細胞凋亡小泡與CD8 T細胞的交聯(lián).doc

細胞凋亡小泡與CD8 T細胞的交聯(lián),及對肺結(jié)核防預(yù)摘要CD8 T淋巴細胞在對抗結(jié)核分枝桿菌的預(yù)防免疫中起到重要的作用。最近,我們描述了一條在肺結(jié)核中CD8T細胞活化的迂回途徑，該途徑通過來自被感染細胞的細胞凋亡小泡調(diào)節(jié)，將分枝桿菌性抗原運輸?shù)綐渫患毎?DCs)。這里我們證實在體內(nèi)，來自分支桿菌感染的巨噬細胞的凋亡小泡,刺激CD8 T細胞。DCs來消耗淋巴結(jié)的自導嚴格要求有效的交聯(lián)。經(jīng)核內(nèi)體內(nèi)為主的蛋白酶體處理發(fā)現(xiàn)在受體DCs中小泡-相關(guān)抗原隨后死亡。此外，囊泡加工取決于脂結(jié)合蛋白得存在來使凋亡膜解體。通過Toll-樣受體（TLR）刺激，凋亡小囊泡顯示有效的輔助活性。最后，從受感染的細胞接種囊性小泡誘導防預(yù)多發(fā)性結(jié)核感染。綜上所訴,我們提出這個迂回路徑來代表調(diào)節(jié) CD8 T細胞在體內(nèi)的交聯(lián)及對肺結(jié)核的防預(yù)的一個真正的免疫學機制。介紹肺結(jié)核是最常見的全世界性細菌感染疾病。免疫對抗它的病原學作用者，結(jié)核分枝桿菌，主要涉及CD4 T細胞。然而,CD8 T細胞在保護預(yù)防結(jié)核病起著至關(guān)重要的作用,因為缺乏CD8 T細胞造成對分枝桿菌的攻擊更高的易感性。分枝桿菌性肺結(jié)核主要感染肺部的巨噬細胞。感染后，分枝桿菌定居在早期吞噬小體內(nèi)并通過抑制吞噬小體成熟及抑制與溶酶體融合而逃避免疫系統(tǒng)。此外,分枝桿菌抗原在吞噬小體內(nèi)被隔離,不能穿越進入胞漿。由于CD8 T細胞識別源于細胞質(zhì)的抗原并使抗原沿MHC-I抗原-表達路徑被處理,關(guān)鍵問題一直是CD8 T細胞如何遇到各自分枝桿菌性抗原表位。先前的工作描述在結(jié)核病中CD8 T細胞的活化這條迂回途徑來克服這一障礙。因此,分枝桿菌誘導被感染的巨噬細胞的細胞凋亡，隨后釋放含自分枝桿菌抗原的凋亡小泡。這些小泡被DCs吞沒，加工處理抗原物為后續(xù)提供給CD8 T細胞。因此,這條迂回路徑代表了 CD8 T細胞通過吞噬小體-封閉的抗原活化的專用機制。最初,在病毒性感染中發(fā)現(xiàn)細胞凋亡和T細胞的活化的關(guān)系，病毒性感染中將死的被感染細胞通過共培養(yǎng)的DCs促進CD8 T細胞啟動。這一機制涉及從含有抗原供體細胞到受體細胞的轉(zhuǎn)移,最終調(diào)節(jié)抗原呈遞,這一機制被稱之為與T細胞的活化相關(guān)的交叉呈遞或交聯(lián)。這條迂回路徑包括經(jīng)典交聯(lián),后者被證實為多種腫瘤和感染模式。幾種病原體包括沙門氏菌和志賀氏菌誘導感染宿主細胞的細胞凋亡。然而,凋亡小泡作為交聯(lián)劑,還不能確定在這些模型系統(tǒng)中。不同的模式可以解釋交聯(lián)的機理。最新數(shù)據(jù)顯示,抗原呈遞細胞(APC)的吞噬小體配備完整的分子裝置,要求MHC-I限制性抗原呈遞包括抗原呈遞相關(guān)的轉(zhuǎn)運（TAP）,肽加載復雜,及鄰近的蛋白酶體。這表明吞噬小體組成一種自主細胞器，通過主要細胞便利直接的交叉呈遞。然而,新的研究不能證實這些結(jié)論。因為這條迂回路徑是在人類的體外系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn),就炎癥性過程而言，交聯(lián) CD8 T細胞僅僅能代表旁觀者通過周圍DCs接受，凋亡小泡的活化。研究凋亡小泡路徑是否反映了真正的免疫學機制，即在周圍組織中通過DCs小泡的跨越攝取，隨后移動至耗竭的淋巴結(jié),并且在淋巴組織啟動T細胞，我們建立了抗原特異性體內(nèi)模型。為此,我們使用重組分枝桿菌卡介苗（BCG-OVA）來感染的巨噬細胞。由于宿主細胞固有侵染誘導的凋亡的抑制，我們認為通過被感染的APCs細胞死亡后囊泡形成的外在控制作為最可靠的方法。我們通過來自被感染巨噬細胞的細胞凋亡小泡使小鼠免疫，并采納性地轉(zhuǎn)移OVA特異性TCR-轉(zhuǎn)基因CD8 T細胞到受體細胞,繼而分析CD8 T細胞體內(nèi)活性。結(jié)果分枝桿菌誘導凋亡小泡巨噬細胞感染后，分枝桿菌引起宿主細胞調(diào)控的細胞死亡。為了將細胞凋亡形象化，用重組BCG-OVA感染后，我們進行了鼠科的巨噬細胞的Annexin V染色。它將Annexin V 綁定于磷脂酰絲氨酸典型地暴露在凋亡膜的外部小葉。圖1A揭示BCG-OVA-感染的巨噬細胞的Annexin V染色的紅色熒光,標志細胞凋亡相較于非感染細胞。包括星孢菌素在內(nèi)，作為凋亡細胞死亡的調(diào)控,激活半胱天冬酶-3以及隨后的細胞凋亡級聯(lián)。掃描電鏡(SEM)顯示了經(jīng)歷了侵染誘導的細胞凋亡的巨噬細胞的囊泡形成(圖1B)。值得一提的是,垂死的巨噬細胞通過出芽于細胞索的細胞凋亡小泡表現(xiàn)出一系列顯型(圖1B,中部)。巨噬細胞的不同超速離心法導致同源的囊泡制備如同SEM指示(圖1B,底部)。為檢測重組BCG(卡介苗)替代的抗原使否存在于凋亡小泡中,我們通過單克隆抗體對抗卵白蛋白進行了囊泡蛋白質(zhì)的蛋白印跡?？ń槊绫磉_相當于卵細胞碎片(氨基酸230-359)的w12 kDa帶,這些帶在來自未感染的巨噬細胞得凋亡小泡中不存在(圖1C)。綜上所訴,凋亡小泡的產(chǎn)生包括來自BCG-OVA-感染的巨噬細胞的替代抗原證明是完全具有功能的。通過凋亡小泡的CD8 T細胞的交聯(lián)為了研究在體內(nèi)凋亡小泡是否激活天然CD8 T細胞,我們通過皮下給于來自未感染或天然巨噬細胞得囊泡制劑使野生小鼠免疫。相平行的,我們從TCR-轉(zhuǎn)基因動物(OT-1)具體為OVA決定素SIINFEKL中分離出CD8 T細胞。隨后,在過繼轉(zhuǎn)移到接受免疫的小鼠前，我們用熒光染料羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）標記OT-1細胞。這種染料隨著細胞分裂同樣分離,使得增殖模式產(chǎn)生。轉(zhuǎn)移后三天，淋巴細胞從耗竭的淋巴結(jié)制備并為CD8染色。流式細胞儀分析揭示，轉(zhuǎn)移的CD8 T細胞通過來自CFSE稀釋法標記的受感染細胞的囊泡刺激大量活化表明(圖2A,上右)。相反,受體動物通過來自未感染的巨噬細胞的凋亡細胞小泡或來自野生型BCG感染的細胞（不表達OVA）的囊泡進行免疫，得到的CD8 T細胞并沒有增殖(圖2A左上,數(shù)據(jù)未顯示)。此外,細胞內(nèi)細胞因子染色顯示，通過來自未感染細胞的囊泡的刺激后，相對于OT-1細胞，CD8 T細胞隨著分裂產(chǎn)生了大量的干擾素-g(IFN-g)，(圖2A,底部)。接下來,我們通過關(guān)注T細胞的活化檢查與凋亡小泡相關(guān)的抗原呈遞分子的作用。為了這個目的,我們通過感染的巨噬細胞小泡缺乏b2 微球蛋白(b2m)產(chǎn)生了缺乏MHC-I分子的囊泡。相對于通過由感染細胞派生的囊泡的刺激，通過來自感染的b2m-KO巨噬細胞的凋亡小泡免疫誘導體內(nèi)固有CD8 T細胞活化，(圖2B)。凋亡小泡產(chǎn)生于受刺激的野生型細胞目的為刺激b2m-缺陷動物轉(zhuǎn)基因OT-1細胞引發(fā)適度的CD8 T細胞應(yīng)答(圖2C,上)。然而,對細胞增殖程度觀察表明，潛在的MHC-I分子從凋亡小泡到b2m-缺陷受體細胞的傳遞缺乏MHC-I蛋白。為驗證這個想法,我們進行了一次體外試驗用b2m-缺陷 DCs如APCs和CD8 + 類的OT-1淋巴細胞作為應(yīng)答器細胞。當缺乏MHC-I的DCs通過來自BCG-感染的巨噬細胞凋亡小泡被脈動，沒有測到CD8 T細胞的抗原特異性活化。與之鮮明的對比，增加入來自BCG-OVA-感染的細胞的囊泡誘導健全的T細胞增殖，通過3H-胸腺嘧啶脫氧核苷合體作用確定。OT-1細胞通過來自BCG-OVA-感染的巨噬細胞的囊泡的刺激在缺乏b2m-缺陷DCs中未能引起CD8 T細胞的活化(圖2C,底部)。因此,凋亡小泡直接影響OT-1細胞或OT-1細胞調(diào)節(jié)抗原表達可以被排除。 另外,我們還分析了凋亡小泡的關(guān)于其他T細胞種群的交聯(lián)能力。我們進行了在MHC-II的環(huán)境中特異性針對OVA肽的TCR-轉(zhuǎn)基因CD4 T細胞采納性的轉(zhuǎn)移，用感染或未感染的巨噬細胞的囊泡免疫受體小鼠。圖2D表明,來自感染細胞的凋亡小泡有效激活CD4 T細胞。總之,在體內(nèi)凋亡小泡有效地交聯(lián)CD8的T細胞。除了抗原呈遞外,囊泡能夠傳遞抗原呈現(xiàn)分子到受體APC。囊泡-誘導的T細胞的活化包括CD4T細胞啟動。這條便道路徑需要DCs的歸巢。 因為我們觀察到用凋亡小泡皮下免疫接種后位于引流淋巴節(jié)CD8 T細胞的活化,我們旨在闡明小泡在外周和淋巴組織之間的運輸方式。考慮到小泡運輸?shù)膬煞N可能或直接通過淋巴或通過媒介細胞,我們在皮下注射前通過熒光染料標記凋亡小泡，目的是為了測定它們的終點。標記的一天后,我們切除引流淋巴結(jié)，制成凍干切片。在組織染色后通過抗體抗DC標志CD11c以及巨噬細胞特異性表面蛋白F4/80，我們在共焦顯微鏡下檢測了淋巴節(jié)截面。圖3顯示為CD11c DCs(+)相互排斥的染色以及在淋巴結(jié)截面的巨噬細胞(F4/80 +)(上左)。皮下注射后位于淋巴節(jié)點發(fā)現(xiàn)紅色熒光小泡的幾行(圖3A,底中部區(qū))。標記的凋亡小泡的位置上疊加在DCs染色上(圖3A,底部左)。DCs和小泡的覆蓋層很大程度上說明了共區(qū)域化，表明凋亡小泡是通過DCs處理(圖3A,底部右)。提議在外周部DCs吞沒小泡，隨后遷移到引流淋巴結(jié)。除了這些形態(tài)學數(shù)據(jù),我們對于DCs的歸巢做了功能性實驗。我們利用趨化因子受體7(CCR7)缺陷的小鼠，通過天然的和記憶性T細胞以及成熟的DCs表達作為歸巢至淋巴組織的前提。我們通過來自BCG-OVA-感染的巨噬細胞的凋亡小泡免疫CCR7-缺陷動物并采納性地在平行組中轉(zhuǎn)移CFSE-標記的 OT-1細胞。轉(zhuǎn)移三天后，來自淋巴結(jié)的細胞被隔離并著色為CD8。流式細胞儀等分析顯示相較于在野生動物增生性反應(yīng)，在CCR7 -基因敲除小鼠中缺乏CD8 T細胞的活性(圖3B,上)。為排除CCR72/2固有缺陷小鼠事先指導野生型CD8 T細胞,我們通過SIINFEKL肽并聯(lián)OT-1細胞轉(zhuǎn)移非脈沖調(diào)制或脈沖調(diào)制野生型DCs到CCR72/2受體。采納性轉(zhuǎn)移的三天后，流式分析顯示適當?shù)目乖禺愋訡D8 T細胞的活化(圖3B,底部)。綜合起來看,我們在CCR7-缺陷系統(tǒng)中的功能試驗驗證了形態(tài)學數(shù)據(jù),表示DCs歸巢是絕對需要 通過凋亡小泡的CD8 T細胞的交聯(lián)。凋亡小泡在DCs中的處理因為DCs顯示為CD8T細胞通過凋亡小泡交聯(lián)的中心,我們進一步關(guān)注在APCs中小泡的不同處理。一個體外T細胞檢驗設(shè)定骨髓源性DCs作為APCs(抗原提呈細胞)與CD8 + -提純的OT-1細胞作為應(yīng)答T細胞進行共培養(yǎng)。通過由BCG-OVA-感染的巨噬細胞衍生的凋亡小泡脈沖DCs后，CD8 T細胞通過抗原特異性增殖進行應(yīng)答并通過3H-胸苷分割OT-1 細胞合體作用作為記錄。在用小泡孵化前通過洛霉素DCs處理并補充T細胞以劑量依存性的方式消除CD8 T細胞反應(yīng)(圖4,上面)。洛霉素阻礙了核內(nèi)體的H+-ATPase,便利于晚期核內(nèi)體和溶酶體的酸化。因此,通過洛霉素對OT-1細胞刺激的抑制,證明凋亡小泡的核內(nèi)體處理對CD8 T細胞活化的重要性。APCs與蛋白酶體抑制劑MG132的預(yù)孵化對T細胞活化(圖4,上面)。為了排除表現(xiàn)在CD8 T細胞之間的細胞抗原呈遞的影響,我們通過來自誘導T細胞的活化失敗的感染的巨噬細胞的小泡脈沖OT-1細胞。為了排除使用的化學抑制劑的毒性反應(yīng),我們在用洛霉素或MG132孵化前以低(0.1毫克/毫升)或高(1毫克/毫升)濃度的SIINFEKL肽脈沖DCs并隨后加入CD8 T細胞。因為T細胞對肽呈遞應(yīng)答的損傷不能被觀察到,該抑制劑的任何毒性作用可被排除(圖4,上面)。在相同的試驗設(shè)置中使用卵清蛋白(5毫克/毫升)顯示在存在MG132中T細胞應(yīng)答終止,表明蛋白酶體在 CD8 T細胞通過可溶性蛋白交聯(lián)中的重要性(圖4,底部)。為評估蛋白酶體和溶酶體酸化的效能，我們在抑制劑下at a moi of5通過重組表達OVA的單核細胞增多性李斯特氏菌(L.m.-OVA)感染DCs溶酶體。由于李斯特菌的作用,感染后李斯特菌能誘發(fā)膜孔逃脫吞噬小體迅速到達細胞質(zhì)。這使我們得以對細胞質(zhì)蛋白質(zhì)的處理研究MG132的影響。圖4(下部)展示了由于蛋白酶體的缺陷抗原識別的完全阻滯。自從李斯特氏菌施展在酸性環(huán)境中最優(yōu)活性以來，核內(nèi)體的腔隙的中和作用同樣減少了T細胞的活化。最后,探討洛霉素和MG3在MHC-II限制性抗原呈遞中的影響,我們在與抑制劑孵化前用卵清蛋白(5毫克/毫升)脈沖DCs并加入卵清蛋白-特異性CD4 T細胞(OT-2)。核內(nèi)體酸化有效的抑制終止CD4 T細胞抗原識別,而蛋白酶阻滯起不了什么作用(圖4,底部)。綜合起來看,核內(nèi)體為主的涉及抗原處理的蛋白酶體機制包括凋亡小泡為之后CD8 T細胞誘導。因為我們確定了溶酶體腔隙對凋亡小泡的抗原編輯是極其重要,我們就問對小泡處理是否還需要有其他溶酶體的輔助分子。先前研究描述為脂結(jié)合蛋白作為脂質(zhì)呈遞蛋白質(zhì)位于溶酶體與溶酶體內(nèi)的小泡相互作用。從而使脂結(jié)合蛋白破壞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并暴露它們的成分為進一步的處理。凋亡和溶酶體內(nèi)的小泡在結(jié)構(gòu)上顯示一些類似。此外,脂結(jié)合蛋白對典型地暴露在凋亡膜表面的磷脂酰絲氨酸具有高親和力。因此,我們提出了脂結(jié)合蛋白的在凋亡小泡的解體一個作用,通過來自鞘脂激活蛋白原缺陷小鼠的DCs進行實驗，脂結(jié)合蛋白 A-D的前體蛋白,用于CD8 T細胞的活化。當來自鞘脂激活蛋白原-缺陷動物的APCs以不同濃度的來自BCG-OVA-感染的巨噬細胞的小泡被脈沖，CD8 T細胞應(yīng)答相對于雜合的或野生型控制DCs的刺激顯著減少(圖5)。通過在細胞培養(yǎng)基中添加重組鞘脂激活蛋白原鞘脂激活蛋白原-缺陷的APCs再構(gòu)成，T細胞應(yīng)答在很大程度上恢復。以不同濃度的SIINFEKL肽裝載鞘脂激活蛋白原-敲除的APCs誘導一個有力的CD8 T細胞應(yīng)答,顯示了另一個生理性的MHC-I-限制性抗原呈遞能力(圖5)。此外,可溶性的卵清蛋白(5毫克/毫升)的增加顯示了通過鞘脂激活蛋白原-缺陷 APCs相對于雜合的或野生DCs使T細胞活化的一個同等的重要性(圖5)。因此, 在抗原加工中由于鞘脂激活蛋白原的缺乏所致的廣泛的缺陷可以被排除。此外,我們以前證明,鞘脂激活蛋白原-缺陷細胞的溶酶體腔隙結(jié)構(gòu)上未受損傷而這一點與-葡萄糖苷酶類如b-己糖胺酶和b-半乳糖苷酶等有所區(qū)別。綜上所述,缺乏鞘脂激活蛋白原削弱CD8 T細胞的活化,證明脂結(jié)合蛋白在凋亡小泡處理中起作用。凋亡小泡是佐劑生產(chǎn)T細胞應(yīng)答都依賴于通過像巨噬細胞和DCs一樣強有力的APCs進行充足的抗原呈遞。成功的T細胞引導通過APCs的活化而變得容易。病原體具有保守的分子,例如脂多糖（LPS）或者細菌脂蛋白(BLP)，通過Toll-樣受體刺激APCs。我們決定是否來自BCG-感染的巨噬細胞的凋亡小泡配備分枝桿菌性配基通過TLRs刺激。為此,我們使用穩(wěn)定表達TLR-2 受感染的293HEK細胞系,與NF-kB-控制的熒光素酶受體質(zhì)粒短暫地共感染。在TLR-2連接反應(yīng)后,接頭分子髓性區(qū)化因子88（MyD88）的募集導致NF-kB活化和隨后熒光素酶的表達。共轉(zhuǎn)染一天后,細胞與大量的來自感染或未感染的巨噬細胞的凋亡小泡一起培養(yǎng)。6小時后，細胞被溶解并測試NF-kB-依賴性 熒光素酶活力。在劑量依賴的方式下來自分枝桿菌感染的巨噬細胞的凋亡小泡與來自未感染的細胞的小泡對比引發(fā)NF-kB激活（圖6A）。為了擴大我們對從報道細胞系統(tǒng)到更自然的條件的深刻見解,我們用凋亡小泡刺激缺乏TLR-2，TLR-4,或MyD88主要的APCs。來自各自基因敲除動物的DCs或巨噬細胞被脈沖,無論是用來自感染或未感染細胞的小泡或卡介苗。隨后,細胞培養(yǎng)來分析IL-12或TNF-a的分泌。在野生型DCs來自受感染細胞的小泡誘導大量的IL-12,在很大程度上減少了,TLR-2 TLR-4 -,和MyD88-KO DCs，而卡介苗刺激導致通過野生型以及TLR-4-KO DCs分泌IL-12 / IL-23p40(圖6B)。相對于野生或TLR-4-KO巨噬細胞,小泡也未能引起TLR-2-缺陷巨噬細胞分泌TNF-a(圖6C)。與此一致的發(fā)現(xiàn),缺乏接頭分子MyD88的細胞被來自感染巨噬細胞的小泡激活。總之,在來自分枝桿菌感染的細胞的凋亡小泡通過激活TLR-2銜接表現(xiàn)出很強的APCs佐劑活性。 為了描述分支桿菌所含凋亡小泡,我們通過來自小泡的蛋白質(zhì)進行了免疫印跡，小泡來源于分支桿菌感染的細胞及對比的未感染細胞。圖6D展示了通過一個克隆抗-BCG免疫血清測得分枝桿菌性蛋白大量的帶呈現(xiàn)在小泡中。這些蛋白質(zhì)中的一種與表達Ag85的w31 kDa帶相符合,Ag85是一個防御性抗原通過M.肺結(jié)核和BCG共享,通過特定的抗體顯示(圖6D)。另外,通過免疫印跡法檢測到代表抗原和佐劑的分子。因此,分支桿菌19 kDa脂蛋白，綁定于TLR-2并充當T細胞抗原，出現(xiàn)在被感染巨噬細胞的凋亡小泡中(圖6D)。綜上所訴,分支桿菌蛋白,如19 kDa脂蛋白是囊泡蛋白內(nèi)含物的組成并授予凋亡小泡強勁的佐劑性。 用凋亡小泡接種疫苗防止肺結(jié)核因為來自分支桿菌-感染細胞的凋亡小泡運載抗原,抗原呈遞分子以及佐劑,他們能有效激活CD4以及CD8 T細胞。因此,我們研究防御效果小泡-為基準的抗結(jié)核分枝桿菌感染的疫苗。我們對C57BL / 6小鼠用來自泡在BCG-感染或未感染巨噬細胞的凋亡小泡接種疫苗，皮下注射間隔10天共兩次。作為陽性控制組,我們包括了用BCG免疫動物現(xiàn)有的預(yù)防結(jié)核病的疫苗。最后一次免疫的10天后,我們用低接種物M.肺結(jié)核通過氣霧劑感染激發(fā)小鼠。在20天和感染后50,我們從實驗動物中收集肺、肝臟以及脾臟,并在7H11瓊脂連續(xù)對倍稀釋攪勻器官。三個星期后,對結(jié)M.核分枝桿菌群體計數(shù)并測定每毫升器官的菌落數(shù)。，來自未感染細胞的小泡未能防止多發(fā)性結(jié)核感染相當于未接種組(圖7)。鮮明的對比,在20天和50天在肺和脾中按BCG-誘導的防御確定用來自分支桿菌-感染的巨噬細胞的凋亡小泡疫苗接種疫苗誘導氣霧劑-激發(fā)的防止（圖7A-7C）。用來自感染巨噬細胞的小泡接種免疫組或BCG和未接種免疫組或那些用來自未感染巨噬細胞的小泡接種免疫組，各組之間菌落數(shù)有著顯著的統(tǒng)計差異。由于未接種免疫小鼠自發(fā)的細菌的重荷減少,在50天時肺菌落數(shù)在未接種免疫動物中相對于在接種免疫動物中要高然而無統(tǒng)計學意義(圖7B)。然而,在感染后同一時間點，在脾臟中相較于未免疫接種組小泡-為基礎(chǔ)的疫苗誘導的防御具有意義(圖7C)。綜上所述,用凋亡小泡接種的疫苗防止肺結(jié)核。 討論本研究的目的是研究CD8 T細胞活化的這條便道傳導是否在體內(nèi)有可操作性?；谥暗墓ぷ髦攸c在于分析人類體外系統(tǒng),剩下的問題是凋亡小泡是否代表一條特有的免疫學機制,而不僅僅是旁觀者活化為炎癥過程所特有。因此,我們用來自BCG-OVA-感染的巨噬細胞凋亡小泡建立了特異性模型為小鼠的免疫通過采納性轉(zhuǎn)導接受OVA-特異性CD8T細胞 。DCs吞噬這些小泡進行深加工，抗原激活CD8T細胞否則在吞噬小體中被隔離。我們通過掃描電鏡的侵染誘導細胞凋亡的研究顯示一串分支桿菌感染巨噬細胞的表型顯示從細胞帶形成的小泡。在引流淋巴節(jié)來自結(jié)核分枝桿菌-感染的巨噬細胞的凋亡小泡皮下免疫接種誘導CD8 T細胞的活化。因此,通過凋亡小泡的交聯(lián)發(fā)生在體內(nèi)。盡管在一些病毒和腫瘤系統(tǒng)中的數(shù)據(jù)相互矛盾,但交聯(lián)的重要性已經(jīng)在眾多的通過腫瘤感染以及諸如OVA的確定抗原的模型中被確認。通過病原體-誘導的凋亡發(fā)起的交聯(lián)被用于描述通過病毒和細菌的感染。幾個病原體誘導宿主細胞中的凋亡,這表明這條便道路徑代表了傳染病中CD8的T細胞交聯(lián)的一個普遍的機制。在單核細胞增生利斯特菌感染中,已被證明中性粒細胞對李斯特菌-特異性 CD8 T細胞的交聯(lián)起著決定性的作用。此外,中性粒細胞是李斯特菌和其他致病入侵物的主要靶向細胞,并在感染后經(jīng)過細胞凋亡。因此,很有可能這條便道路徑對多種交聯(lián)條件有效。然而,凋亡小泡在這些模型不能被鑒定。不同的囊泡結(jié)構(gòu)也被描述為在T細胞交聯(lián)中的有效因子,稱為外切體。這些小泡代表分泌的溶酶體,是細胞結(jié)構(gòu)性釋放的，與細胞死亡無關(guān)。抗原的外切體轉(zhuǎn)移作為迂回路徑的一部分已被排除,因為在供體巨噬細胞中凋亡抑制完全消除CD8 T細胞的激活。CD8 T細胞被來自分支桿菌-感染的細胞產(chǎn)生IFN-g的凋亡小泡激活，這是控制結(jié)核病中心所在。值得注意的是,IFN-g刺激未感染巨噬細胞產(chǎn)生活性氮中間體為了有效地殺死細胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌。此外,我們檢測了凋亡小泡相關(guān)的抗原呈遞分子對T細胞的活化的影響。當小鼠通過來自缺乏MHC-I表面表達的 b2m-缺陷的巨噬細胞的小泡進行免疫,觀察到如通過抗原特異性增殖所示的適當?shù)腃D8T細胞的活化。因此,凋亡小泡中MHC-I分子的存在并非交聯(lián)所需要。在b2m KO-受體小鼠中來自野生型巨噬細胞的小泡誘導一定的,但是微弱的CD8 T細胞增殖,這表明在體內(nèi)發(fā)生MHC-I分子從凋亡小泡到受體APCs轉(zhuǎn)移。然而,微弱的T細胞反應(yīng)可能是由于MHC-I蛋白定量小轉(zhuǎn)移。為了驗證MHC-I穿透率,我們用凋亡小泡脈沖來自b2m-KO小鼠的DCs為隨后的T細胞體外刺激。事實上,為MHC-I-限制性抗原呈遞凋亡小泡重組了b2m-缺陷 APCs。此外,我們論證了抗原特異性CD4 T細胞被凋亡小泡活化。MHC-II-限制性 CD4 T細胞在預(yù)防結(jié)核病保護性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用,MHC-II-限制性 CD4 T細胞被外源性抗原通過核內(nèi)體途徑激活。在結(jié)核病中交聯(lián)對CD4 T細胞的活化同樣很重要,因為由于分支桿菌通過IFN-g信號傳導的干擾，被感染的巨噬細胞在MHC-II呈遞中受阻。最近的數(shù)據(jù)顯示,在體內(nèi)DCs負責CD8的T細胞的交聯(lián)。因為我們觀察到引流淋巴節(jié)點T細胞的活化,我們實驗性地決定抗原如何從外周被運送到淋巴組織。皮下注射熒光小泡后,隨后的DCs和巨噬細胞在引流淋巴節(jié)點的著色證明了小泡對DCs的專有定位。結(jié)在周邊組織，為后續(xù)的運送到引流淋巴，DCs對顆?？乖臄z取是與研究相符合的，該研究表明,為細胞-單獨運輸至次要淋巴器官，可溶性而不是微?？乖梢灾苯颖涣馨鸵?。此外,通過凋亡小泡對CCR7-缺陷動物的免疫沒有誘導CD8 T細胞的活化。CCR7表達于天然和記憶T細胞以及激活的DCs,被嚴格地要求歸巢到淋巴組織。CCL21和CCL19是CCR7的主要配體,生產(chǎn)于淋巴管和大量內(nèi)皮小靜脈的內(nèi)皮細胞以及基質(zhì)細胞和淋巴T細胞區(qū)的成熟DCs。我們的結(jié)果表明,DCs的歸巢是通過凋亡小泡的CD8 T細胞交聯(lián)的一個先決條件。通過化學抑制劑在兩個途徑中作用顯示，在受體DCs中凋亡小泡中含有抗原的加工主要涉及核內(nèi)體機理而不是蛋白酶體分裂機理。這與最新數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)對TAP的依賴性以及通過細胞相關(guān)抗原交聯(lián)的蛋白酶體形成對比?？梢栽O(shè)想獨立地來自于蛋白酶體的抗原加工的兩項。首先,在一個已經(jīng)處理的直接可供MHC-I粘附組成中，OVA可以出現(xiàn)在凋亡小泡中。我們認為這項不可能,因為我們通過凋亡小泡的免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)完整的OVA分子。更重要的是,最近的研究顯示交聯(lián)抗原的性質(zhì)由蛋白質(zhì)的成熟規(guī)定。比成熟蛋白質(zhì)半衰期短不穩(wěn)定的多肽不能夠交叉呈遞。第二,OVA可以被受體APCs處理獨立于蛋白酶體分裂。事實上,最近的實驗結(jié)果確認一個抗原的獨特的核內(nèi)體機制，用于交叉呈遞，通過組織蛋白酶S調(diào)解不涉及TAP和蛋白酶體。凋亡小泡代表膜結(jié)構(gòu),這應(yīng)該是被解體來作為為他們的抗原內(nèi)容物的進一步處理的前提。脂結(jié)合蛋白 A-D是脂質(zhì)傳遞蛋白存在于溶酶體由普通的前體或鞘脂激活蛋白原的裂解所產(chǎn)生。脂結(jié)合蛋白具在結(jié)合蛋白質(zhì)和脂質(zhì)中有雙重功能,它們是必要的酶類輔助因子涉及脂質(zhì)降解。此外,脂結(jié)合蛋白與磷脂膜結(jié)合，從而破壞溶酶