細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)--設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)方案--二組.doc

設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)方案 課程名稱 細(xì)胞生物學(xué) 題目名稱 DNA的原位顯示 專 業(yè) 生物科學(xué) 學(xué) 號(hào) 學(xué)生姓名 指導(dǎo)教師 時(shí) 間 邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院 說(shuō) 明 一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是培養(yǎng)學(xué)生綜合運(yùn)用所學(xué)知識(shí)與技能，初步訓(xùn)練學(xué)生獲得分析和解決實(shí)際問(wèn)題的能力的實(shí)踐性教學(xué)環(huán)節(jié)之一。通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)學(xué)生運(yùn)用所學(xué)知識(shí)設(shè)計(jì)課題的能力，為畢業(yè)論文的開(kāi)展，以及今后從事生產(chǎn)、教學(xué)、科研等相關(guān)工作打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。 二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求 1、以小組為單位，提出與專業(yè)、課程有關(guān)的課程設(shè)計(jì)題目。命題要求既有代表性，又有實(shí)際意義。2、設(shè)計(jì)應(yīng)包括以下幾個(gè)部分構(gòu)成：（1）研究的目的與意義。應(yīng)說(shuō)明此項(xiàng)研究在生產(chǎn)實(shí)踐上或?qū)δ承┘夹g(shù)進(jìn)行改革帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)與社會(huì)效益。有的課題過(guò)去曾進(jìn)行過(guò)，但缺乏研究，現(xiàn)在可以在理論上做些探討，說(shuō)明其對(duì)科學(xué)發(fā)展的意義。（2）國(guó)內(nèi)外同類研究的概況綜述。在廣泛查閱有關(guān)文獻(xiàn)后，對(duì)該類課題研究已取得的成就與尚存在的問(wèn)題進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述并提出自己對(duì)一些問(wèn)題的看法。（3）課題研究方案：包括研究?jī)?nèi)容、研究方法和技術(shù)路線。研究?jī)?nèi)容要重點(diǎn)突出；研究方法要具有科學(xué)性、先進(jìn)性；技術(shù)路線有清晰。 （4）研究的預(yù)期結(jié)果和創(chuàng)新性。3、格式要求 （1）表格內(nèi)容，字號(hào)用小4號(hào)，中文字體用宋體，英文字體、數(shù)字用Times New Roman； （2）正文字?jǐn)?shù)1500字以上。4、內(nèi)容要求（1）立題依據(jù)充分（實(shí)驗(yàn)?zāi)康拿鞔_、意義定位準(zhǔn)確，對(duì)擬解決的問(wèn)題有合理預(yù)測(cè)，對(duì)國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀闡述全面）；（2）研究方案（包括實(shí)驗(yàn)的技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程安排、具體操作過(guò)程、設(shè)立的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)和指標(biāo)的檢測(cè)手段）可操作性強(qiáng)；（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果的記錄及分析方法可行性強(qiáng)；（4）對(duì)實(shí)驗(yàn)中可能發(fā)生的問(wèn)題有正確預(yù)測(cè)并提出相應(yīng)的解決方法；（5）經(jīng)費(fèi)預(yù)算合理；（6）附有5篇以上主要參考文獻(xiàn)。 三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)題目（自擬） 一、選題依據(jù)（擬開(kāi)展研究項(xiàng)目的目的、意義）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握孚爾根反應(yīng)和Brachet反應(yīng)的原理。2、掌握孚爾根反應(yīng)和Brachet反應(yīng)顯示細(xì)胞內(nèi)DNA的方法。3、掌握實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)整理及結(jié)果分析、論文撰寫(xiě)等基本技能。實(shí)驗(yàn)意義1、了解和掌握兩類核酸顯示的原理及操作程序2、了解并掌握細(xì)胞中DNA和RNA的分布 二、研究方案（主要研究?jī)?nèi)容、研究方法和技術(shù)路線）一、研究?jī)?nèi)容 DNA的Unna顯示法所制作的裝片在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的染色結(jié)果，以及三氯乙酸的具體作用。二、研究進(jìn)展 不同染色劑染色對(duì)觀察洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂相的影響 根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果分析得知，用醋酸洋紅染色存在染色不均勻的問(wèn)題造成圖像模糊，有的細(xì)胞 染色很重，有的是細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核內(nèi)染色分辨不清楚， 從而影響觀察。而用改良品紅染色，染色體染色清晰，細(xì)胞質(zhì)不著色，背景明亮，易于分辨，但是改良品紅染色時(shí)間要遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于醋酸洋紅的時(shí)間，否則很難染色。 在用改良品紅染色與醋酸洋紅的對(duì)比的實(shí)驗(yàn)中，用改良品紅染色細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核明顯可辨別，其染色體部分染色較深，細(xì)胞質(zhì)基本不著色，但要注意的是用改良品紅染色時(shí)一定要把握好染色的時(shí)間問(wèn)題，盡量延長(zhǎng)染色的時(shí)間，否則染色淺就不容易觀察到染色體。 不同時(shí)間取材對(duì)觀察洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂相的影響 根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果分析得知，在上午 10 00 時(shí)取下的洋蔥根尖，細(xì)胞有絲分裂比較旺盛，其中前期和中期的分裂相最多。而在下午15 00 時(shí)取的洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂不如上午分裂旺盛，下午也是前、中、后期相較多，上午和下午的末期相差別不大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:植物細(xì)胞的有絲分裂活動(dòng)受生物鐘的制約，在一天的24h 里，細(xì)胞有絲分裂是有節(jié)律性的，即在白天 10 00 11 00 時(shí)最旺盛，可能在夜間22 00 23 00 時(shí)又是最旺盛的時(shí)間。所以，洋蔥根尖有絲分裂在不同的時(shí)間觀察到的分裂相是不同的。雖然是在不同的時(shí)間取下的根尖，但是有可能觀察到相同的分裂相，只是按平均數(shù)統(tǒng)計(jì)來(lái)算在不同的時(shí)間分裂相數(shù)目，這樣得出的在不同時(shí)間分裂相是不同的。 結(jié)合環(huán)保的理念更進(jìn)一步證明了采用冷藏和 常溫交替培養(yǎng)預(yù)處理方法進(jìn)行處理洋蔥根尖，是得到分裂期細(xì)胞的一個(gè)好方法，值得在教學(xué)中推廣使用。 以上探究，僅限于洋蔥根尖的分裂期的控制，還有很多問(wèn)題可以在中學(xué)生物教學(xué)中進(jìn)一步啟發(fā)學(xué)生進(jìn)行自主探究實(shí)驗(yàn)。比如是否可以采用類似 SM 營(yíng)養(yǎng)液來(lái)培養(yǎng)根尖;是否可以長(zhǎng)時(shí)間地讓洋蔥球莖處于光照15 20的環(huán)境中生長(zhǎng); 是否可以提高冷藏常溫交替培養(yǎng)預(yù)處理組的分裂期的穩(wěn)定性等等。 壓片: 染后材料水洗幾分鐘后入蒸餾水待壓片。取表面皿加45%冰醋酸后將根尖放于皿內(nèi)并夾碎進(jìn)行軟化和分色,大約1h 后可陸續(xù)壓片;取清潔載 片,上放少許軟化材料、加蓋片后用鑷子尖輕輕地向有材料的地方敲打,使之細(xì)胞分離成一薄層、再用兩鑷尖執(zhí)住蓋片材料的兩邊,用鉛筆桿或小木棒輕輕敲壓, 見(jiàn)材料細(xì)膩可鏡檢,挑選分散好,分散相多的壓片將蓋片朝下斜入50%的酒精中脫蓋片,分離后進(jìn)行脫水透明,如材料分別粘在載片上可分別進(jìn)行封藏。 洋蔥根尖作為染色體組型分析的材料與蠶豆、玉米等相比較其根尖更容易獲得, 而且洋蔥鱗基部的發(fā)根數(shù)量比較多, 呈梯次發(fā)根,可多次取材。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中用一個(gè)洋蔥經(jīng)過(guò)反復(fù)利用完成了植物染色體觀察、組型分析和分帶等三個(gè)實(shí)驗(yàn)。 經(jīng)飽和對(duì)二氯苯處理過(guò)的洋蔥根尖停留在中期分裂相較多,而兩次低滲處理可以使在固定和解離過(guò)程中因酸而凝縮的染色體膨大。我們?cè)谔幚淼倪^(guò) 程中更換低滲液可以使KCl的濃度相對(duì)保持的0.75M不發(fā)生變化,保證了低滲液的濃度。在染色過(guò) 程中用染色液壓片可使臨時(shí)裝片在觀察的過(guò)程中不會(huì)因?yàn)樵趶?qiáng)光中暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng), 著色變淡。解離可 使根尖變得酥軟易于壓片,在解離的過(guò)程中一定要保持在60,溫度過(guò)高會(huì)破壞染色體的結(jié)構(gòu),溫度太低又達(dá)不到解離的效果。關(guān)于解離時(shí)間以8 m in左右為宜,根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)解離的根中能夠看到氣泡說(shuō)明解離完全, 這時(shí)應(yīng)該停止解離進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。 1王 輝，石延茂，李雙鈴，等 2008 不同預(yù)處理對(duì)花生根尖細(xì)胞 有絲分裂制片的影響 花生學(xué)報(bào)， 37( 2) :28 31 2楊 潔，柳 紅 1999 洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂高峰期的研究 遼 寧師專學(xué)報(bào)， 2( 2) :26 29 3徐偉平 2001 根尖細(xì)胞有絲分裂裝片制作新見(jiàn)解 生物學(xué)教學(xué)， 26( 6) :15 17 4 高汝勇 低溫預(yù)處理對(duì)大蒜根尖細(xì)胞有絲分裂的影響 農(nóng)業(yè)科 技與設(shè)備，2009( 1) 5趙東利等 秋水仙素對(duì)大蒜根尖細(xì)胞有絲分裂的影響 北京農(nóng) 學(xué)院學(xué)報(bào)，2009( 1) 三、實(shí)驗(yàn)原理利用核酸分子上的磷酸根和堿性染料形成鹽鍵而在原位沉淀顯色的原理，根據(jù)DNA和RNA對(duì)堿性染料的親和力有差別，用Unna試劑（甲基綠-派洛寧染色液）進(jìn)行選擇性染色是顯示核酸的方法之一。在Unna試劑中甲基綠與空間構(gòu)型完整的DNA親和力高，并且甲基綠分子中的兩個(gè)含N基團(tuán)帶正電荷正好與DNA分子的負(fù)電基團(tuán)相結(jié)合，這樣DNA被Unna試劑中的甲基綠染成綠色或藍(lán)綠色。而RNA則被Unna試劑中的派洛寧（Pyronin G）染成紅色。三、實(shí)驗(yàn)用品 （一） 材料 洋蔥鱗莖或根尖、植物幼苗。 （二） 儀器、用具 顯微鏡、恒溫水浴箱、溫度計(jì)、解剖針、酒精燈、試管、燒杯、載玻片、蓋玻片、吸水紙，混勻器，高速冷凍離心機(jī)、移液器、液氮罐、1.5mleppendorf管、2mleppendorf管等。 （三）試劑 1、1mol/L乙酸緩沖液（pH4.8）： A液：冰乙酸6ml，加水至100ml。 B液：乙酸鈉13.5g，加水至100ml。使用時(shí)，將A液和B液按2:3比例混合。置于4冰箱中備用。2、Unna試劑：甲基綠-派洛寧染色液。 甲液：5%派洛寧水溶液6ml，2%甲基綠水溶液6ml，去離子水16ml。 乙液：1mol/L乙酸緩沖液（pH4.8）16ml。甲、乙兩液置于4冰箱中備用，使用前再將甲、乙兩液混勻待用。3、5%三氯乙酸。4、卡諾固定液：無(wú)水酒精3份:冰醋酸1份或無(wú)水乙醇6份，氯仿3份，冰醋酸1份。乙醇對(duì)樣品具有收縮作用，冰醋酸則對(duì)樣品有膨脹作用。氯仿：三氯甲烷。四、方法步驟DNA和RNA的Unna顯示法1. 取材與固定：待洋蔥根尖長(zhǎng)1cm 時(shí)，于上午8時(shí)剪下根尖，經(jīng)過(guò)預(yù)處理后投入卡諾固定液中固定2-24h。固定后，保存在70%的酒精中，放入冰箱中冷藏供用。2.水解試管1：取洋蔥根尖數(shù)條，投入試管，用清水洗3次。試管2（對(duì)照）取洋蔥根尖數(shù)條，投入試管，先用清水洗3次，再用5%三氯乙酸（TCA）浸沒(méi)根尖，放入恒溫水浴鍋中在900.5下水解15分鐘，再用清水洗5min。以下各步驟兩試管相同。（水解是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之一。重要的是溫度，應(yīng)保持在900.5之間。如果溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成水解過(guò)度，醣與醛基之間的鍵被破壞，醛基流失到水解液中，反之，不能出現(xiàn)潛在的醛基，都不能呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。） 3. 染色兩試管中均滴加Unaa染液，浸沒(méi)根尖，立即置于暗處處理0.5h，然后用水漂洗3次，丙酮分色3-20秒，再用水漂洗2次，每次2min。4. 壓片鏡檢。分別取上述兩試管中的根尖，置于載玻片上，滴加1滴45%醋酸，然后壓片鏡檢。三、預(yù)期的結(jié)果和創(chuàng)新性DNA的Unna顯示法染色的結(jié)果：DNA被甲基綠染