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第三節(jié)細胞及其組分的分離純化和分析 流式細胞分選儀 4 計算機系統(tǒng) 將收集的光信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號再進行處理分析數(shù)據(jù)顯示 直方圖 橫標以道數(shù)表示 代表所測熒光或散射光強度縱標表示細胞的相對數(shù)優(yōu)點 可定性 可定量缺點 只能顯示一個參數(shù)于細胞之間的關系 二維圖 橫 縱標分別表示與細胞有關的兩個獨立參數(shù) 平面上的每個點表示同時具有相應坐標值的細胞存在 優(yōu)點 顯示兩個獨立參數(shù)與細胞相對數(shù)之間的關系 反應信息量大缺點 細胞點密集的地方難以顯示它的精細結構 二維等高圖 等高圖上每連續(xù)曲線代表具有相同細胞數(shù)的細胞群 即等高 曲線層次越高 代表的細胞數(shù)越多 二 樣品的制備1 制備單個細胞懸液分離不同類型的細胞后用蛋白水解酶 胰蛋白酶 膠原酶 消化細胞間結合物質(zhì)或用金屬離子螯合劑 乙二胺四乙酸EDTA 除去細胞互相粘著所依賴的Ca2 然后用輕微的機械方法即可制備成單個細胞懸液 2 細胞固定 染色活細胞無需固定 死細胞用甲醛 乙醇 丙酮固定 流式細胞標本一般可不染色 但要觀察細胞內(nèi)特殊分子 如DNA RNA 則需染色 3 細胞分選 流式細胞分選儀 二 細胞組分的分級分離 原理 利用顆粒大小的不同 差速離心法速度區(qū)帶離心法利用顆粒密度的不同 等密度離心法 1 差速離心法 用于分離大小 形狀不同顯著的組分 根據(jù)顆粒沉降速度不同得以分離 2 速度區(qū)帶離心法 用于分離大小差別不顯著的組分 3 等密度離心法 按細胞組分的浮力密度不同進行分離的方法 適用于大小 形態(tài)相似而密度不同的組分 常將樣品通過高濃度的蔗糖或氯化銫的密度梯度沉降在達到與自身密度相等的位置就停滯不再向下沉降 此方法直接證明了DNA的不保留復制 三 層析 1 紙層析 2 柱層析 使蛋白質(zhì)混合液通過含有多孔固體基質(zhì)的柱中 不同蛋白質(zhì)與基質(zhì)相互作用被不同程度的滯留 這樣可在柱底將它們分別收集 常用方法 離子交換層析凝膠過濾層析親和層析 四 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS PAGE 電泳 electrophoresis 在含有蛋白質(zhì)分子的溶液里加上電場 蛋白質(zhì)就會按照它的凈電荷 大小和形狀 以一定的速度在電場中移動 這一技術叫電泳 聚丙烯酰胺凝膠 丙烯酰胺 N N 亞甲雙丙烯酰胺聚合而成 五 雙向電泳目的 單向SDS PAGE電泳分辨力差 只能分開50左右種的蛋白 雙向電泳可分辨1000種以上的蛋白質(zhì) 一般為

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