diǎn)切割 連接 擴(kuò)增 標(biāo)記等操作的特殊酶類 已被純化并商品化進(jìn)行應(yīng)用 一 限制酶 RE restrictionendonuclease 二 其他工具酶 othertoolenzymes 一 RE在基因克隆中用于切割DNA RE restrictionenzyme restrictionendonuclease 限制性核酸內(nèi)切酶 限制酶 能識(shí)別DNA雙鏈內(nèi)特異位點(diǎn)并水解磷酸二酯鍵 產(chǎn)生特定末端的酶 RestrictionenzymeFunctions 能識(shí)別DNA內(nèi)部特異位點(diǎn)并且裂解磷酸二酯鍵 1 Sortingofrestrictionenzyme有三型 但最重要的是II型酶 2 NamingofRE 細(xì)菌屬名 細(xì)菌種名 細(xì)菌菌株 編號(hào) EscherichiacoliRY13I 屬 Genus 種 species 菌株 strain EcoRI Twocatalyticmanganeseions onefromeachmonomer areshownasmagentaspheresandareadjacenttothecleavedsitesintheDNAmadebytheenzyme depictedasgapsintheDNAbackbone StructureofthehomodimericrestrictionenzymeEcoRI cyanandgreencartoondiagram boundtodoublestrandedDNA browntubes basedonthePDB1QPSX raycrystallographiccoordinates 3 限制酶的識(shí)別和切割位點(diǎn)Characters 通常識(shí)別4 6個(gè)堿基 少數(shù)識(shí)別8個(gè)所識(shí)別的序列一般為回文結(jié)構(gòu) palindrome 在特異位點(diǎn)內(nèi)切割DNA雙鏈 產(chǎn)生兩種末端 粘性末端 平端 5 粘性末端 3 粘性末端 5 CCCGGG 3 3 GGGCCC 5 5 CCCGGG 3 3 GGGCCC 5 平端切割 bluntend suchasSmaI Goto109 5 GGTGAATTCAGC 3 3 CCACTTAAGTCG 5 5 TTGCTGCAGAAG 3 3 AACGACGTCTTC 5 5 粘性末端 EcoRI 3 粘性末端 PstI 5 GGTGAATTCAGC 3 3 CCACTTAAGTCG 5 5 TTGCTGCAGAAG 3 3 AACGACGTCTTC 5 4 同工異源酶 isoschizomers 來(lái)源不同 但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)的RE例 BamHI不需ATPRE識(shí)別序列長(zhǎng)度與切點(diǎn)數(shù) 對(duì)同一DNA 識(shí)別序列短的 切點(diǎn)數(shù)多 片段較短 反之則反之 二 基因克隆需要具有不同功能的工具酶 其他工具酶 用于對(duì)DNA分子進(jìn)行多種操作 也叫修飾酶 作用 剪切 補(bǔ)平 連接 化學(xué)修飾等 常用 1 DNApolymeraseI KlenowFragment 2 Reversetranscriptase 3 T4DNAligase 4 Alkalinephosphatase 5 Terminaldeoxynucleotidyltransferase TdT 6 TaqDNApolymeraseSoon 1 DNApolymeraseIActivities 5 3 聚合活性 5 3 及3 5 外切活性Functions 在生物體內(nèi) 填補(bǔ)引物切除后留下的空缺 修復(fù)在生物體外 缺口平移制備探針 DNApolymeraseI Klenowfragment 76KD Anothersmallfragment 枯草桿菌蛋白酶 Klenow片段 E coliDNApolI 5 3 外切酶 5 3 聚合酶 3 5 外切酶 用枯草桿菌蛋白酶裂解全酶 5 3 聚合酶 3 5 外切酶 Klenowfragment用途 1 補(bǔ)齊雙鏈DNA的3 末端2 通過(guò)補(bǔ)齊3 端使3 端標(biāo)記3 在cDNA克隆中 第二股鏈的合成4 DNA序列分析 常用的reversetranscriptase 禽類成骨細(xì)胞性白血病病毒 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 2 Reversetranscriptase 用途 合成cDNA 構(gòu)建cDNA文庫(kù) Moloney小鼠白血病病毒 MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 第二節(jié)基因克隆需要特定的DNA載體 基因克隆為什么需要載體 載體的類型 克隆載體 表達(dá)載體 載體的來(lái)源 細(xì)菌質(zhì)粒 噬菌體DNA DNA M13DNA 病毒DNA 人工載體 cosmid 等 DNA載體 vector 能與DNA片段連接 構(gòu)建成新的重組DNA分子 并可攜帶該外源DNA片段進(jìn)入一定宿主細(xì)胞 在宿主中擴(kuò)增甚至表達(dá) 并有遺傳標(biāo)記進(jìn)行篩選 載體的概念 Cloningvector 能夠攜帶感興趣的外源DNA targetDNA 進(jìn)入宿主細(xì)胞 并將外源DNA在宿主內(nèi)進(jìn)行克隆和擴(kuò)增 而采用的一些DNA分子稱為Cloningvector Cloningvectorclasses PlasmidDNA 質(zhì)粒DNA PhageDNA 噬菌體DNA VirusDNA 病毒DNA Expressionvector 能使外源基因在宿主中表達(dá)的載體 Expressionvector 含表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件 WhenEcoliisusedashostcell plasmid phage cosmid M13phagecanusuallybeusedasvectors 載體的本質(zhì)是什么 Vectorcharacters cloningvector 能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制 自我表達(dá)分子相對(duì)較小 在宿主細(xì)胞中有高拷貝具有遺傳標(biāo)志有多個(gè)限制性酶單一酶切位點(diǎn) 多克隆位點(diǎn) 易與宿主DNA相分離 一 常用克隆載體主要來(lái)自質(zhì)粒和病毒 一 質(zhì)粒是常用的克隆載體 Examples pBR322pUC Characters Smallmolecularweight highcopiesMorethanonegeneticmarkMultiplecloningsites MCS pBR322 Turnto64 pUC19 二 噬菌體經(jīng)過(guò)重組也可以攜帶外源DNA Examples bacteriophage phage M13phageItisakindofviruswhichcaninfectbacteria bacteriophagesincommonuse EMBLspectrum gtspectrumCharonspectrum bacteriophage phage 噬菌體是侵犯細(xì)菌的病毒 在菌體內(nèi)為環(huán)狀DNA分子 分離產(chǎn)物為雙鏈線狀DNA分子 有天然的粘性末端 稱COS位點(diǎn) 進(jìn)入宿主菌后可自行環(huán)合 基因組DNA長(zhǎng)約為48 5Kb 共有66個(gè)基因 較復(fù)雜 Character 1 其生長(zhǎng)必需的序列位于左右二臂上 中部約30 為生長(zhǎng)非必需 2 成熟需要包裝 大小為原來(lái)的75 105 時(shí) Twokindsofvectors 置換型載體 插入型載體 置換型 噬菌體載體 用限制酶切除中央片段供目的基因替代 目的基因與左 右載體兩臂結(jié)合 替代片段可達(dá)9 23Kb 左臂 中央片段 右臂 酶切點(diǎn) 酶切點(diǎn) 切除后用目的基因取代 COS位點(diǎn) COS位點(diǎn) 12bp Thelifeperiodof phage 噬菌體的生活周期 Lysogenicpathway 溶原生長(zhǎng)途徑 Lysispathway 溶菌生長(zhǎng)途徑 溶原生長(zhǎng) 溶菌生長(zhǎng) 溶原轉(zhuǎn)溶菌生長(zhǎng) 以噬菌體為媒介的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 gt10 insertionvector multiplecloningsite CI Thepositivemarksofscreening Whethertherecombinantvectorcanbewrapped IfnoextraneousDNAreplaced thevectorwouldbetoosmalltobewrapped Withinsertion CIactivitylost tobetransparentspots Withoutinsertion CIkeepsintact tobeturbidspots gt11 insertionvector MCS lacZ expressed Withinsertionintolaczof gt11 whitespotsOtherwisebluespots 四 粘性質(zhì)粒適合克隆較大的DNA片段 粘性質(zhì)粒 cosmid 由 DNA的cos區(qū)與質(zhì)粒重新構(gòu)建的載體 具有與質(zhì)粒相同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 為雙鏈環(huán)狀DNA Itisconstructedwiththecosregionof DNAandplasmid whichisdoublecycleDNAwithbiggercontentforcloning 40 50kb Characters 1 Withantibioticsmarksandreplicationelementitself2 Withcosregionof phage canbewrapped3 Withoneormorecloningsites4 Smallmolecularweight5 non recombinationcosmidtoosmalltobewrapped soitisscreenedeasily 三 M13噬菌體適合制備單鏈DNA M13bacteriophage ItisakindofEcoliphage thegenome6 5kb acycleDNAcontainingsinglestrandDNA Twoforms Wildform Replicationform RF Themostmerit Canbereleasedfromhostassinglestrand M13phageCharacters Invivo doublestrandsDNA canbereplicated Invitro singlestrandDNA canbeusedastemplateforDNAsequencing ormakeDNAprobesforhybridization Afterenteringhostcells itisreplicatedtodoublestrandsDNAandbecomesreplicationalformDNA RFDNA whichcanbeusedascloningvector 五 病毒載體可將外源DNA帶入哺乳動(dòng)物細(xì)胞 Virusvectorsincommonuse 逆轉(zhuǎn)錄病毒 腺病毒 腺相關(guān)病毒 EB病毒等病毒載體 可將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞 Characters 多數(shù)均已質(zhì)?；?由病毒啟動(dòng)子 包裝元件 選擇性遺傳標(biāo)記及pBR322復(fù)制起始點(diǎn)組成 Othervectors YAC yeastartificialchromosome 0 5 2Mb BAC bacterialartificialchromosome 0 4Mb 二 表達(dá)載體將外源基因帶入宿主并表達(dá) ExpressionvectorsConcept Theconditionsforexpressionvector Withexpressionstructuresexceptforthecharactersofcloningvectors ThevectorswhichcanmaketheextraneousDNAbeexpressedinhostcellsaretermedasexpressionvectors Sorts ExpressionvectorsofEcoli prokaryote Expressionvectorsofeukaryote Expressionvectorsofmammalanimals 一 原核表達(dá)載體適于原核細(xì)胞表達(dá)外源基因 ExpressionvectorsofEcoli 除克隆所需成分外 還含有啟動(dòng)子 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 轉(zhuǎn)錄終止序列等表達(dá)元件 Trp lacpromoter ortacpromoter Inducer IPTGStrains RB791 XL 1 blue SB221 JM109 1 Promoter T7ofT7phageItisahigheffectiveexpressionpromoterStrain JM109 DE3 PLof phage temperatureinducepromoter ControlledbycIts857 sensitivetotemperature clts857為溫度敏感阻抑物Strain M5219 原核生物mRNA與核蛋白體小亞基結(jié)合的分子機(jī)制 A U UCCU C CACUAGG 核蛋白體小亞基的16S rRNA 5 AGGAPuPuUUUPuPuAUG 3 mRNA Rps辨認(rèn)序列 SD序列 Ribosome bindingsite RBSIncludingAUG SDsequence 2 核糖體結(jié)合位點(diǎn) RBS 作用 3 轉(zhuǎn)錄終止序列 保證外源基因在宿主中的高效表達(dá) 使讀碼框架能夠正確轉(zhuǎn)錄 二 真核表達(dá)載體適于真核細(xì)胞表達(dá)外源基因 Eukaryoteexpressionvectors 含有一定的原核序列 Ecoli中的ori位點(diǎn) antibacterialsite 含有一定的真核序列 真核細(xì)胞中的藥物抗性基因 真核表達(dá)組件 如真核復(fù)制起點(diǎn) 啟動(dòng)子 增強(qiáng)子 克隆位點(diǎn) 加尾信號(hào)等 ExpressionvectorsofmammalanimalIfageneneedstobeexpressedinmammalanimalcells theeukaryoteexpressionvectormustbeused Theessentialelementsincluding Replicaorigin antibioticssites eukaryotepromoter enhancer cloningsites terminationsignal polyAsignal 第三節(jié)基因克隆過(guò)程包括五個(gè)基本部分 Genecloningprocess 1 制備目的基因及相關(guān)載體 2 將目的基因與載體進(jìn)行連接 3 將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞 4 DNA重組體的篩選與鑒定 5 DNA重組體擴(kuò)增 表達(dá)及其他研究 分 切 接 篩 轉(zhuǎn) 一 采用不同方法獲取目的基因 Methodstogetatargetgene 1 Topreparegenomiclibrary 2 TopreparecDNAlibraryorcDNA 3 ToPCR 4 TosynthesizetheDNAfragmentbychemicalmethod 一 從基因組文庫(kù)中獲得目的基因 Genomiclibrary 指含有一個(gè)機(jī)體基因組DNA的全套重組DNA分子的克隆群體 用于構(gòu)建基因組文庫(kù)的載體 噬菌體 phage 粘性質(zhì)粒 cosmid Genomiclibraryconstruction 分離高分子量DNA 分離回收15 25kb的DNA片段 部分消化 以切成一定大小片段 回收片段與適當(dāng)載體連接 所有重組DNA分子轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞并擴(kuò)增 基因組文庫(kù) 隨機(jī)文庫(kù)克隆數(shù)目計(jì)算 隨機(jī)文庫(kù)指代表基因組各部分DNA的摩爾數(shù)相等 對(duì)于隨機(jī)文庫(kù) 有 N 克隆數(shù)目 P 設(shè)定的概率值 如 0 99 x 插入片段平均大小 15 20kb y 植物基因組大小 以kb計(jì) 如果插入片段平均大小為20kb 某植物基因組大小為4x108bp P 0 99時(shí) 根據(jù)上式 N 1X105 含1X105個(gè)克隆的基因文庫(kù)相當(dāng)覆蓋了5倍的基因組 在片段隨機(jī)分布時(shí) 從文庫(kù)中找到任一序列的概率不低于0 99 植物基因組大小及克隆文庫(kù)所需噬菌斑數(shù) 植物種類基因組大小 bp a重組噬菌斑數(shù)b 擬南芥7 7X1072 1X104 大豆8 7X1082 4X105 菜豆1 8X1094 9X105 碧?hào)|茄1 9X1095 1X105 煙草3 8X1091 0X106 玉米3 9X1091 1X106 小麥1 5X10104 1X106 a 基因組大小引自Rogers和Bendich b 假設(shè)插入片段為17kb 概率為0 99 二 從cDNA文庫(kù)中獲得目的基因 cDNAlibrary 指含有一個(gè)機(jī)體某種特定細(xì)胞或特定狀態(tài)下表達(dá)基因的全部cDNA克隆的群體 cDNAlibrarycharacters 不含內(nèi)含子 用mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建 cDNAlibraryvectors gt10 gt11 Ziploxetal cDNAlibraryconstruction 分離mRNA RNaseH水解去掉mRNA 以oligo dT 為引物 合成cDNA第一鏈 隨機(jī)引物 DNApolI合成第二鏈 修齊兩端 加人工接頭 與載體連接 得到cDNA重組體 所有cDNA重組體均轉(zhuǎn)入宿主擴(kuò)增 cDNA文庫(kù) 三 利用PCR技術(shù)獲得目的基因 采用T載體 AT克隆 pGEM Tvector pMD18 TVector 合成長(zhǎng)度有限 可人工設(shè)計(jì)相應(yīng)的序列 不必使用天然模板 四 人工合成目的基因 Plasmid phagecosmidM13phage Capacity 10kb 22kb40 50kb 1kbofcloninggDNAlibrary cDNAlibrary Subcloning Sequencing Ecoliexpression 二 依據(jù)基因克隆的目的選擇和準(zhǔn)備載體 Cloningvectorsincommonuse 1 TheligationbycohesiveendsAdvantage easilylinkedDisadvantage easilytobecycledselfbidirectioninsertion 2 Theligationwithartificiallinker 3 Theligationwithhomopolymerictail 4 TheligationbybluntendsHighATPcon T4DNAligaseshouldbeused 三 選擇適當(dāng)?shù)牟呗詫NA片段進(jìn)行連接 Methodsincommonuse 一 粘性末端的連接 全同源粘性末端最方便 但載體自身環(huán)化 并為雙向插入 例 用EcoRI分別切割載體和目的DNA 切割載體 切割目的DNA 雙向插入示意圖 粘性末端的連接 二 用人工接頭法克隆cDNA 連接酶 堿性磷酸酶 三 同聚物接尾法克隆雙鏈DNA 轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗?退火 載體 一 轉(zhuǎn)化 transformation 四 重組DNA需要導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增 Methodsincommonuse 二 感染 infection 三 轉(zhuǎn)染 transfection 四 電穿孔 electroporation 一 轉(zhuǎn)化是直接將DNA導(dǎo)入細(xì)菌的方法 Transformation 指將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主菌 并使其獲得新的表型的過(guò)程 宿主菌 Ecoli 感受態(tài)細(xì)胞的制備 低溫CaCl2處理 使細(xì)胞通透性增加 易于攝取外源DNA 這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞 competentcell 二 感染是利用噬菌體將外源DNA導(dǎo)入宿主 Infection 指 噬菌體 粘性質(zhì)粒或真核細(xì)胞病毒為載體的重組DNA分子 在體外經(jīng)過(guò)包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒 然后感染適當(dāng)宿主細(xì)胞的過(guò)程 用于包裝的宿主菌 琥珀突變株Dam溶菌物 含頭部蛋白 突變株Eam溶菌物 含尾部蛋白 Dam溶菌物 Eam溶菌物 DNA重組體 包裝噬菌體 重組有外源DNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 感染 輔助病毒 2細(xì)胞 包裝成病毒顆粒有感染能力 三 轉(zhuǎn)染是將外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的方法 Transfection 指真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過(guò)程 Methods 電穿孔 磷酸鈣共沉淀法 脂質(zhì)體融合法 進(jìn)入細(xì)胞的DNA存在方式 染色體外 整合至宿主基因組中 一 遺傳學(xué)方法 五 重組DNA導(dǎo)入宿主后篩選與鑒定 Methodsincommonuse 二 免疫學(xué)方法 檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物 三 核酸雜交 四 PCR技術(shù) 抗性標(biāo)記 表型標(biāo)記 插入失活 互補(bǔ) 五 酶切鑒定 Goto23 Goto103 Goto104 Goto105 第四節(jié)真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染 Transfection 指真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過(guò)程 一 真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法與基本原理 二 轉(zhuǎn)染細(xì)胞可利用抗性標(biāo)記進(jìn)行篩選 一 磷酸鈣共沉淀示介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染 一 真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法與基本原理 Methodsincommonuse 二 電穿孔法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染 electroporation 三 DEAE 葡聚糖法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染 DEAE dextran 四 脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染 liposome 五 顯微注射法 microinjection Calciumphosphateco precipitation 1 Electroporation 電穿孔法 ExtraneousDNA Hostcells Electricitywithhighfrequency 一 利用TK 細(xì)胞突變株進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選 二 轉(zhuǎn)染細(xì)胞可利用抗性標(biāo)記進(jìn)行篩選 Methodsincommonuse 二 藥物篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選 一 利用TK 細(xì)胞突變株進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選 Principle TK thymidinekinase 是催化核苷酸補(bǔ)救合成的關(guān)鍵酶 氨基喋呤 aminopterin A 是從頭合成途徑的抑制劑 A的加入使細(xì)胞主要依賴于補(bǔ)救合成 TK 選擇系統(tǒng) Host TK 細(xì)胞株 TK表達(dá)缺陷 培養(yǎng)基 HAT培養(yǎng)基 H hypoxanthine A aminopterin T thymine Tk 氨基蝶呤 A 處理 抑制二氫葉酸還原酶 四氫葉酸逐漸耗盡 dUMP dATPdCTP H dATPdCTP T dTTP Tk 培養(yǎng)基含H T A 細(xì)胞不能存活 細(xì)胞能夠存活 補(bǔ)救合成 tk基因?qū)雝k 細(xì)胞 細(xì)胞能夠存活 在含HAT培養(yǎng)基中 tk選擇系統(tǒng)原理圖解 越過(guò)A的抑制 Thescreeningwithantibiotics G418 geneticin 新霉素衍生物 二 藥物篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞 Themostusedantibioticmarker neor 新霉素抗性選擇系統(tǒng) 新霉素 干擾原核生物蛋白合成 不影響真核生物蛋白合成 新霉素類似物G418 干擾原核生物蛋白合成 干擾真核生物蛋白合成 細(xì)菌新霉素抗性基因neor 表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 APH 使G418失活 表達(dá)neor的細(xì)胞可在含G418的培養(yǎng)基中存活 第五節(jié)利用重組DNA技術(shù)進(jìn)行基因改造 Methodsincommonuse 定點(diǎn)誘變技術(shù) 寡核苷酸介導(dǎo)定點(diǎn)誘變技術(shù) PCR介導(dǎo)定點(diǎn)誘變技術(shù) 目的 改變基因的一級(jí)序列特征 一 對(duì)特定基因可進(jìn)行定點(diǎn)誘變 Whatisthesite directedmutagenesis 目的基因的定點(diǎn)誘變 Itmeanstheprocessthattheoneormoresitesofgenebereplacedordeletedbyartificialmethod 一 帶突變位點(diǎn)的寡核苷酸可介導(dǎo)定點(diǎn)誘變 Thesite directedmutagenesismediatedbyoligonucleotide Characters Itcancausefinelythemutagenesisatthespecialsiteaccordingtothedesignofresearchers Processes 1 TheuseofKlenowfragmentandaprimerwithanincorrectpairedbase M13assinglestrandtemplate 2 ToextendtheprimertogetaheterozygousdoublestrandsDNA 3 TotransformtheheterozygousDNAintoEcoli thewildDNAandmutatedDNAwillbeyielded 4 ToscreenanddecidethemutatedDNA furtherresearchthemutatedDNA 誘變寡核苷酸引物 單鏈M13模板 Klenowfragment dNTP T4DNApol 雜交雙鏈DNA 轉(zhuǎn)化Ecoli 瓊脂平皿 標(biāo)記誘變寡核苷酸原位分子雜交放射自顯影 寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變基本實(shí)驗(yàn)步驟 理論上最高誘變效率只有50 二 含U模板可以提高寡核苷介導(dǎo)定點(diǎn)誘變效率 Principle 建立含U單鏈模板 U取代T 正鏈 合成雜合雙鏈DNA 雜合雙鏈DNA轉(zhuǎn)化野生型Ecoli中 尿嘧啶核苷酶降解含U的正鏈 帶誘變位點(diǎn)的負(fù)鏈能保存 合成雙鏈DNA 突變體突變率90 誘變寡核苷酸引物 Klenowfragment dNTP T4DNApol 轉(zhuǎn)化野生型Ecoli 含尿嘧啶核苷酶 可降解含U模板 標(biāo)記誘變寡核苷酸原位分子雜交放射自顯影 U模板介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變基本實(shí)驗(yàn)步驟 含突變體的負(fù)鏈保存下來(lái)并進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增 篩選鑒定 突變率90 三 PCR技術(shù)適合進(jìn)行基因的定點(diǎn)誘變 Principle 兩對(duì)引物 三次PCR 一對(duì)常規(guī)引物a d 一對(duì)帶誘變點(diǎn)的引物b c a b及d c分別擴(kuò)增出兩個(gè)帶突變點(diǎn)的片段 上述兩個(gè)片段等量混合 變性 退火 用KlenowDNA聚合酶補(bǔ)齊 利用a d引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增 即得所需片段 5 5 3 3 a b c d 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 5 5 3 3 a d 5 3 5 3 PCR1 PCR2 變性 退火 Klenowfragment dNTP PCR3 圖8 8PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變法 二 利用基因定點(diǎn)誘變技術(shù)改造基因工程蛋白 目的 使工業(yè)酶具有更好的理化特性便于應(yīng)用 使臨床生物蛋白或多肽制劑療效高副作用小 獲得更多對(duì)人類有益的蛋白或多肽產(chǎn)物 Forexample Insulin GeneengineeringInsulin 1 定點(diǎn)誘變制備長(zhǎng)效Insulin 半衰期延至35 3h 2 定點(diǎn)誘變制備快速吸收Insulin 減少六聚體形成 3 定點(diǎn)誘變?cè)黾覫nsulin與受體的親和力 B27Thr Arg C端氨基化 A21Asn Gly B10His Asp 體外活性較野生型提高5倍 第六節(jié)克隆基因在適當(dāng)宿主細(xì)胞的表達(dá) Expressionsystems Expressionvectors Appropriatehostcells Aim Togetalotofproteinsorpolypeptides Theexpressionsystemsincommonuse Ecoliexpressionsystem Mammalanimalexpressionsystem Insectexpressionsystem Yeastexpressionsystem 一 大腸桿菌 Ecoli 表達(dá)系統(tǒng) Characters 目標(biāo)基因表達(dá)水平高 遺傳背景清楚 易于培養(yǎng) 培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單 生長(zhǎng)快 培養(yǎng)周期短 抗污染能力強(qiáng) 成本低 一 表達(dá)外源基因需要一些基本要素 1 來(lái)自真核細(xì)胞的基因需要適當(dāng)改選 2 必須選用Ecolivectors 3 目的基因與載體可用不同方式連接 4 選擇適當(dāng)?shù)氖荏w菌和誘導(dǎo)條件 表達(dá)非融合蛋白 表達(dá)融合蛋白 Ifthetargetgenecomefromeukaryote itshouldbecDNA Why 1 來(lái)自真核細(xì)胞的基因需要適當(dāng)改選 Thesignalpeptideofsecretaryproteinhastobedeletedtoo The5 endsequencebeforeATGoncDNAisuseless soithastobedeleted ThevectorsmustbeEcoliexpressionvectors whichcontainthepromoters PL tac T7 recognizedbyDDRPinEcoliandSDsequence Why 2 必須選用Ecolivectors Promoters Effectivelyinducetranscription轉(zhuǎn)錄效應(yīng)強(qiáng) Canbecontrolledeasily能被有效控制 5 3 SD Targetgene a Toexpressthenon fusionproteinsUseNdeI CATATG orNcoI CCATGG tobringinATG SD Targetgene Fragmentofstructuregeneofprokaryote 3 目的基因與載體可用不同方式連接 Themodelsoflinkage b Toexpressthefusionproteins Fusionprotein N Thepeptideoftargetgene peptideofprokaryote C ItmeansthatthepeptideexpressedconsistsofN endofpeptidecodedbyprokaryoteDNAandC endofpeptidecodedbythecloningfragmentofeukaryoteDNA whichistermedasfusionprotein Theadvantagesoffusionprotein a Morestable b Withthesignalpeptide thesecretaryproductcouldbeyielded c Itcanbepurifiedbyaffinitychromatography d Thepeptideofprokaryotecanbecutoutbyproteinase andthenthepeptideofeukaryotecanbereleasedinnaturalform 二 采用適當(dāng)措施可提高外源基因表達(dá)水平 1 多種策略提高翻譯水平 2 將細(xì)菌生長(zhǎng)與外源基因表達(dá)在時(shí)間上分開(kāi) 3 采用不同措施提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性 表達(dá)融合蛋白 采用突變菌株 表達(dá)分泌蛋白 調(diào)整SD與ATG之間距離 增加mRNA穩(wěn)定性 點(diǎn)突變改變堿基 二 哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng) Characters EukaryoteexpressionsystemsareneededThegenetobeexpressedcancomefromgenomeDNAorcDNAWhy Howcanthevectorsbetransformedintohostcells Plasmidvectors Calciumphosphateco precipitation Electroporation DEAE Dextran Microinjection MaketheextraneousDNAintocellsmediatedbyliposome Virusvectors Thevirusvectorshavetobeintroducedintowrapcells thenthepseudo virusparticleswouldbeproducedandusedtoinfectthehostcells Thescreeningmarkers Antibioticsgenes neor codetheaminosaccharidephosphatetransportase makeG418lostactivity Advantages Theexpressionproductshavescarcelyeffectonhostcells andnoteasilybedegraded 1 Insectexpressionsystem1 Drosophilamelanogaster Fruitfly expressionsystem DES 果蠅表達(dá)系統(tǒng) 2 Bacilliformvirusexpressionsystem 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) 三 其他真核表達(dá)系統(tǒng) 2 Microzyme yeast expressionsystem 啤酒酵母 Saccharomycescerevisiae Goto101 第七節(jié)電子克隆輔助基因克隆 Insilicocloning 通過(guò)對(duì)基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列搜索 對(duì)比分析 拼接整合 預(yù)測(cè)新的 假定的全長(zhǎng)基因 然后通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法 加以證實(shí) 并從相應(yīng)組織 細(xì)胞中獲得這種基因 稱為電子克隆Insilicocloning Note Insilicoisnottherealgenecloning Summary Thebasicelementsforgenecloning Thebasicprocessforgenecloning Thegenesite directedmutagenesis Thegeneexpre