土壤酶活性及土壤微生物計(jì)數(shù)測(cè)定方法.doc

土壤酶活性及微生物測(cè)定土壤酶活性測(cè)定取樣工具及取樣方法在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。土樣在自然條件下烘干裝入袋中備用。所需試劑： 酒石酸鈉、NaCl、阿拉伯膠、納氏試劑、硫酸銨(NH4)2SO4、甲苯、苯磷酸二鈉、NaAc.3H2O、HAc、酚、鐵氰化鉀、4-氨基安替吡啉、碘化鉀、氯化汞、氫氧化鉀、配置方法：銨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取0.4717g(精確至0.0001g)干燥的硫酸銨(NH4)2SO4溶于水中，再加水稀釋至1000mL，此溶液1mL含100g N。往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml標(biāo)準(zhǔn)溶液并用蒸餾水稀釋至刻度，制備成的溶液在490nm下比色，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。醋酸緩沖液：PH5.0，NaAc.3H2O50g，溶于適量水中，加6mol/LHAc34ml，稀釋至500ml。硼酸緩沖液：PH9.0，80毫升0.05mol/l硼砂（Na2B4O7.10H2O）和0.2mol/l的硼酸混合。納氏試劑：將碘化鉀10g溶于10ml水中，邊攪拌邊慢慢地加入氯化汞飽和水溶液，直至生成的紅色沉淀不再溶解為止。加入氫氧化鉀30g并溶解之，再加入氯化汞飽和溶液1ml，加水至200ml。靜置，取上層清液，貯于棕色瓶中酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液：（1）原液1克酚溶于蒸餾水中定容至1升，溶液在暗色中穩(wěn)定，（2）工作液取50ml原液稀釋至1升（1ml含0.05mg酚）；分別向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并顯色定容（分別相當(dāng)于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚），待顏色穩(wěn)定后，570nm比色繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定方法磷酸酶活性測(cè)定一、 試驗(yàn)原理土壤中的磷，很大部分以有機(jī)磷化合物的形式存在。磷酸酶能促進(jìn)有機(jī)磷化合物的水解。實(shí)驗(yàn)表明，土壤微生物對(duì)于土壤含磷有機(jī)物質(zhì)的礦化起著主要作用；土壤的磷酸酶活性，在很大程度上取決于土壤的腐殖質(zhì)含量，活性磷量，能礦化有機(jī)磷化合物的微生物數(shù)量，植物類型等因素，土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力狀況。二、 實(shí)驗(yàn)儀器恒溫箱、分光光度計(jì)、三、 實(shí)驗(yàn)藥品甲苯、苯磷酸二鈉、酚、醋酸緩沖液、硼酸緩沖液、鐵氰化鉀、4-氨基安替吡啉、四、 實(shí)驗(yàn)步驟取5克過20目篩的風(fēng)干土樣于50毫升容量瓶中，用0.8(16滴)毫升甲苯處理，15分鐘后，加入5毫升苯磷酸二鈉溶液（6.75克苯磷酸二鈉溶于水，并稀釋至1升）和5毫升相應(yīng)的緩沖液（堿性磷酸酶用pH10的硼酸緩沖液，中性磷酸酶用pH7.0的檸檬酸緩沖液，酸性磷酸酶用pH5.0的醋酸緩沖液）。仔細(xì)混合后，將反應(yīng)物置于37攝氏度恒溫箱中培養(yǎng)12小時(shí)，然后用蒸餾水定容至刻度，搖勻過濾，用5毫升水代替基質(zhì)以設(shè)置對(duì)照。為了測(cè)定反應(yīng)混合物中的酚量，取1毫升濾液于100毫升容量瓶中，加5毫升硼酸緩沖液（pH9.0），再加入3毫升2.5%的鐵氰化鉀和3毫升0.5%的4-氨基安替吡啉，搖動(dòng)，溶液呈粉紅色，然后再加水定容，待顏色褪到穩(wěn)定時(shí)（約需2030分鐘），在分光光度計(jì)上于波長570納米處測(cè)定溶液的光密度，根據(jù)用酚制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出供試濾液中酚的含量。磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克數(shù)表示。脲酶活性測(cè)定一、 試驗(yàn)原理 土壤的脲酶活性，與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī)物質(zhì)含量、全氮和速效氮含量呈正相關(guān)。根基土壤可測(cè)得最大的脲酶活性，人們常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素狀況。二、 實(shí)驗(yàn)儀器錐形瓶、定性濾紙、震蕩器、分光光度計(jì)、1mm篩、三、 實(shí)驗(yàn)藥品酒石酸鈉、NaCl、阿拉伯膠、納氏試劑、銨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液、雙蒸水四、 實(shí)驗(yàn)步驟1、 準(zhǔn)確稱取10.00g過1mm篩的風(fēng)干土樣，置于150mL錐形瓶中，注入50mL20%的NaCl溶液，將瓶塞緊，在振蕩30min(120r/min)后，用定性濾紙過濾。2、 取20mL濾液于50mL容量瓶中，加雙蒸水稀釋至40mL左右，加2mL25%酒石酸鈉，充分搖動(dòng)靜置5min，使其與Cd，Mg離子絡(luò)合；3、 再加入10滴1%阿拉伯膠，搖動(dòng)后加2mL納氏試劑，邊加邊搖，定容至刻度，5min后用490nm比色，配制銨態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，比色后求算土壤脲酶活性。4、 結(jié)果分析滴定法測(cè)定過氧化氫酶活性一、 試驗(yàn)原理土壤的過氧化物酶活性，與土壤的呼吸強(qiáng)度和土壤微生物活動(dòng)相關(guān)，在一定程度上反映土壤微生物過程的強(qiáng)度。根際土壤的過氧化物酶活性，遠(yuǎn)較根際外土壤為高。有機(jī)質(zhì)含量高的土壤，過氧化氫酶活性較強(qiáng)。因此，土壤過氧化物酶的活性可以表征土壤總的生物學(xué)活性和肥力狀況。本試驗(yàn)采用滴定法測(cè)定過氧化氫酶活性，即通過定量滴定酶促反應(yīng)后剩余的過氧化氫量。二、 實(shí)驗(yàn)儀器致密濾紙、酸式滴定管、1mm篩三、 實(shí)驗(yàn)藥品雙蒸餾水、H2SO4、過氧化氫、KMnO4、四、 實(shí)驗(yàn)步驟準(zhǔn)確稱取5.00g過1mm篩的風(fēng)干土樣，置于150mL錐形瓶中，注入40mL雙蒸餾水和5mL0.3%過氧化氫，另設(shè)對(duì)照，塞緊瓶蓋，振蕩30min(120r/min)后，注入5mL1.5mol/LH2SO4終止反應(yīng)，用致密濾紙過濾，取濾液25mL，用0.1mol/LKMnO4滴定至微紅色。土壤的過氧化氫酶活性，用100g土重的0.1mol/LKMnO4毫升數(shù)表示。土壤微生物檢測(cè)一、取樣工具無菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。二、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品立即進(jìn)行處理或放在4冰箱中暫存。三、所需培養(yǎng)基及配置方法1、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌用） 牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂1520g，水1000ml，pH7.07.2，121滅菌20min。2、高氏（Gause）1號(hào)培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌用） 可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO40.01g，瓊脂20g，水1000ml，pH7.27.4。配制時(shí)，先用少量冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其它成分，溶化后，補(bǔ)足水分至1000ml。121滅菌20min。3、無氮培養(yǎng)基（自身固氮菌、鉀細(xì)菌） 甘露醇（或葡萄糖）10g，KH2PO4 0.2g，MgSO47H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO42H2O 0.2g，CaCO3 5g，蒸餾水1000ml，pH7.07.2，113滅菌30min。4、馬丁氏（Martin）瓊脂培養(yǎng)基（分離真菌用） 葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO47H2O 0.5g，1/3000孟加拉紅（rosebengal，玫瑰紅水溶液）100ml，瓊脂1520g，pH自然，蒸餾水800ml，121度滅菌30min。臨用前加入0.03%鏈霉稀釋液10ml，使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30g。5、 蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 蛋白胨5克、KH2PO40.5g，NaCl 0.25g，瓊脂18克，MgSO47H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4 0.01克，水1000毫升，pH7.2，一氣壓滅菌20分鐘滅菌。四、所需藥品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、甘露醇（或葡萄糖）、CaSO42H2O、CaCO3、孟加拉紅、鏈霉素五、檢測(cè)方法土壤中放線菌的檢測(cè)一、 試驗(yàn)原理應(yīng)用稀釋平板法從土壤中檢測(cè)放線菌二、 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑7個(gè)土樣，3個(gè)重復(fù)，共需252個(gè)滅菌培養(yǎng)皿；滅菌試管、滅菌吸管、滅菌三角燒瓶高氏一號(hào)培養(yǎng)基可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO40.01g，瓊脂20g，水1000ml，pH7.27.4。配制時(shí)，先用少量冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其它成分，溶化后，補(bǔ)足水分至1000ml。121滅菌20min。三、 實(shí)驗(yàn)步驟1、 在超凈工作臺(tái)中，無菌稱取所取土樣10g，分別溶于裝90ml無菌水及玻璃珠三角瓶中，于搖床震蕩30分鐘。用移液管分別無菌吸取各樣品土壤懸液1ml移入裝9ml無菌水試管中，此即為10-2稀釋的土壤懸液。如此操作，一直到10-10。稀釋。(另外，要知道所稱土樣的含水量)2、 倒人45恒溫水浴的滅菌高氏l號(hào)培養(yǎng)基，水平放置，凝固待用；分別無菌吸取各樣品10-4、10-5、10-6、10-7稀釋液，加入滅菌平皿中(每稀釋度3皿，每皿lml)，用玻璃涂布棒涂抹均勻，將平皿倒置于28恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。放線菌的培養(yǎng)時(shí)間較長，故制平板的培養(yǎng)基用量可適當(dāng)增多3、 培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平皿，選出土樣適合菌落計(jì)數(shù)的稀釋度，算出同一稀釋度3個(gè)平皿上的菌落平均數(shù)（選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的），并按下列公式進(jìn)行計(jì)算，最后換算成每克干土壤中菌落形成單位。 每克土壤中菌落形成單位同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)。土壤中細(xì)菌的檢測(cè)一、 試驗(yàn)原理應(yīng)用稀釋平板法從土壤中分離細(xì)菌二、 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑7個(gè)土樣，3個(gè)重復(fù)，共需252個(gè)滅菌培養(yǎng)皿；滅菌試管、滅菌吸管、滅菌三角燒瓶牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂1520g，水1000ml，pH7.07.2，121滅菌20min。三、 實(shí)驗(yàn)步驟1、 在超凈工作臺(tái)中，無菌稱取所取土樣10 g，分別溶于裝90ml無菌水及玻璃珠三角瓶中，于搖床震蕩30分鐘。用移液管分別無菌吸取各樣品土壤懸液1ml移入裝9ml無菌水試管中，此即為10-2稀釋的土壤懸液。如此操作，一直到10-10。稀釋。(另外，要知道所稱土樣的含水量)2、分別無菌吸取各樣品10-5、10-6、10-7、10-8稀釋液，加入滅菌平皿中(每稀釋度3皿，每皿lml)，倒人45恒溫水浴的滅菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，混勻。（稀釋倍數(shù)是情況而定）3、待培養(yǎng)基凝固后，將平皿倒置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、培養(yǎng)24h后，取出培養(yǎng)平皿，選出土樣適合菌落計(jì)數(shù)的稀釋度，算出同一稀釋度3個(gè)平皿上的菌落平均數(shù)（選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的），并按下列公式進(jìn)行計(jì)算，最后換算成每克干土壤中菌落形成單位。 每克土壤中菌落形成單位同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)。土壤中真菌的檢測(cè)一、試驗(yàn)原理應(yīng)用稀釋平板法從土壤中檢測(cè)真菌二、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑7個(gè)土樣，3個(gè)重復(fù)，共需252個(gè)滅菌培養(yǎng)皿；滅菌試管、滅菌吸管、滅菌三角燒瓶、滅菌水馬丁氏（Martin）瓊脂培養(yǎng)基（分離真菌用） 葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO47H2O 0.5g，1/3000孟加拉紅（rose bengal，玫瑰紅水溶液）100ml，瓊脂1520g，pH自然，蒸餾水800ml，121度滅菌30min。臨用前加入0.03%鏈霉稀釋液10ml，使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30g。（鏈霉素在培養(yǎng)基融化并冷卻至50攝氏度時(shí)加入，用剩的鏈霉素在冰箱可保存4個(gè)月，但每過一月，在1升培養(yǎng)基中需多加0.1ml）。三、實(shí)驗(yàn)步驟1、在超凈工作臺(tái)中，無菌稱取所取土樣10g，分別溶于裝90ml無菌水及玻璃珠三角瓶中，于搖床震蕩30分鐘。用移液管分別無菌吸取各樣品土壤懸液1ml移入裝9ml無菌水試管中，此即為10-2稀釋的土壤懸液。如此操作，一直到10-10。稀釋。(另外，要知道所稱土樣的含水量)2、分別無菌吸取各樣品10-2、10-3、10-4、10-5稀釋液，加入滅菌平皿中(每稀釋度3皿，每皿lml)，倒人45恒溫水浴的滅菌馬丁氏（Martin）瓊脂培養(yǎng)基，混勻。（稀釋倍數(shù)是情況而定）3、待培養(yǎng)基凝固后，將平皿倒置于28恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平皿，選出土樣適合菌落計(jì)數(shù)的稀釋度，算出同一稀釋度3個(gè)平皿上的菌落平均數(shù)（選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的），并按下列公式進(jìn)行計(jì)算，最后換算成每克干土壤中菌落形成單位。 每克土壤中菌落形成單位同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)。土壤中自身固氮菌的檢測(cè)一、試驗(yàn)原理應(yīng)用稀釋平板法從土壤中檢測(cè)自身固氮菌。二、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑7個(gè)土樣，3個(gè)重復(fù)，共需252個(gè)滅菌培養(yǎng)皿；滅菌試管、滅菌吸管、滅菌三角燒瓶、滅菌水無氮培養(yǎng)基甘露醇（或葡萄糖）10g，KH2PO4 0.2g，MgSO47H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO42H2O 5g，CaCO3 1000ml，蒸餾水1000ml，pH7.07.2，113滅菌30min。三、實(shí)驗(yàn)步驟1、在超凈工作臺(tái)中，無菌稱取所取土樣10 g，分別溶于裝90ml無菌水及玻璃珠三角瓶中，于搖床震蕩30分鐘。用移液管分別無菌吸取各樣品土壤懸液1ml移入裝9ml無菌水試管中，此即為10-2稀釋的土壤懸液。如此操作，一直到10-10。稀釋。(另外，要知道所稱土樣的含水量)2、分別無菌吸取各樣品10-5、10-6、10-7、10-8稀釋液，加入滅菌平皿中(每稀釋度3皿，每皿lml)，倒人45恒溫水浴的滅菌無氮培養(yǎng)基，混勻。（稀釋倍數(shù)視情況而定）3、待培養(yǎng)基凝固后，將平皿倒置于28恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平皿，選出土樣適合菌落計(jì)數(shù)的稀釋度，算出同一稀釋度3個(gè)平皿上的菌落平均數(shù)（選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的），并按下列公式進(jìn)行計(jì)算，最后換算成每克干土壤中菌落形成單位。 每克土壤中菌落形成單位同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)。土壤中氨化細(xì)菌的檢測(cè)一、試驗(yàn)原理應(yīng)用稀釋平板法從土壤中檢測(cè)自身固氮菌。二、實(shí)驗(yàn)儀器及試劑7個(gè)土樣，3個(gè)重復(fù)，共需252個(gè)滅菌培養(yǎng)皿；滅菌試管、滅菌吸管、滅菌三角燒瓶、滅菌水蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 蛋白胨5克、KH2PO40.5g，NaCl 0.25g，瓊脂18克，MgSO47H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4 0.01克，水1000毫升，pH7.2，一氣壓滅菌20分鐘滅菌。三、實(shí)驗(yàn)步驟1、在超凈工作臺(tái)中，無菌稱取所取土樣10g，分別溶于裝90ml無菌水及玻璃珠三角瓶中，于搖床震蕩30分鐘。用移液管分別無菌吸取各樣品土壤懸液1ml移入裝9ml無菌水試管中，此即為10-2稀釋的土壤懸液。如此操作，一直到10-10。稀釋。(另外，要知道所稱土樣的含水量)2、分別無菌吸取各樣品10-6、10-7、10-8、10-9稀釋液，加入滅菌平皿中(每稀釋度3皿，每皿lml)，倒人4