結(jié)構(gòu)基因組學(xué)PPT課件.ppt

結(jié)構(gòu)基因組學(xué) 1 基因組學(xué)的基本概念 基因組作圖與測(cè)序的原理和方法 重點(diǎn) 2 結(jié)構(gòu)基因組學(xué) 1 概念和目的2 基因組作圖遺傳圖譜物理圖譜轉(zhuǎn)錄圖譜序列圖譜3 基因圖譜 3 概念和目的 以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)的基因結(jié)構(gòu)研究弄清基因組中全部基因的位置和結(jié)構(gòu) 為基因功能的研究奠定基礎(chǔ) 其目的是建立高分辨的遺傳圖譜 物理圖譜 轉(zhuǎn)錄圖譜和序列圖譜 一個(gè)生物體基因組的最終圖就是它的全部DNA序列 4 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)主要任務(wù)基因組作圖 遺傳圖譜 連鎖圖譜 物理圖譜轉(zhuǎn)錄圖譜序列圖譜 分子水平的物理圖譜 5 遺傳圖譜 6 遺傳圖譜 連鎖圖譜 概念 指基因或分子標(biāo)記在染色體上的相對(duì)位置與遺傳距離 用厘摩 cM 表示 cM含義 1cM的遺傳距離表示在100個(gè)配子中有1個(gè)重組子 在哺乳動(dòng)物中 遺傳圖譜上1cM的距離大約相當(dāng)于物理圖譜上1000000bp 7 用途 通過該圖譜可分清各基因或分子標(biāo)記之間的相對(duì)距離與方向 如靠近著絲?；蚨肆Ｗ⒁?該圖譜的構(gòu)建是以位于同一染色體相鄰的2個(gè)基因或遺傳標(biāo)記的重組率為基礎(chǔ) 因而需要有參考家系和分子遺傳標(biāo)記或基因作為研究基礎(chǔ) 8 一 遺傳圖譜與遺傳標(biāo)記 遺傳圖譜采用遺傳分析的方法將基因或其他DNA序列標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖 什么是遺傳標(biāo)記 有可以識(shí)別的標(biāo)記 才能確定目標(biāo)的方位及彼此之間的相對(duì)位置 9 遺傳圖譜 通過遺傳重組所得到的基因線性排列圖稱為遺傳連鎖圖 它是通過計(jì)算連鎖的遺傳標(biāo)記之間的重組頻率 確定它們的相對(duì)距離 cM 物理圖譜 是利用限制性內(nèi)切酶將染色體切成數(shù)個(gè)片段 根據(jù)重疊序列把片段連接成染色體 確定遺傳標(biāo)記之間物理距離 堿基對(duì) bp 或千堿基 kb 或兆堿基 Mb 的圖譜 10 要構(gòu)建構(gòu)建遺傳圖譜 需要尋找基因組不同位置上的特征標(biāo)記 遺傳標(biāo)記 包括 1 形態(tài)標(biāo)記 2 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記 3 生化標(biāo)記 4 DNA分子標(biāo)記 11 二 標(biāo)記的多態(tài)性 所有的標(biāo)記都必須具有多態(tài)性花色 白色 紅色身高 高 矮血型 A B O型淀粉 糯 非糯所有多態(tài)性都是基因突變的結(jié)果 12 1 形態(tài)標(biāo)記 形態(tài)性狀 株高 顏色 白化癥等 又稱表型標(biāo)記控制性狀的其實(shí)是基因 所以形態(tài)標(biāo)記實(shí)質(zhì)上就是基因標(biāo)記 態(tài)標(biāo)記的特征 數(shù)量少很多突變是致死的受環(huán)境 生育期等因素的影響 13 14 2 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記 明確顯示遺傳多態(tài)性的染色體結(jié)構(gòu)特征和數(shù)量特征 染色體的核型染色體的帶型染色體的結(jié)構(gòu)變異染色體的數(shù)目變異優(yōu)點(diǎn) 不受環(huán)境影響缺點(diǎn) 數(shù)量少 費(fèi)力 費(fèi)時(shí) 對(duì)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育不利 15 3 生化標(biāo)記 又稱蛋白質(zhì)標(biāo)記 就是利用蛋白質(zhì)的多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記 如同工酶優(yōu)點(diǎn) 數(shù)量較多 受環(huán)境影響小缺點(diǎn) 受發(fā)育時(shí)間的影響 有組織特異性 只反映基因編碼區(qū)的信息 16 夏臘梅同工酶譜照片 17 4 DNA分子標(biāo)記 簡(jiǎn)稱分子標(biāo)記 以DNA序列的多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記隨著分子生物學(xué)的發(fā)展 相繼建立了RFLP TRS SNP等多種分子遺傳標(biāo)記檢測(cè)技術(shù) 開創(chuàng)了遺傳標(biāo)記研究的新階段 優(yōu)點(diǎn) 不受時(shí)間和環(huán)境的限制遍布整個(gè)基因組 數(shù)量無限不影響性狀表達(dá)自然存在的變異豐富 多態(tài)性好共顯性 能鑒別純合體和雜合體 18 遺傳作圖的標(biāo)記 Settheflagsonthegenomes 19 染色體上的基因和DNA順序均可作為路標(biāo) 路標(biāo)具有物理屬性 他們由特定的DNA順序組成 路標(biāo)位于染色體上的位置是固定的 不會(huì)更改的 因而提供了作圖的依據(jù) 20 三 分子標(biāo)記類型 RFLP 第一代 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性TRS 第二代 串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記SNP 第三代 單核苷酸多態(tài)性 21 1 RFLP的原理 利用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA 形成大小不等 數(shù)量不同的分子片段 酶切位點(diǎn)的改變 會(huì)使得RFLP譜帶表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性 22 PCR RFLP 將PCR產(chǎn)物術(shù)用于RFLP分析 即PCR RFLP 該技術(shù)先用1對(duì)引物特異性擴(kuò)增基因組的某一高變區(qū) 然后用限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物 電泳檢測(cè)多態(tài)性 23 PCR RFLP的應(yīng)用 CCTGAGGAG CCTGTGGAG Mst 酶切位點(diǎn) Mst 酶切位點(diǎn)消失 24 2 TRS 真核生物基因組中的可變串聯(lián)重復(fù)序列 variablenumbertandemrepeatedsequence VNTR 有兩類 小衛(wèi)星和微衛(wèi)星 兩者具有高度的變異性 25 VNTR示意圖 123 VNTR變異的原理示意圖 26 DNA指紋圖譜原理 選擇在VNTR特異序列上沒有酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶將動(dòng)物總基因組DNA切成不同長(zhǎng)度的片段 以VNTR中特異序列作為探針 進(jìn)行Southern雜交 由于不同個(gè)體的串聯(lián)重復(fù)序列的數(shù)目和位置不同 形成的雜交譜帶具有個(gè)體的特異性 人們稱為DNA指紋圖譜 27 28 3 小衛(wèi)星DNA 小衛(wèi)星重復(fù)單位的核心序列為15 76bp近緣物種和個(gè)體間的小衛(wèi)星核心序列有著一定的同源性 在一定的條件下可以相互雜交 29 4 微衛(wèi)星DNA 又稱簡(jiǎn)單序列重復(fù) simplesequencerepeat SSR 是高度重復(fù)序列 廣泛存在于真核生物基因組 重復(fù)單位的核心序列為2 6bp 30 微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記的原理 以微衛(wèi)星DNA標(biāo)記兩側(cè)特異性序列設(shè)計(jì)專一引物 通過PCR技術(shù)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 不同個(gè)體間因核心序列的重復(fù)次數(shù)不同而產(chǎn)生DNA多態(tài)性 31 微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記示意圖 PCR擴(kuò)增 凝膠電泳 32 5 SNP 是指染色體上的某個(gè)存在單個(gè)堿基的變化 包括單堿基的轉(zhuǎn)換 顛換 插入及缺失等 33 遺傳圖譜的構(gòu)建方法 理論基礎(chǔ) 連鎖與交換基本方法 兩點(diǎn)測(cè)驗(yàn)法和三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)法 34 四 遺傳圖譜的構(gòu)建 35 遺傳圖譜構(gòu)建的步驟 選擇適合作圖的DNA標(biāo)記 根據(jù)遺傳材料之間的DNA多態(tài)性 選擇用于建立作圖群體的親本組合 建立具有合適的分離群體 測(cè)定作圖群體中不同個(gè)體或株系的標(biāo)記基因型對(duì)標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析 構(gòu)建標(biāo)記連鎖圖 36 1 親本的選配首先要考慮親本間的DNA多態(tài)性 選擇親本時(shí)應(yīng)盡量選用純度高的材料 要考慮雜交后代的可育性 37 2 分離群體大小的選擇 一般選用F2代分離群體遺傳圖譜的分辨率和精度 很大程度上取決于群體大小 群體越大 則作圖精度越高 但群體太大 不僅增大實(shí)驗(yàn)工作量 而且增加費(fèi)用 因此確定合適的群體大小是十分必要的 合適群體大小的確定與作圖的內(nèi)容有關(guān) 從作圖效率考慮 作圖群體所需樣本容量的大小取決于以下兩個(gè)方面 是從隨機(jī)分離結(jié)果可以辨別的最大圖距 是兩個(gè)標(biāo)記間可以檢測(cè)到重組的最小圖距 38 3 圖譜構(gòu)建的理論基礎(chǔ) 基因重組和連鎖理論遺傳圖譜構(gòu)建的理論基礎(chǔ)是染色體的交換與重組基因的連鎖是位于同一染色體上的基因在遺傳過程中一般傾向于維系在一起基因的重組是通過一對(duì)同源染色體的兩個(gè)非姊妹染色單體之間的交換來實(shí)現(xiàn)的 39 ShC shc 二分體 ShC ShC ShC ShC ShC shc shc shc shc shc shC Shc CSh CSh CSh cSh Csh csh csh csh 四分體 全部親組合占94 3 親組合3 重組合 6 細(xì)胞交換 F1 新 新 新 shc shc ShC ShC P1 P2 94 細(xì)胞無交換 40 假設(shè)某一對(duì)同源染色體上存在Sh sh C c兩對(duì)連鎖基因 現(xiàn)有兩個(gè)親本P1和P2 它們的基因型分別為ShShCC和shshcc 兩親本雜交產(chǎn)生ShshCc雙雜合體 F1在減數(shù)分裂過程中應(yīng)產(chǎn)生4種類型的配子 其中兩種為親型配子ShC和shc 兩種為重組型配子Shc和shC 由于Sh sh和C c位于同一染色體上 要產(chǎn)生重組型配子必須在這兩個(gè)基因的連鎖區(qū)段上發(fā)生交換 41 1 遺傳圖譜構(gòu)建原理 基因連鎖與互換定律遺傳圖譜 基因或標(biāo)記的排序與遺傳距離 物理圖譜 基因或標(biāo)記的排序與物理距離 42 4 重組率的計(jì)算重組型配子所占的比例取決于減數(shù)分裂細(xì)胞中發(fā)生交換的頻率 交換頻率越高 則重組型配子的比例越大 重組型配子數(shù)重組率 100 總配子數(shù)重組率用于估計(jì)交換率 但并不完全等于交換率只有發(fā)生奇數(shù)次交換 重組率才等于交換率 43 重組型配子最大可能的比例是50 這時(shí)在所有減數(shù)分裂的細(xì)胞中 在兩對(duì)基因的連鎖區(qū)段上都發(fā)生交換 相當(dāng)于這兩對(duì)基因間無連鎖 表現(xiàn)為獨(dú)立遺傳 重組率的高低取決于交換的頻率 而兩對(duì)基因之間的交換頻率取決于它們之間的直線距離 重組率的值變化于完全連鎖時(shí)的0 到完全獨(dú)立時(shí)的50 之間 因此重組率可用來表示基因間的遺傳圖距 圖距單位用厘摩 centi Morgan cM 表示 1cM的大小大致符合1 的重組率 44 5 圖譜制作的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理 一 兩點(diǎn)測(cè)驗(yàn)如果兩個(gè)基因于同一染色體上且相距較近 則在分離后代中通常表現(xiàn)為連鎖遺傳 對(duì)兩個(gè)基因座之間的連鎖關(guān)系進(jìn)行檢測(cè) 稱為兩點(diǎn)測(cè)驗(yàn)了解各等位基因分離是否符合孟德爾分離比例 這是連鎖檢驗(yàn)的前提 在顯性條件下 F2群體中分離比例為3 1 45 二 多點(diǎn)測(cè)驗(yàn)對(duì)多個(gè)座位進(jìn)行聯(lián)合分析 利用多個(gè)座位間的共分離信息來確定它們的排列順序 也就是多點(diǎn)測(cè)驗(yàn) 在一條染色體上 經(jīng)過多次多點(diǎn)測(cè)驗(yàn) 就能確定出最佳的基因排列順序 并估計(jì)出相鄰基因間的遺傳圖距 從而構(gòu)建出相應(yīng)的連鎖圖 46 6 構(gòu)建DNA標(biāo)記圖譜的計(jì)算機(jī)軟件許多學(xué)者為構(gòu)建遺傳圖譜設(shè)計(jì)了專用程序包 通過網(wǎng)址http linkage rockefeller edu soft list html可以獲得各種專用程序的相關(guān)信息 應(yīng)用于植物遺傳連鎖分析和遺傳圖譜構(gòu)建的常用軟件是MAPMAKER EXP等 MAPMAKER EXP可通過ftp ftp genome wi mit edu distri bution software mapmaker3獲得 該軟件可以應(yīng)用于各種類型的實(shí)驗(yàn)群體進(jìn)行遺傳作圖 是目前應(yīng)用最為廣泛的作圖軟件之一 47 7 DNA標(biāo)記連鎖圖譜的完善 DNA標(biāo)記連鎖群的染色體定位把分子標(biāo)記所建立的連鎖群與經(jīng)典遺傳圖譜聯(lián)系起來 并將其歸屬到相應(yīng)的染色體上 是構(gòu)建了一個(gè)比較飽和的分子圖譜之后十分重要的工作 通常根據(jù)分子標(biāo)記與已知染色體位置的形態(tài)標(biāo)記的連鎖關(guān)系來確定分子標(biāo)記連鎖群屬于哪條染色體 48 8 遺傳圖距與物理距離對(duì)應(yīng)關(guān)系的估計(jì)不同生物的1cM圖距所對(duì)應(yīng)的實(shí)際物理距離 堿基對(duì)數(shù)量 存在很大差異 一般而言 生物越低等或越簡(jiǎn)單 1cM圖距平均對(duì)應(yīng)的堿基對(duì)數(shù)量就越少 49 分子標(biāo)記實(shí)例1遺傳圖繪制 親本基因型 50 遺傳圖繪制 F2基因型分析 51 52 遺傳圖的偏離 大量的細(xì)胞遺傳學(xué)研究表明 染色體的各個(gè)區(qū)段交換頻率有很大的差別 近端粒區(qū)和遠(yuǎn)著絲粒區(qū)有較高的重組率 染色體的某些位點(diǎn)之間比其他位點(diǎn)之間有更高的交換頻率 被稱為重組熱點(diǎn) recombinationhotpoint 性別也能引起重組率的差異 一般而言 由女性減數(shù)分裂事件繪制的遺傳圖比男性的要長(zhǎng)的多 53 部分連鎖與遺傳作圖 構(gòu)建遺傳圖譜的基本原理是真核生物遺傳過程中會(huì)發(fā)生減數(shù)分裂 此過程中染色體要進(jìn)行重組和交換 這種重組和交換的概率會(huì)隨著染色體上任意兩點(diǎn)間相對(duì)距離的遠(yuǎn)近而發(fā)生相應(yīng)的變化 根據(jù)概率大小 人們就可以推斷出同一條染色體上兩點(diǎn)間的相對(duì)距離和位置關(guān)系 正因?yàn)槿绱?我們得到的這張圖譜也就只能顯示標(biāo)記之間的相對(duì)距離 我們稱這一距離 概率 為遺傳距離 cM 由此構(gòu)建的圖譜也稱為遺傳圖譜 54 基因與分子標(biāo)記的共分離 共分離 如果多態(tài)性在基因組中自由發(fā)生 則有些會(huì)在特定基因附近產(chǎn)生 我們可以確定這樣的標(biāo)記 因?yàn)樵摌?biāo)記與突變表型密切相關(guān)如果比較患病者的和正常人的DNA限制圖譜 可能發(fā)現(xiàn)一個(gè)特定的限制性位點(diǎn)通常出現(xiàn) 或者丟失 在患者DNA中 原因是限制性標(biāo)記與表型間100 相關(guān) 它暗示限制性標(biāo)記與突變基因距離很緊 以至于它們?cè)谥亟M中不能分離 55 物理圖譜 56 物理圖譜 遺傳圖譜所表現(xiàn)的是通過連鎖分析確定的各基因間的相對(duì)位置物理圖則表現(xiàn)染色體上每個(gè)DNA片段的實(shí)際順序 指DNA序列上兩點(diǎn)間的實(shí)際距離用于確定各遺傳標(biāo)記間的物理距離有兩種物理圖譜 1 以已定位的DNA序列標(biāo)記位點(diǎn) STS 為位標(biāo) 以DNA實(shí)際長(zhǎng)度為圖譜距離的基因組圖譜 2 由YAC和 或細(xì)菌人工染色體 BAC 連續(xù)克隆重疊群組成的物理圖譜 57 物理作圖的概念以及簡(jiǎn)介 為什么需要物理作圖技術(shù) 為什么不能直接從遺傳作圖進(jìn)入測(cè)序階段呢 主要有兩個(gè)原因 A 遺傳圖譜分辨率有限 由于人類及其大多數(shù)高等真核生物來說 不可能獲得巨大數(shù)量的后代 因此可用于研究的減數(shù)分裂體就少很多 連鎖分析就受限制 導(dǎo)致標(biāo)記密度的減小 從而影響遺傳作圖 B 遺傳圖譜精確度有限 1992年 釀酒酵母三號(hào)染色體全序列發(fā)表 人們對(duì)比遺傳作圖和DNA測(cè)序所顯示的標(biāo)記的實(shí)際位置 發(fā)現(xiàn)重組熱點(diǎn)的存在對(duì)遺傳作圖的影響 在遺傳圖譜中甚至出現(xiàn)一對(duì)基因的順序被顛倒的情況 58 Physicalmapping 為什么要進(jìn)行物理作圖 遺傳學(xué)圖譜分辨率有限遺傳學(xué)圖的分辨率依賴于得到的交換的數(shù)目 對(duì)于人類與大多數(shù)真核生物來說 巨大數(shù)量的后代不易獲得 遺傳學(xué)圖譜精確度有限重組熱點(diǎn)的存在對(duì)遺傳作圖的影響 釀酒酵母chr3遺傳圖與物理圖的比較 59 Physicalmapping 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的發(fā)展 遺傳作圖物理作圖基因組測(cè)序 60 物理作圖的方法 1 限制酶作圖2 克隆作圖3 熒光原位雜交4 序列標(biāo)簽位點(diǎn)作圖 61 物理作圖的主要環(huán)節(jié) 62 物理作圖的主要方法 限制性作圖 restrictionenzymemapping 克隆作圖 Cloningmapping 熒光原位雜交 fluorescenthybridization FISH 序列標(biāo)簽位點(diǎn) STS 作圖 SequenceTaggedSitesmapping 63 限制性作圖定義 將限制性酶切位點(diǎn)標(biāo)定在DNA分子的相對(duì)位置 局限性 只能應(yīng)用于相對(duì)較小的DNA分子 3Physicalmapping 3 2限制酶作圖 64 熒光原位雜交 fluorescentinsituhybridization FISH 65 66 67 68 69 遺傳圖與物理圖的整合 有些標(biāo)記既是遺傳標(biāo)記 又是物理標(biāo)記 如RFLP標(biāo)記 SSR標(biāo)記和某些基因序列借助這些標(biāo)記可以將遺傳圖和物理圖整合起來 70 基因組測(cè)序策略 有了高密度的基因組圖譜 就可以開始全基因組測(cè)序了測(cè)序的技術(shù)飛速發(fā)展 現(xiàn)在可以全自動(dòng)化測(cè)序的策略有兩個(gè) 鳥槍法克隆重疊群法 71 采集5個(gè)自愿者的DNA樣品 構(gòu)建3種不同插入子大小的基因組文庫2Kb 10Kb和50Kb 完成約2700萬次插入子末端測(cè)序 總長(zhǎng)14800Mb GeneBank下載104018個(gè)BAC末端順序 PFP發(fā)表的公開數(shù)據(jù)主要為BAC克隆的順序 共4443 3Mb 隨機(jī)測(cè)序與序列組裝方法和指導(dǎo)測(cè)序與序列組裝方法相結(jié)合進(jìn)行序列組裝 72 國(guó)際人類基因組測(cè)序策略構(gòu)建BAC克隆 限制性酶處理獲得指紋 根據(jù)指紋重疊方法組建BAC克隆重疊群 根據(jù)STS標(biāo)記 將BAC克隆重疊群標(biāo)定在物理圖上 每個(gè)BAC克隆內(nèi)部采用鳥槍法測(cè)序 組裝 將BAC插入順序與BAC克隆指紋極重疊群對(duì)比 將已閱讀的順序錨定到物理圖上 73 克隆重疊群法 clonecontig 將基因組DNA切割長(zhǎng)度為0 1Mb 1Mb的大片段 克隆到Y(jié)AC或BAC載體上然后再進(jìn)行亞克隆 分別測(cè)定單個(gè)亞克隆的序列再裝配 連接成連續(xù)的DNA分子 這是一種自上而下的測(cè)序策略clone by clonemethod 74 3 序列圖譜 分子水平的物理圖譜 以某一染色體上所含的全部堿基順序繪制的圖譜 既包括可轉(zhuǎn)錄序列 也包括非轉(zhuǎn)錄序列 是轉(zhuǎn)錄序列 調(diào)節(jié)序列和功能未知序列的總和 測(cè)定序列 75 3 基因組測(cè)序與序列組裝 基因組計(jì)劃的最終目標(biāo)是獲得所研究的生物的完整的DNA順序 最佳狀況是將物理圖譜和遺傳圖譜進(jìn)行有機(jī)整合 以便于確定基因以及其他重要的序列在DNA順序中的位置 這里主要介紹基因組測(cè)序中所采用的技術(shù)和策略 主要內(nèi)容 1 DNA測(cè)序的方法2 DNA順序的組裝 76 77 DNA測(cè)序的方法 DNA測(cè)序技術(shù)主要有兩種方法 都是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)明的 A 鏈終止法 thechainterminationmethod 是通過合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈來讀取待測(cè)DNA分子的順序 B 化學(xué)降解法 chemicaldegradationmethod 是將雙鏈DNA分子用化學(xué)試劑處理 產(chǎn)生切口 用同位素標(biāo)記進(jìn)行測(cè)序 78 DNA順序的組裝 主要有兩種方法將大量短的DNA順序組裝起來 鳥槍法及克隆重疊群法 79 鳥槍法和重疊群法 基因組計(jì)劃的基本目標(biāo)是獲得全基因組順序 在此基礎(chǔ)上再對(duì)所獲得的序列進(jìn)行解讀 獲得基因組順序的主要方法是進(jìn)行DNA測(cè)序 然后再將讀取的順序組裝 目前的DNA測(cè)序每次反應(yīng)僅能讀取不到1000bp的長(zhǎng)度 已知最小的細(xì)菌基因組為580kb 因此基因組測(cè)序的第一步是構(gòu)建基因組圖 然后將基因組區(qū)段分解逐個(gè)測(cè)序 最后進(jìn)行組裝 基因組作圖的基本構(gòu)想是 在長(zhǎng)鏈DNA分子的不同位置尋找特征性的分子標(biāo)記 根據(jù)分子標(biāo)記將包括這些序列的克隆進(jìn)行連鎖定位 繪制基因組圖 一旦構(gòu)建好基因組圖 即可著手進(jìn)入全基因組測(cè)序 以基因組圖指導(dǎo)的測(cè)序有2種路線 重疊群法和直接鳥槍法 80 81 什么是鳥槍法 全基因組隨機(jī)測(cè)序戰(zhàn)略主要采用鳥槍法 shotgun 鳥槍法 也俗稱 霰彈法 是隨機(jī)先將整個(gè)基因組打碎成小片段進(jìn)行測(cè)序 最終利用計(jì)算機(jī)根據(jù)序列之間的重疊關(guān)系進(jìn)行排序和組裝 并確定它們?cè)诨蚪M中的正確位置 鳥槍法 82 鳥槍法 優(yōu)點(diǎn) 速度快 簡(jiǎn)單易行 成本較低 可以在較短的時(shí)間內(nèi)通過集中機(jī)器和人力的方法獲得大量的基因片斷 鳥槍法 缺點(diǎn) 最終排序結(jié)果的拼接組裝比較困難 尤其在部分重復(fù)序列較高的地方難度較大 此外有許多序列片段難以定位在確切的染色體上 成為游離片斷 同時(shí)又會(huì)有許多地方由于沒有足夠的覆蓋率而形成空缺 這些缺陷最終導(dǎo)致整個(gè)基因圖會(huì)留下大量的空洞 gap 也影響其準(zhǔn)確度 83 84 重疊群法 以大片斷定位的克隆為基礎(chǔ)的定向測(cè)序戰(zhàn)略主要采用克隆步移法或稱重疊群法 過程 先構(gòu)建遺傳圖 再利用幾套高度覆蓋的大片段基因組文庫 BAC PAC等 獲得精細(xì)的物理圖 選擇合適的BAC或PAC克隆測(cè)序 利用計(jì)算機(jī)拼裝 BAC內(nèi)的空洞基本上都可以利用設(shè)計(jì)引物等手段填補(bǔ) 形成一條完整的BAC序列 然后由相互關(guān)聯(lián) 部分重疊的BAC克隆連成一個(gè)大的重疊群 Contig 理想狀況下 整條染色體就是由一個(gè)完整的重疊群構(gòu)成 85 但通常情況下部分BAC之間會(huì)有物理空洞 PhysicalGap 這是目前國(guó)際上還未克服的難題 利用克隆步移法測(cè)序 國(guó)際上通行的標(biāo)準(zhǔn)要求BAC測(cè)序達(dá)到十倍覆蓋率 使所測(cè)的序列達(dá)到99 99 以上的