酶及蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)研究進(jìn)展.doc

酶及蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)研究進(jìn)展10食工一班 20100803127 徐金全摘 要：蛋白質(zhì)的分離純化技術(shù)是實現(xiàn)酶和蛋白質(zhì)研究及產(chǎn)品工業(yè)化的關(guān)鍵技術(shù)之一。該研究就適用于酶和蛋白質(zhì)分離純化的各項技術(shù)的原理、分類和特點進(jìn)行了簡要的闡述，并對各分離技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展和應(yīng)用中應(yīng)注意問題進(jìn)行了重點綜述。關(guān)鍵詞：酶; 蛋白質(zhì); 分離; 純化; 應(yīng)用進(jìn)展Enzyme and Protein Peparation and Purification Technology Research Progress(Xuzhou Institute of Technology 20100803127 xujinquan)Abstract: protein separation and purification techniques is one of the key technology to realize the enzyme and protein research and product of industrialization. The principle, classification and characteristics of the study for the technology to the enzyme and protein separation and purification are briefly described, and the progress and application of each separation technology should pay attention to some key problems are reviewed.Keywords: enzyme; protein; separation; purification; application 生命體在代謝過程中會產(chǎn)生酶，幾乎所有生命體的化學(xué)反應(yīng)都是在酶的參與下進(jìn)行的。酶具有專一性強，催化效率高和反應(yīng)條件溫和等著多優(yōu)點，其已經(jīng)成功的應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥、能源、環(huán)保和科研等領(lǐng)域。酶的提取和純化，不僅是生產(chǎn)的需要也是酶學(xué)研究中必不可少的過程。除了核酶以外幾乎所有的酶其化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)，因此酶的分離純化過程實質(zhì)就是對目標(biāo)蛋白質(zhì)和雜蛋白的分離純化過程，只是更加關(guān)注酶的穩(wěn)定性而已。與其他物質(zhì)的分離純化過程相同，要想實現(xiàn)對蛋白與雜質(zhì)成分的成功分離，首先應(yīng)充分了解蛋白質(zhì)和雜質(zhì)的理化性質(zhì)，尤其是目標(biāo)蛋白的性質(zhì)，比如組成成分(元素和基團)、溶解性(親水還是疏水)、分子大小、等電點(在不同pH下的解離狀態(tài))以及穩(wěn)定性等基本性質(zhì)，之后才能選擇恰當(dāng)?shù)姆蛛x方法，產(chǎn)生預(yù)想的效果?？偟膩碚f酶分離純化過程大致包括3個階段: 酶釋放和粗分離過程、進(jìn)一步提取提純過程和最后的精致純化過程。該研究就近幾年酶及蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。1 細(xì)胞的破碎 酶存在于生物的體液和細(xì)胞之內(nèi)，其中大多數(shù)包含在細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞破碎的主要目的是破壞細(xì)胞壁或者膜結(jié)構(gòu)，從而提取胞內(nèi)的酶。但是由于不同的生物體或者同一生物體不同的組織細(xì)胞，其各自的細(xì)胞壁和膜的結(jié)構(gòu)組成及穩(wěn)定性差異較大，故所采用的細(xì)胞破碎方法和處理條件也會有所不同，需要根據(jù)具體情況而定，以便使試驗達(dá)到預(yù)想的效果。細(xì)胞破碎方法歸納起來可分為機械、化學(xué)、物理和生物破碎法4種。通常情況下是將幾種方法聯(lián)合使用。機械破碎法主要包括機械葉片破碎法和研磨法，其中研磨法較葉片破碎法的破碎程度高，若想進(jìn)一步破碎可采用勻漿器進(jìn)行，勻漿法1-2通常用來破碎那些易于分散，比較柔軟，顆粒較小的物質(zhì); 物理破碎法的作用原理是通過外力改變溫度和壓力條件等實現(xiàn)細(xì)胞破碎，其中超聲波提取法正成為酶和蛋白質(zhì)提取研究的熱點3-4，但由于超聲空穴效應(yīng)產(chǎn)生的壓力與蛋白質(zhì)的變性壓力存在重疊，因此采用超聲破碎酶和蛋白質(zhì)時需考慮蛋白質(zhì)的變性壓力; 化學(xué)破碎法是通過各種化學(xué)試劑與生物膜的作用使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變，從而破碎細(xì)胞，其中應(yīng)用最多的是有機溶劑5和表面活性劑，但有時利用非離子表面活性劑，其穩(wěn)定性較好6; 生物破碎法主要是指加入能夠水解細(xì)胞壁成分的酶或者打破細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)條件使細(xì)胞自溶解體的方法。2 離心過濾與膜分離技術(shù) 當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過破碎以后，通常采用離心的方法將較大的細(xì)胞碎片與目標(biāo)蛋白質(zhì)分離，對于沉降系數(shù)較為接近的物質(zhì)一般采用密度梯度離心法，若需要，離心后可采用合適的過濾介質(zhì)進(jìn)一步分離目標(biāo)產(chǎn)物和雜質(zhì)。根據(jù)過濾介質(zhì)孔徑的大小可將過濾分成微濾、超濾7、納濾8和反滲透。膜技術(shù)是過濾分離的一種，膜由丙烯晴、醋酸纖維素和硝酸纖維素等高分子物質(zhì)制成，與其他過濾介質(zhì)不同的是它具有的一定的韌性，承壓范圍較大，并且在膜上可以結(jié)合不同的基團而具有額外的選擇性，例如離子交換膜可以吸引異性帶電基團而使其易于透過，對于同性帶電基團起到排斥作用。在酶的分離純化中經(jīng)常會使用透析袋除去緩沖介質(zhì)或者鹽類，而使蛋白質(zhì)得到純化。1981年Hedda等提出的親和膜過濾法已經(jīng)用于酶的純化; Krause 等9在從大腦桿菌培養(yǎng)液中純化蘋果酸脫氫酶的研究中指出，經(jīng)3次親和膜操作，蘋果酸脫氫酶的純化比可達(dá)到200倍，回收率超過90%，其可以作為精制純化產(chǎn)品應(yīng)用。3 萃取技術(shù)和沉淀分離 大多數(shù)的酶均能溶于水，可用水、稀酸、稀堿或稀鹽溶液提取; 對于與脂結(jié)合的或者含較多非極性基團的酶可采用有機溶劑提取。為了提高酶的提取率并防止酶的失活，在提取的過程中除了要注意控制好溫度和pH 之外，必要時還需加入蛋白酶抑制劑或者抗氧化劑等。雙水相萃取10和反膠團萃取技術(shù)11-13由于對于活性物質(zhì)具有保護作用正越來越多的應(yīng)用于酶的提取純化中。王旭等14對PEG(聚乙二醇)/( NH4)2SO4雙水相提取果膠酶進(jìn)行了研究，考察了PEG分子量、pH、成相物質(zhì)濃度、NaCl 濃度以及溫度等因素對果膠酶分配系數(shù)的影響，結(jié)果表明在最佳提取條件下果膠酶分配系數(shù)可達(dá)到14.0。Sunil Kumar等15首次采用親和反膠束萃取分離技術(shù)(ARMES)對菠蘿中的菠蘿蛋白酶進(jìn)行了分離和純化，發(fā)現(xiàn)ARMES在提取效率和選擇性上均高于常規(guī)反膠束萃取法。沉淀法對蛋白質(zhì)的分離純化恰好是萃取技術(shù)的逆向應(yīng)用，其首先是改變條件使目標(biāo)蛋白在溶液中失去溶解性而沉淀下來，再通過過濾使目標(biāo)蛋白得到分離，例如鹽析法16-17、有機溶劑沉淀法5、等電點沉淀法和沉淀劑沉淀法，前3種方法主要是通過影響蛋白質(zhì)分子間電荷的排斥作用和水化層來改變蛋白溶解度獲得蛋白沉淀的; 沉淀劑法是基于沉淀劑與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物而使蛋白沉淀的，常用的沉淀劑有單寧和聚丙烯酰胺等。由于有機溶劑容易使酶失活，所以應(yīng)根據(jù)試驗實際情況選用，且應(yīng)在蛋白沉淀后將其快速分離，同時盡量保持在低溫下操作。4 層析法 層析分離是基于固定相對流動相中各個成分的阻滯能力的差別進(jìn)行分離的，根據(jù)不同的分配機理可將其分為吸附層析、離子交換層析、凝膠過濾層析和親和層析等。層析法通常用在酶和蛋白質(zhì)分離純化的精細(xì)階段，經(jīng)過一種或者幾種方法的聯(lián)合使用一般就能得到電泳效果單一的純物質(zhì)。吸附層析吸附層析利用吸附劑對不同物質(zhì)吸附能力的不同而實現(xiàn)物質(zhì)的分離純化。其是一種應(yīng)用最早且至今仍在使用的純化技術(shù)，在對傳統(tǒng)的硅藻土、氧化鋁、羥基磷石灰和活性碳等吸附劑進(jìn)行了大量的研究之后，目前對于吸附層析的研究主要集中在對上述幾種吸附劑的改性以及新型高分子吸附劑的開發(fā)上，但該技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化上的應(yīng)用進(jìn)展緩慢。吸附層析具有要求的設(shè)備簡單，吸附劑來源豐富、價格低廉，操作方法靈活等優(yōu)點，其缺點是選擇性差、分辨率較低。上述吸附劑一般在低pH和低離子強度下對酶有較強的吸附作用，洗脫時通過可提高pH或離子強度來實現(xiàn)物質(zhì)分離，例如枯草桿菌淀粉酶在弱酸性條件下，可吸附在氧化鋁上，試驗中可用pH89的Na3PO4溶液洗脫純化該酶。程云輝等研究證實DA201C大孔吸附樹脂能選擇性吸附麥胚蛋白酶解物中的疏水肽段，使抗氧化肽得到分離富集。凝膠過濾層析凝膠過濾層析又稱分子篩層析或分子排阻層析，它是以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔高分子聚合物為固定相，利用組分中物質(zhì)分子量的不同進(jìn)行分離純化的技術(shù)。大分子的物質(zhì)難于進(jìn)入微孔只能在流動相的帶動下通過間隙快速流出，而小分子的物質(zhì)則在微孔內(nèi)外進(jìn)進(jìn)出出慢速流出，這樣蛋白液的各個組分便按分子量由大到小的順序流出柱體。常用的凝膠種類有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠，若將這些膠體掛載上不同的基團，它們就可發(fā)展成離子交換和親和層析的固定相。凝膠過濾層析技術(shù)是在20世紀(jì)五、六十年代才發(fā)展起來的快速簡便的分離技術(shù)，除了在機理上具有獨特性之外，該技術(shù)不需像離子交換層析法那樣進(jìn)行再生處理實現(xiàn)反復(fù)使用，該技術(shù)已經(jīng)廣泛用于酶的分離純化。Yapi AssoiYapi D等采用離子交換、凝膠過濾和疏水作用色譜法從一種象鼻蟲中分離出了一種特異性的葡萄糖苷酶并對其性質(zhì)進(jìn)行了研究。馬曉軒等利用批量離子交換層析和凝膠過濾層析相結(jié)合的方法對類人膠原蛋白進(jìn)行分離純化，可使目標(biāo)蛋白的最終純度達(dá)到982%。離子交換層析離子交換層析法和凝膠過濾層析法都是蛋白質(zhì)純化的最常用方法。離子交換劑是由不溶性的高分子母體上引入可解離的基團制成的。按引入基團的交換電性不同分成陽離子交換劑和陰離子交換劑; 按母體的不同可分為離子交換樹脂、離子交換纖維素和離子交換凝膠。交換樹脂主要用于分子量較小的物質(zhì)的分離，只有某些大孔徑的樹脂才可用于酶的分離。交換纖維素和交換凝膠都是目前蛋白質(zhì)分離研究中廣泛應(yīng)用的交換劑，兩者交換容量大，常用的有DEAE纖維素、CMC纖維素、DEAE葡聚糖凝膠、DEAE聚丙烯酰胺凝膠、SE(磺酸乙基)葡聚糖凝膠以及SP(磺酸丙基)葡聚糖凝膠等等。在應(yīng)用時應(yīng)當(dāng)注意離子交換纖維素在劑型上也有所差別，微粒型一般有優(yōu)于纖維素型;同時交換凝膠具有離子交換和分子篩的雙重作用，交換容量相應(yīng)更大些。離子交換的分離機理大致如下: 由于不同的蛋白質(zhì)在同一pH 下會帶上不同性質(zhì)(正負(fù))或帶上不同電量的電荷，試驗中可通過選擇合適的pH 條件，使目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)帶上不同性質(zhì)的電荷而與離子交換劑進(jìn)行相互作用，從而或保留或流出柱體; 對于與目標(biāo)蛋白帶電性質(zhì)相同但電量不同的物質(zhì)可采用不同濃度的鹽溶液洗脫進(jìn)一步分離。胡鵬等采用DEAESepharoseFF離子交換層析法，對牛背最長肌中鈣激活酶進(jìn)行了分離純化，并確定了最佳分離條件。羅磊等等對DEAE 纖維素52(簡稱DE52)分離豬血清蛋白進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示pH7.4時，以00.13mol/L的NaCl磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，可將血清蛋白分為7個部分。親和層析親和層析是利用生物分子對之間所具有的專一性和可逆性進(jìn)行純化分離的技術(shù)。成對互配的分子對，例如酶與底物、酶與輔酶，研究中可將任何一方作為固定相的配基偶聯(lián)于不容性母體上，而對流動相中的對應(yīng)分子進(jìn)行分離。但是對于小分子的配基，由于空間位阻的作用使其難于與被分離物配對，因此需要在母體和配體之間加入一段連接臂，該過程稱為母體的活化，現(xiàn)在已有活化后的母體商品出售。親和層析是一種極具潛力的分離方法，盡管出現(xiàn)的較晚，但是由于其對蛋白活性保持和分離特異性極高，已經(jīng)成為研究的熱點領(lǐng)域。張正竹等以化學(xué)合成的葡萄糖苷酶的抑制劑葡萄糖脒為配體，合成了一種葡萄糖苷酶的親和層析樹脂。該樹脂在弱酸條件下非常穩(wěn)定，能選擇性地吸附葡萄糖苷酶，并且能多次重復(fù)使用。張正竹等利用這種親和層析樹脂，從數(shù)百種茶樹葉片中成功的純化出2種分子量分別為63和75kDa的葡萄糖苷酶單體酶。自從1975年P(guān)orath等提出固定金屬離子親和色譜(IMAC)的概念以來，這項技術(shù)在蛋白質(zhì)的分離純化中得到廣泛應(yīng)用。王曉軍等研究了利用固相金屬親和層析純化重組類人膠原蛋白的洗脫方法，最終確定了最佳洗脫條件，其試驗結(jié)果為重組類人膠原蛋白的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)莫定了一定基礎(chǔ)。5 電泳分離 帶電粒子在電場中向本身電荷性質(zhì)相反的電極移動的過程稱為電泳。電泳法按支持體的不同，可分為紙電泳、薄層電泳、凝膠電泳和等電聚焦電泳等。其中后2種方法的應(yīng)用最為廣泛，主要用于物質(zhì)純度的鑒別以及分子量或等電點的確定，當(dāng)然也可作為分辨率很高的分離方法。由于電泳法的進(jìn)樣量少，一般更多的作為一種分離分析方法。SDS-凝膠電泳和等電聚焦電泳是最常用到的典型方法并存在許多改進(jìn)應(yīng)用。孫鵬等通過比較常規(guī)SDS-PAGE、(Tricine) SDSPAGE、含尿素的多肽SDS-PAGE3種方法對小分子大豆肽的電泳分離結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在大小為10ku(1.661023kg)以下的小肽分離中，含尿素的多肽SDS-PAGE 效果最好。近幾年來，毛細(xì)管等電聚焦在分離蛋白質(zhì)和多肽等方面顯示出十分廣泛的應(yīng)用，謝瑤等通過化學(xué)鍵合法建立固定化pH梯度的方法，用于毛細(xì)管等電聚焦分離蛋白質(zhì)，該方法避免了自由溶液聚焦時兩性電解質(zhì)所帶來的影響，實現(xiàn)了高靈敏度及檢測波長自由選擇，并在對牛血清白蛋白和血紅蛋白混合物的分離應(yīng)用中的取得了較理想的效果。6 結(jié)語 酶和蛋白質(zhì)的分離純化過程通常是幾種技術(shù)的綜合應(yīng)用，但每一步都需要在了解蛋白本身性質(zhì)的基礎(chǔ)上對分離技術(shù)加以選擇性的應(yīng)用。使蛋白總回收率和純度保持最大化是各分離技術(shù)在試驗和工業(yè)應(yīng)用中的基本準(zhǔn)則，因此，實現(xiàn)分離純化技術(shù)的選擇和蛋白質(zhì)性質(zhì)的研究兩者相互促進(jìn)、協(xié)調(diào)發(fā)展就是后續(xù)研究的核心問題。參考文獻(xiàn)1楊歌德，周宏博，姜玉梅 凝膠過濾層析純化乳酸脫氫酶同工酶J 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2003，37(1):83 842胡鵬，羅欣，杜方嶺 DEAE Sepharose FF 離子交換層析對牛背最長肌中鈣激活酶的純化研究J 農(nóng)產(chǎn)品加工:創(chuàng)新版，2009(10):43 453王俊杰，饒志明，沈微 超聲波萃取煙葉中3 磷酸甘油脫氫酶的研究J 中國生物工程雜志，2008，28(8):74 774郭宇星，潘道東 超聲波破碎法提取瑞士乳桿菌氨肽酶條件的優(yōu)化J 食品科學(xué)，2008，29(8):140 1435時曉明，郭秀麗 一種新型提取SOD 的方法串聯(lián)凝膠過濾層析法J 藥物分析雜志，2010，30(7):1254 12576王康 超聲對胃蛋白酶，胰蛋白酶，過氧化氫酶作用的研究J 中國生物工程雜志，2006，26(5):81 837劉蕾，勇強，余世袁 木聚糖酶的超濾純化方法研究J 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(11):5837 58408張樹利，滕國新，曹萬旭 納濾技術(shù)脫鹽和濃縮乳清的研究J 中國乳品工業(yè)，2009，37(8):15 179KRAUSE S，KRONER K H，DECKWER W D Comparison of affinity membranes and conventional affinity matrices with regard to protein purificationJ Biotechnology Techniques，1991(5):199 20410房耀維，劉姝，呂明生，等 雙水相萃取法分離低溫 淀粉酶的研究J 食品科學(xué)，2009，30(18):159 16211CHAIWUT P，RAWDKUEN S，BANJAKUL S Extraction of protease from Calotropioprocera latex by polyethylene glycol-salts biphasic systemJProcess Bi