第五章：原生質(zhì)體培養(yǎng).ppt

CHAPTER5植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和細胞雜交 第一節(jié)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)第二節(jié)細胞融合 細胞雜交 第三節(jié)以原生質(zhì)體做受體的遺傳轉(zhuǎn)化 第一節(jié)植物原生質(zhì)體培養(yǎng) 原生質(zhì)體的概念 植物細胞原生質(zhì)體 protoplast 一詞始于Hanstein 1880 在植物學上它是指植物細胞通過質(zhì)壁分離后可以和細胞壁分開的那部分細胞物質(zhì) 原生質(zhì)體培養(yǎng)的應用 1植物育種2打破有性雜交的局限 自由雜交局限 減數(shù)分裂局限 胞質(zhì)基因局限 進行育種3遺傳轉(zhuǎn)化4避免細胞壁上核酸酶對外源基因的破壞5利用原生質(zhì)體瞬間表達系統(tǒng)6理論研究細胞起源 細胞壁再生 質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能 核質(zhì)關系 胞間作用 激素作用機理等 一植物原生質(zhì)體研究歷史與現(xiàn)狀 1 機械法分離原生質(zhì)體時期1892年由Klercker用于從質(zhì)壁分離的Stratiotesaloides細胞分離原生質(zhì)體 隨后為Chambers和Hofler 1931 將洋蔥表皮組織的薄片浸在1 0mol L蔗糖溶液中 當原生質(zhì)體收縮脫離壁時用快的刀片切開表皮細胞 獲得了少量表皮細胞的原生質(zhì)體 2 酶法制備原生質(zhì)體階段 1960年英國Nottingham大學植物學系Cocking首次用纖維素酶從番茄幼苗的根分離得到原生質(zhì)體 從此開創(chuàng)了用酶法分離植物原生質(zhì)體的時期 其后纖維素酶 半纖維素酶 果膠酶的商品化 使得實驗室制備原生質(zhì)體成為一中常規(guī)技術 二 植物原生質(zhì)體研究進展 1 分離方法的改進 商品酶的出現(xiàn) 從各類植物以及不同的器官 組織 都成功地分離到原生質(zhì)體 2 原生質(zhì)體培養(yǎng)技術日趨成熟 培養(yǎng)基 培養(yǎng)技術的改進極大地提高了培養(yǎng)的效率 現(xiàn)在常用的瓊脂糖包埋培養(yǎng) 包括瓊脂糖塊周圍加液體培養(yǎng)基的方法 液體淺層培養(yǎng) 使用條件培養(yǎng)基或飼喂培養(yǎng)等技術 以及發(fā)展出來的一些專門實用于原生質(zhì)體培養(yǎng)的培養(yǎng)基如KM8p V KM D2a等的廣泛使用 均極大改善了培養(yǎng)效率 3 性細胞原生質(zhì)體研究 花粉原生質(zhì)體 精子和生殖細胞 胚囊及其組成細胞分離成功 單個原生質(zhì)體培養(yǎng)成功 使人們可以嘗試在離體條件下對這些細胞進行操作 發(fā)展了雌雄配子的融合技術 培養(yǎng)小麥和大麥的受精卵形成的原生質(zhì)體發(fā)育形成完整植株 利用花粉四分體原生質(zhì)體與體細胞原生質(zhì)體融合獲得三倍體雜種植株等 4 原生質(zhì)體遺傳操作 利用原生質(zhì)體導入外源DNA獲得轉(zhuǎn)化植物 在多種植物中獲得成功 已由大豆 杠豆 柑橘 多種蕓薹屬植物 水稻 高粱 玉米 小麥等作物獲得轉(zhuǎn)基因植物 建立起有效的葉綠體轉(zhuǎn)化試驗系統(tǒng) 植物病毒在原生質(zhì)體中增殖系統(tǒng)等 三 植物原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng) 一 原生質(zhì)體的分離機械法酶法影響原生質(zhì)體分離質(zhì)量因素 酶的種類及其組合 酶液的滲透壓 原生質(zhì)膜的穩(wěn)定劑 酶解時間與溫度 分離與純化的方法等 1 材料的選擇 要獲得產(chǎn)量高 質(zhì)量好且容易分裂的原生質(zhì)體 就要注意用于制備原生質(zhì)體的起始材料的特性和生理狀態(tài) 茄科植物一般選擇生長旺盛 生理狀態(tài)一致的剛展開的幼嫩葉片分離原生質(zhì)體 十字花科植物 一般認為是從種子萌發(fā)4 5天的無菌苗下胚軸分離原生質(zhì)體 得率高 活力強 再生頻率高 豆科用未成熟種子胚的子葉較好 對禾本科植物 從幼胚 幼穗 花藥或成熟胚建立胚性愈傷組織及其胚性懸浮細胞系分離原生質(zhì)體有利于其后的再生 2 酶制劑 植物的細胞壁主要由纖維素 半纖維素和果膠質(zhì)構(gòu)成 一般而言 纖維素約占細胞壁干重的25 50 不等 半纖維素約占細胞壁干重的53 左右 果膠質(zhì)一般約占細胞壁的5 左右 雙子葉植物的葉片 需用纖維素酶和少量果膠酶愈傷組織細胞及其懸浮細胞除用纖維素酶外 還需用較多的果膠酶 有些材料還需加入半纖維素酶 花粉小孢子壁除含有纖維素 果膠質(zhì)外 還有胼胝質(zhì) 分解時需用蝸牛酶或胼胝質(zhì)酶 3 滲透壓的穩(wěn)定劑 酶液 洗液和培養(yǎng)液中滲透壓應和原生質(zhì)體內(nèi)的相同或接近 滲透壓略大些有利于原生質(zhì)體的穩(wěn)定 過大會使原生質(zhì)體收縮并阻礙原生質(zhì)體的啟動分裂 廣泛使用的滲透壓調(diào)節(jié)劑使甘露醇和山梨醇 蔗糖 葡萄糖和麥芽糖 其濃度約在0 4 0 6mol L 加入CaCl2 KH2PO4 葡聚糖硫酸鉀都可以提高原生質(zhì)膜的穩(wěn)定性 增加完整的原生質(zhì)體數(shù)目和活力 葡聚糖硫酸鉀是通過降低酶液中核糖核酸酶活性 而有利于原生質(zhì)膜的穩(wěn)定 4 酶解處理 酶解植物材料處理 表面滅菌 材料分割 酶的用量 植物材料應按比例和酶液混合才能有效地分離原生質(zhì)體 一般葉片 子葉切條和下胚軸切片需酶量少 而胚性愈傷組織和胚性懸浮細胞則用酶量大 滲透劑的選擇 小麥和水稻胚性懸浮細胞 用葡萄糖作滲透劑優(yōu)于甘露醇酶解條件 PH值 時間 溫度 5 原生質(zhì)體的純化 沉降法 用過濾和離心相結(jié)合的方法 漂浮法 采用較原生質(zhì)體比重大 滲透壓高的溶液 使原生質(zhì)體浮于溶液的表面的 這種方法可以收集較純的原生質(zhì)體 但原生質(zhì)體數(shù)量上損失較多 也往往因采用高滲溶液而對原生質(zhì)體有害 界面法 利用兩種比重不同的溶液 使健康和完整的原生質(zhì)體處于兩液相的界面之中 這種方法能使細胞碎片和細胞器逐漸清除 并可獲得更純凈的原生質(zhì)體 6 原生質(zhì)體的活力鑒定 1 細胞壁染色法 熒光增白劑對植物細胞壁是一種最優(yōu)越的染料 不僅可鑒定細胞壁是否完全除盡 而且可檢查原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中壁的再生 細胞壁與染料形成顯眼的綠色熒光 沒有細胞壁的則無熒光反應 略帶紅色 2 原生質(zhì)體活性鑒定 短時間內(nèi)測定活力有多種方法 如觀察胞質(zhì)環(huán)流作為旺盛代謝指標 Evans藍活性染色 測定光合活性 用氧電極法測定氧呼吸 用熒光素雙醋酸酯 FDA 等 二 原生質(zhì)體培養(yǎng) 1 培養(yǎng)基原生質(zhì)體培養(yǎng)與組織及細胞培養(yǎng)類同 原生質(zhì)體與細胞的主要差別是除去了細胞壁 所用培養(yǎng)基一般是加以改良的培養(yǎng)基 如KM8p和K8p培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基礎 NT培養(yǎng)基則以MS培養(yǎng)基為基礎 禾谷類植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)基多數(shù)是以MS Du N6 KM AA為基本培養(yǎng)基 十字花科和豆科植物則多數(shù)以B5 KM8p K8p KM為基本培養(yǎng)基 茄科植物以MS NT K3為基本培養(yǎng)基 原生質(zhì)體培養(yǎng)基中需有一定濃度的滲透壓穩(wěn)定劑 2 培養(yǎng)方法 固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)固液結(jié)合培養(yǎng)念珠培養(yǎng)看護培養(yǎng) A 固體培養(yǎng)法 平板法 將純化后懸浮在液體培養(yǎng)基中的原生質(zhì)體懸浮液與熱融并冷至45 的含瓊脂或瓊脂糖或Gelrite的培養(yǎng)基等量混合 并迅速輕輕搖動 使原生質(zhì)體均勻分布于培養(yǎng)基中 待凝結(jié)后 將容器倒置于四周墊有保濕紙或含水海綿的培養(yǎng)皿內(nèi) 封口 由于原生質(zhì)體被彼此分開并固定了位置 這種方法避免了細胞間有害代謝產(chǎn)物的影響 并便于定點觀察 有利于追蹤單個原生質(zhì)體再生細胞壁的發(fā)育過程 B 液體培養(yǎng)法 將原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基中 最常用的是液體淺層培養(yǎng)法和懸滴培養(yǎng)法 C 固液結(jié)合培養(yǎng)法 最為簡便的固液結(jié)合培養(yǎng)法為雙層培養(yǎng)法 即在培養(yǎng)皿的底部先鋪一薄層含瓊脂或瓊脂糖或Gelrite固體培養(yǎng)基 含或包含原生質(zhì)體或細胞 再在其上進行印刷體的液體淺層培養(yǎng) 這種培養(yǎng)方式有利于固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分 或細胞代謝物 可以慢慢地向液體中釋放 以補充培養(yǎng)物對營養(yǎng)的消耗 同時培養(yǎng)物所產(chǎn)生的一些有害物質(zhì) 可被固體部分吸收 對培養(yǎng)物生長更有利 念珠培養(yǎng)法 Shillito等建立了一種 念珠培養(yǎng)法 將含有原生質(zhì)體的瓊脂糖培養(yǎng)基切成塊放到大體積的液體培養(yǎng)基中 并在旋轉(zhuǎn)搖床上振蕩以利于通氣 使用大體積的液體是為了防止瓊脂糖塊過度破碎 看護培養(yǎng)法 看護培養(yǎng)法是固液雙層法的引申 將水稻或玉米懸浮細胞包埋于瓊脂或瓊脂糖的培養(yǎng)基中 在其上鋪聚脂纖維或硝酸微孔濾膜 將含水稻或玉米原生質(zhì)的液體培養(yǎng)基置于其上進行培養(yǎng) 采用看護培養(yǎng)法在水稻和玉米中 都證明看護細胞有促進原生質(zhì)體生長和細胞分裂的作用 3 培養(yǎng)條件 原生質(zhì)體培養(yǎng)前的熱激處理和超低溫處理可提高原生質(zhì)體植板率 去除細胞壁的原生質(zhì)體 在培養(yǎng)初期極其脆弱 由于光 溫 濕度等條件的不適往往會引起培養(yǎng)基成分及滲透壓的變化 影響原生質(zhì)體正常生長發(fā)育 一般對于葉肉 子葉 下胚軸等帶有葉綠體的原生質(zhì)體 在培養(yǎng)初期最好置于弱光或漫射光下 由愈傷組織和懸浮細胞脫壁的原生質(zhì)體應避免光照置于暗中培養(yǎng) 培養(yǎng)溫度一般為25 30 隨種而異 二 由原生質(zhì)體再生植株 分離的植物原生質(zhì)體在合適的培養(yǎng)條件下 可以再生形成植株 1971年首次由煙草葉肉原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株成功后 現(xiàn)通過原生質(zhì)體培養(yǎng)形成芽或胚狀體 進而再生植株的植物種類已達367種 分布于46科 160屬 成功的種最多的是茄科 隨后依次為豆科 禾本科 菊科 十字花科 傘形科和薔薇科 1 原生質(zhì)體培養(yǎng)中的再生過程 由植物原生質(zhì)體培養(yǎng)再生完整植株 經(jīng)歷了由細胞壁的再生 細胞分裂 細胞團和愈傷組織的形成以及植株再生等幾個不同的階段 2 原生質(zhì)體再生植株形成的途徑 1 器官形成途徑 1 原生質(zhì)體培養(yǎng)基 2 分化培養(yǎng)基 3 生根培養(yǎng)基 2 胚胎發(fā)生途徑 通過胚胎發(fā)生途徑再生植株的植物種類 多集中在禾本科 傘形科 蕓香科 葫蘆科和豆科中 還有裸子植物的松科 3 原生質(zhì)體再生植株的遺傳特性原生質(zhì)體再生植株往往在形態(tài)和性狀方面出現(xiàn)變異 如出現(xiàn)白化苗 玻璃苗 葉發(fā)生變異 性別 育性及發(fā)育期等發(fā)生變異 除形態(tài)和性狀發(fā)生變異外 染色體的倍性和數(shù)目也常常發(fā)生變化 造成變異的原因是多方面的 一種是分離原生質(zhì)體的材料本身所存在的 這在使用長期無性繁殖的植物材料時更易發(fā)生 另一方面更重要的原因可能在于原生質(zhì)體操作本身引起的 原生質(zhì)體分離原生質(zhì)體純化原生質(zhì)體培養(yǎng)胞壁再生細胞分裂形成細胞團再生植株 小結(jié) 第二節(jié)原生質(zhì)體融合和細胞雜交 細胞融合 細胞雜交 兩種異源 種 屬間 原生質(zhì)體 在誘導劑誘發(fā)下相互接觸 從而發(fā)生膜融合 胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細胞 進一步發(fā)育成雜種植物體 稱為細胞融合或細胞雜交 一 細胞融合的類型 第一類最常用的即體細胞雜交 用雙親的體細胞原生質(zhì)體或其衍生系統(tǒng)進行誘導融合 再經(jīng)培養(yǎng) 篩選 鑒定等步驟得到細胞雜種 第二類是配子間細胞雜交 即用雙親的性細胞原生質(zhì)體為融合親本 其他步驟同第一類 第三類是配子 體細胞雜交 即一個融合親本為性細胞原生質(zhì)體 另一個為體細胞原生質(zhì)體 目前工作仍以體細胞雜交為多 其他兩類開始有些報道 1 體細胞雜交常規(guī)細胞雜交是用雙親脫去細胞壁的原生質(zhì)體來進行的 經(jīng)誘導融合 篩選和鑒定 然后得到細胞雜種 由于原生質(zhì)體具有各自親本的全部遺傳信息 如果雜交組合是近緣而親和的 則通過細胞雜交可以得到具有雙親所有遺傳信息的細胞雜種 他們是對稱的細胞雜種 雙親都是二倍體原生質(zhì)體則可以得到雙二倍體 雙親都是單倍體的可以得到雙單倍體 細胞融合的過程 膜融合胞質(zhì)融合核融合 植物體細胞雜交 過程示意圖 2 不對稱細胞雜交 除了用雙親完整的原生質(zhì)進行誘導融合外 也有用一個親本的原生質(zhì)體與另一親本原生質(zhì)體的衍生系統(tǒng)如 原生質(zhì)體與胞質(zhì)體原生質(zhì)體與核質(zhì)體甘藍白化苗下胚軸胞質(zhì)體和甘藍型油菜原生質(zhì)體誘導融合得到胞質(zhì)雜種 3 體細胞與性細胞雜交 性細胞原生質(zhì)體融合以及體細胞原生質(zhì)與性細胞原生質(zhì)體融合 早已引起人們的注意 但由于性細胞原生質(zhì)體的制備和培養(yǎng)存在技術上的問題 這方面的進展十分緩慢 近年來 由于制備分離精細胞原生質(zhì)體與卵細胞原生質(zhì)體取得成功 使在離體培養(yǎng)條件下探索受精作用有了可喜結(jié)果 4 微細胞雜交 在哺乳動物和人類的細胞生物學或細胞工程研究中 常采用微細胞雜交 microcellhybridization 法 轉(zhuǎn)移單個完整的染色體以建立單體或多體的 染色體雜種 這種方法也已開始在植物中應用 其步驟是先用一些處理來誘導細胞中形成高頻率的微核 然后再分離和制備具有此微核的原生質(zhì)體 也有人稱之為微原生質(zhì)體 將微原生質(zhì)體作為誘導融合的親本進行細胞雜交 這樣的細胞雜交就是微細胞雜交 二 誘導細胞融合的方法及融合劑 自發(fā)融合用酶法分離原生質(zhì)體時 常常可以看到同種原生質(zhì)體的聚集現(xiàn)象 稱為同源自發(fā)融合 這種融合是發(fā)生在親本之一的自身 也稱為自體融合 誘導融合加入融合劑有目的的誘導的融合 以融合劑劃分為 鹽類融合法高鈣 高pH融合法聚乙二醇融合法聚乙二醇結(jié)合高鈣 高pH法 鹽類融合法以硝酸鹽類 硝酸鈉 硝酸鉀 硝酸鈣 氯化物類 氯化鈉 氯化鈣 氯化鎂 氯化鋇 和葡聚糖硫酸鹽類 葡聚糖硫酸鉀 葡聚糖硫酸鈉 為融合劑 對原生質(zhì)體活力破壞小 但融合頻率低 對液泡化的原生質(zhì)體不易誘發(fā)融合 高鈣和高pH值融合法用較高濃度的鈣離子和較高的pH值促進細胞融合 PEG法以PEG為融合劑PEG結(jié)合高鈣 高pH值法上面兩種方法相結(jié)合提高融合率 三 細胞融合程序 雙親原生質(zhì)體制備分離 純化和培養(yǎng)原生質(zhì)體融合融合方法細胞雜種選擇選擇方法植株再生再生方式 培養(yǎng)基選擇雜種植株鑒定形態(tài) 細胞和分子鑒定 四 融合體的類型 雙親原生質(zhì)體融合時 首先發(fā)生膜融合 胞質(zhì)融合 最后發(fā)生核融合 由于融合的情況不同 可分為 自體融合 和 異體融合 兩大類 自體融合得到 同核體 異體融合得到 異核體 親本原生質(zhì)體ABA AB BA B對稱細胞雜種不對稱細胞雜種異胞質(zhì)細胞雜種嵌合細胞雜種 五 細胞雜種選擇和鑒定 1 選擇意義淘汰雙親原生質(zhì)體 僅異核體能存活 保證異核體分裂 分化和形成細胞雜種 2 選擇方法互補選擇法白化互補遺傳互補營養(yǎng)代謝互補可見標記選擇法 3 鑒定 形態(tài)學鑒定以親本為對照 進行形態(tài)特征 特性分析細胞學鑒定核型分析 顯帶技術等分子鑒定分子標記 同工酶 RAPD AFLP SSR等技術 第三節(jié)以原生質(zhì)體為受體的遺傳轉(zhuǎn)化 植物細胞遺傳轉(zhuǎn)化 指利用離體培養(yǎng)的植物組織 細胞及原生質(zhì)體作為受體 通過某種途徑和技術將外源基因?qū)胫参锛毎?獲得能使外源基因穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)基因植株的技術 一 利用原生質(zhì)體導入外源基因的方法 最為常用的有PEG法 電擊法和脂質(zhì)體法 一 PEG介導轉(zhuǎn)化法PEG即聚乙二醇 為高分子多聚物 最初用作原生質(zhì)體的融合劑 PEG的作用一是粘合細胞 二是擾亂粘合膜的磷脂雙層膜 1 植物的品種 原生質(zhì)體的質(zhì)量及原生質(zhì)體再生形態(tài)的頻率 2 外源基因的濃度和構(gòu)象 3 攜帶DNA 最常用的是小牛胸腺DNA 它可以提高基因轉(zhuǎn)化頻率 并且這種作用不能被質(zhì)粒DNA完全代替 4 PEG溶液 隨濃度升高 轉(zhuǎn)化頻率一般首先增大 達到最大值后再逐漸減小 PEG溶液的pH值也影響轉(zhuǎn)化頻率 5 加入DNA和PEG的先后順序 先加DNA 可提高轉(zhuǎn)化頻率 6 轉(zhuǎn)化介質(zhì)中兩價陽離子的種類和濃度 Mg2 比Ca2 轉(zhuǎn)化頻率高 7 轉(zhuǎn)化細胞的篩選方法 何時加何種抗生素也影響轉(zhuǎn)化頻率 8 其它 原生質(zhì)體的熱激預處理 低劑量X 射線照射可提高轉(zhuǎn)化頻率等 影響轉(zhuǎn)化頻率的因素主要有 特點 1 實驗成本低 結(jié)果穩(wěn)定 重復性較好 不需要特殊儀器設備 易于推廣 2 兩個非連鎖基因的共轉(zhuǎn)化頻率可以達到50 甚至更高 3 用其它植物的基因組總DNA進行遺傳轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化頻率與用質(zhì)粒DNA相近 這說明PEG法介導的遺傳轉(zhuǎn)化不一定需要克隆的基因和特定的載體 為轉(zhuǎn)移抗之數(shù)量性狀的基因 和在缺乏合適篩選標記條件下進行遺傳轉(zhuǎn)化也是可能的 4 其局限性在于 以裸露的原生質(zhì)體作基因受體 必須首先建立可靠高效的原生質(zhì)體再生系統(tǒng) 這對大多數(shù)農(nóng)作物 尤其是禾谷類還是很大的一個問題 二 脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)化法 原理 脂質(zhì)體 liposome 是一種磷脂 磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨 膽甾醇和脂肪酸等脂類分子組成的球形雙層膜囊結(jié)構(gòu) 可將DNA RNA等大分子物質(zhì)包在脂質(zhì)體內(nèi) 免受細胞內(nèi)源核酸酶的降解作用 同時在PEG的作用下 可以更有效地導入受體植物的原生質(zhì)體 缺點 在植物中始終未發(fā)現(xiàn)一種既能與外源DNA分子高效結(jié)合 又能較好地