吉大畜牧院《基因工程》復習資料.doc

第一章 緒論1.基因工程的定義：在體外對不同生物的遺傳物質（基因）進行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細菌質粒、病毒或噬菌體DNA)，轉入微生物、植物或動物細胞內進行無性繁殖，并表達出基因產(chǎn)物。 2.基因工程理論上的三大發(fā)現(xiàn)和技術上的三大發(fā)現(xiàn)3.基因工程的基本步驟（1）目的基因的獲取：從復雜的生物基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。 （2）重組體的制備：將目的基因的DNA片斷插入到能自我復制并帶有選擇性標記（抗菌素抗性）的載體分子上。 （3）重組體的轉化：將重組體（載體）轉入適當?shù)氖荏w細胞中。 （4）克隆鑒定：挑選轉化成功的細胞克?。ê心康幕颍?。 （5）目的基因表達：使導入寄主細胞的目的基因表達出我們所需要的基因產(chǎn)物。 4.基因工程的意義（1）基因工程在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應用：提高植物的光合作用率；提高豆科植物的固氮效率；轉基因植物；轉基因動物。（2）基因工程在工業(yè)中的應用：1）纖維素的開發(fā)利用：克隆各種參與纖維素降解的酶的基因，導入釀酒酵母，就可能利用廉價的纖維素來生產(chǎn)葡萄糖，發(fā)酵成酒。 2）釀酒工業(yè)：用外源基因改造釀酒酵母，產(chǎn)生優(yōu)質的啤酒?；蛴冕劸平湍干a(chǎn)蛋白質等。 （3）基因工程在醫(yī)藥上的應用：用微生物生產(chǎn)藥物； 用轉基因植物或動物生產(chǎn)藥物；設計高效高特異性的生物制劑-疫苗；制造新型疫苗；基因診斷；法醫(yī)鑒定；基因治療。（4）基因工程在環(huán)境保護中的作用：1）檢測水污染：用重組細菌或轉基因魚等檢測水污染2）生物降解：用帶有重組質粒的“超級菌”分解油（烷烴類）、有機農(nóng)藥污染。（5）基因工程商業(yè)化的發(fā)展第二章 基因工程主要技術原理1質粒和基因組DNA的提取方法與純化步驟，主要試劑是什么質粒的提取和純化方法最常用的為堿抽提法：原理：閉合環(huán)狀的質粒DNA，在變性后不會分離，復性快。染色體線性DNA和或有缺口的質粒DNA變性后雙鏈分離，難以復性而形成纏繞的結構，與蛋白質-SDS復合物結合在一起，在離心的時候沉淀下去。步驟：1）溶菌：溶液I（50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA,4-5mg/ml 溶菌酶） 2）破膜：溶液II（0.2N NaOH 1.0%SDS） 3）中和：溶液III（3M醋酸鈉 pH4.8） 4）離心 5）轉移：將上清轉移到一個新的離心管中 6）抽提：酚-氯仿抽提，酚/氯仿/異戊醇25/24/1 7）沉淀：用0.6倍體積的異戊醇或2倍體積的乙醇（可以加入1/10體積的3M醋酸銨輔助沉淀）基因組DNA的提取純化方法（1） 細菌基因組DNA的制備細胞裂解（10%SDS和蛋白酶K。SDS是陰離子型去垢劑（detergent），可以使細胞膜崩解。）DNA純化（CTAB(十六烷基三甲基溴化銨) 除去多糖，酚-氯仿-異戊醇除去蛋白。）沉淀DNA（0.6倍體積的異丙醇或2倍乙醇（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）（2） 哺乳動物細胞基因組DNA的抽提組織粉碎（動物組織剪成小塊，置液氮中凍結后研磨成細粉末；組織培養(yǎng)的細胞用胰酶消化松散后直接使用。）細胞裂解（0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50溫育。）沉淀DNA（用2倍體積的無水乙醇或0.6倍體積的異丙醇。（加入1/10體積的3M醋酸氨可以輔助沉淀）。）（3） 從植物組織中制備 DNA組織粉碎（用液氮冷凍后研磨成細粉末。）細胞裂解（用2%CTAB/2-ME (十六烷基三甲基溴化銨/2巰基乙醇）或1% SDS和蛋白酶K。 65 溫育。）沉淀DNA（用0.6倍體積的異丙醇（-20）。（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）2.DNA的定量和純度測定方法（1）紫外光譜法： DNA在260nm波長處有特異的紫外吸收峰，蛋白質在280nm波長處有特異的紫外吸收峰 ，對于純DNA： OD260/OD280 =1.8，若低于1.8說明有蛋白質雜質（2）瓊脂糖凝膠電泳估計溴化乙錠（EB）能插入DNA分子中。與已知濃度的DNA電泳帶熒光強度對比，就可以估計出DNA含量。3.瓊脂糖凝膠電泳基本原理及應用原理：將某種分子放到特定的電場中，它就會以一定的速度向適當?shù)碾姌O移動。某物質在電場作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場強度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質的粘度系數(shù)等）。在生理條件下，核酸分子中的磷酸基團是離子化的，所以，DNA和RNA實際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場中，它就會由負極正極移動。相同分子量的DNA：閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快，線性分子次之，伸展開放開環(huán)狀最慢。瓊脂糖凝膠電泳的應用：用于對DNA分子量的估計，DNA片段的分離和回收。4.聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體(Acrylamide)和交聯(lián)劑N1，N1-甲叉雙丙烯酰胺(N1，N1- methylene bisacrylamide)在催化劑的作用下聚合而成。引發(fā)劑：過硫酸銨，加速劑：TEMED。電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子在前，大分子滯后。電泳凝膠相當于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒。凝膠濃度越大，空隙越小。電泳后的凝膠徑考馬斯亮籃染色、脫色后的凝膠照片。5.核酸雜交原理、類型及應用原理：核酸分子雜交技術是依據(jù)核酸分子堿基互補、變性和復性原理，用標記的已知序列的單鏈核酸片段(DNA或RNA)作為探針,與未知的核酸片段進行雜交, 形成異源性雜交分子，然后通過標記信號的檢測，鑒定樣本中是否存在與探針互補的靶序列DNA。包括：DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交及蛋白雜交等。特點：特異性高；靈敏度高；定位準確應用：基因克隆的篩選；酶切圖譜制作；基因組中特定基因序列的定量和定性檢測； 基因表達的分析；基因突變分析；疾病的診斷、微生物病原體檢測。變性：在某些理化因素的作用下，核酸雙鏈分子堿基對的氫鍵斷裂，疏水作用被破壞，雙鏈螺旋或發(fā)夾結構被拆開，有規(guī)則的空間結構被破壞，形成單鏈分子，稱為核酸的變性。A260值達到最大值1/2時的溫度稱為解鏈溫度或熔解溫度（melting temperature,Tm)，此時50%的DNA分子發(fā)生了變性。Tm與核酸的G、C含量有關。Tm=（G+C）%0.41+69.3Tm也受介質中離子強度的影響，離子強度低，熔解溫度也低。復性：在適當條件下，變性DNA的兩條互補單鏈重新結合，形成雙鏈的過程稱為復性。在熱變性后，當溫度緩慢冷卻至比Tm值低20-30時，變性的單鏈DNA即可恢復雙鏈螺旋結構，這樣的復性又稱為退火。預雜交：為了減少探針與廣泛存在的非互補核酸的非特異性結合，在雜交前可用封閉物將這些非特異位點封閉。在雜前的這些處理過程稱為預雜交類型：根據(jù)核酸的來源、種類和形式分為Southern blot，Northern blot，菌落原位雜交，斑點雜交，組織原位雜交Southern blot：DNA分子限制性酶切為限制片段瓊脂糖凝膠電泳NaOH變性轉膜固定雜交顯影Northern blot：提取 T、Cell 總 RNA提純分離mRNA瓊脂糖凝膠電泳分離RNA轉移至硝酸纖維素膜雜交檢測斑點雜交：其原理與步驟與Southern印跡雜交相似，所不同的是不進行核酸的酶解和電泳分離，直接將變性的DNA或RNA加到固相載體上。菌落/噬菌斑原位雜交：直接將菌落(噬菌斑)原位轉移到固相載體上，不必進行核酸的分離純化、酶解和電泳分離。溶菌(噬菌斑)變性后直接進行特異核酸（DNA或RNA）分子的雜交技術，結果直接找出相應的陽性重組子菌落(噬菌斑) 。組織/細胞原位雜交：用標記的已知核酸序列為探針，使其與細胞、組織、染色體或切片中核酸進行雜交檢測的方法稱為原位雜交。原位雜交的類型：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA雜交。 基因芯片：基因芯片是指將大量探針分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布進而獲取樣品中靶分子的數(shù)量和序列信息。 6.PCR概念、PCR技術的基本原理及特點、引物設計要求及常見問題PCR概念：應用聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術，在體外特異性地擴增某個基因。PCR技術的基本原理：類似于DNA的 天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成。變性：升高溫度使模板DNA變性、雙鏈分開。退火：再降低溫度使引物與模板DNA配對互補結合。延伸：然后升溫到聚合酶反應適宜的溫度，此時在聚合酶催化下，從引物3羥基端開始，與模板DNA上的堿基配對逐個加上核苷酸，合成新的DNA鏈。循環(huán)：其后再按高溫變性、低溫退火、適溫合成三步反復循環(huán)，新合成的DNA在下一循環(huán)中又作為模板使用，每循環(huán)一次，合成的目的序列擴增一倍。 經(jīng)過多次循環(huán)使DNA含量顯著提高。特點：靈敏度高、特異性強、快速檢測、定量準確、重復性好特異性強 PCR反應的特異性決定因素為： 引物與模板DNA特異正確的結合； 堿基配對原則； Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性； 靶基因的特異性與保守性。引物設計要求： 引物長度（length）: 2030bp G+C含量以40-60%為宜 兩引物間不能有互補序列，尤其是3端 引物的堿基順序不應與非擴增區(qū)域有同源性 引物的3末端堿基一定要與模板DNA配對 可以在5末端加上限制性內切酶位點或起始密碼 解鏈溫度(Tm)：兩引物間相差不大于5 引物內部不能有大于3bp的反向重復序列或自身互補序列存在 ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列常見問題：（1） 假陰性原因：模板質量不好；酶失活；引物特異性差或質量問題；Mg2+濃度過高 對策：重新準備模板；更換酶并避免反復凍融；重新設計引物并分裝；降低Mg2+濃度（2） 假陽性原因：引物設計不合適 ；靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染 對策：重新設計引物；改進操作，避免污染 （3） 出現(xiàn)非特異性擴增帶原因：是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體 ；是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關 ；酶的質和量，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增 對策：重新設計引 物，降低引物量；適當提高退火溫度，減少循環(huán)次數(shù) ；減低酶量或調換另一來源的酶（4） 出現(xiàn)偏狀拖帶或涂抹帶原因：酶量過多或酶的質量差；dNTP濃度過高；Mg2+濃度過高；退火溫度過低；循環(huán)次數(shù)過多引起 對策：減少酶量，或換另一種酶；減少dNTP的濃度；適當降低Mg2+濃度；提高退火溫度；減少循環(huán)次數(shù) 。7. RT-PCR、DD-PCR、PCR-SSCP、實時熒光定量PCR原理及應用RT-PCR：RT-PCR是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先經(jīng)反轉錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。該技術主要用于：分析基因的轉錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統(tǒng)。DD-PCR：利用T12MN(M為A、G、C，N為A、T、G、C) 為錨定引物，逆轉錄真核生物細胞中全部表達的mRNA，通過PCR擴增的方法，轉換成cDNA雙鏈，再利用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，將有差異的片段分開，篩選出目的基因。用于基因表達，基因的鑒定物克隆，分離差異表達基因。PCR-SSCP：單鏈PCR構象的多態(tài)性，單鏈DNA片段呈復雜的空間折疊構象，這種立體結構主要由其內部堿基配對等分子內相互作用力來維持的，當有一個堿基發(fā)生改變時，會影響其空間構象，使構象發(fā)生改變，空間構象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同，因為，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳可以非常敏銳的將構象有差異的分子分離開。用于進行DNA多態(tài)性的分析，是一種快速、簡便、靈敏的檢測基因突變、短序列的缺失和插入的方法。 實時熒光定量PCR：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實現(xiàn)了實時監(jiān)測整個PCR進程，對起始模板進行定量分析的方法。用于DNA或RNA的絕對定量分析，基因表達差異分析，基因分型等。8. RACE原理及應用RACE：rapid amplification of cDNA ends以mRNA為模板，反轉錄合成cDNA的第一條鏈，然后用PCR技術擴增出從某個特定位點到3或5端之間的未知核苷酸序列，因此分為3RACE和5RACE（特定位點是指cDNA內位點，3或5端是針對mRNA而言）。3RACE：擴增特定位點到相應mRNA3端的序列，可利用mRNA的polyA尾和GSP進行PCR. 5RACE:擴增特定位點到相應于mRNA5端的序列，通過對cDNA第一條鏈同聚物加尾，再利用與同聚物配對的引物和GSP進行PCR.應用：獲得完整的cDNA的3或5端序列。9Sanger雙脫氧鏈終止法、Maxam-Gilbert化學修飾法的原理Sanger雙脫氧鏈終止法原理：DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準確的DNA互補鏈。該酶能夠用2，3-雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3-末端，從而終止其延伸反應。在DNA測序反應中，加入模板DNA，引物（特異性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一種ddNTP。常用Klenow大片段，無53外切酶活性。Maxam-Gilbert化學修飾法的原理：用化學試劑處理具有末端放射性標記的DNA片段,在A、G、C、T處特定地裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈（等差數(shù)列 n=1），經(jīng)過PAGE和放射自顯影后，可以直接讀出DNA的順序。10. 雜交測序的原理與過程原理：SHB將寡核苷酸探針固定到芯片上，待測樣品中的標記DNA靶標與之配對，當配對的DNA有少至1個堿基的差異時，其Tm值的改變影響到雜交時的熒光信號值，從而可以判斷待測樣品與芯片上哪個片段結合，便可知待測的DNA序列上特定位點的堿基特征。11. 酵母雙雜交系統(tǒng)原理、應用原理：轉錄激活因子結構域功能獨立性。真核生物的轉錄因子大多是由兩個結構上分開、功能上獨立的結構域組成的。酵母的轉錄激活因子 GAL4 的N端1-147aa是DNA結合域（BD），其C端768-881aa是轉錄激活域（AD）。BD可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)結合，而AD則能激活UAS下游的基因進行轉錄。但是，單獨的BD不能激活基因轉錄，單獨的AD也不能激活UAS的下游基因，它們之間只有通過某種方式結合在一起才具有完整的轉錄激活因子的功能。若用基因工程的方法，將GAL4 AD和BD分別克隆到不同的載體上，導入同一細胞株中表達。應用：1）已知蛋白之間相互作用的檢測：2）蛋白質的功能域研究：通過對其中某一個蛋白質作缺失或定點突變，再用此系統(tǒng)檢測是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關鍵氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質基因與BD基因構建成“誘餌”表達質粒，將某一器官或組織的cDNA文庫與AD基因構建成“獵物”基因庫，共轉化酵母細胞，可篩到與感興趣蛋白質相互作用的蛋白質的cDNA序列，并推測其蛋白質序列。 第三章 基因工程的酶學基礎1常用工具酶種類工具酶：用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、修飾、反轉錄等有關的各種酶系統(tǒng)。限制性核酸內切酶切割DNADNA連接酶生成3- 5磷酸二酯鍵DNA聚合酶探針標記、補平3末端反轉錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探針標記末端轉移酶3末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基2. 核酸內切限制酶種類使用時的注意事項 型限制性內切酶 識別位點序列：未甲基化修飾的特異序列。切割位點：在距離特異性識別位點約1000-1500bp處隨即切開一條單鏈。在基因工程操作中的用途不大。 型限制性內切酶識別位點序列：未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列），與DNA來源無關。切割位點：就是識別位點處。切開雙鏈DNA，形成粘性末端（sticky end）或平（齊）末端（blunt end）。粘性末端分為5端凸出（如EcoRI切點）和3端凸出（如PstI切點）。在基因工程操作過程中作用廣泛。、特殊性質的II型限制酶：同裂酶，同尾酶,可變酶（識別順序中的一個或幾個堿基是可變的，并且識別順序往往超過6個堿基對。） 型限制性內切酶 在完全肯定的位點切割DNA，距識別序列下游24-26bp 處,但反應需要ATP、Mg2+ 和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。（EcoP1，EcoP15）3. 限制與修飾Luria和Human發(fā)現(xiàn)細菌能將外來的DNA片段在某些專一位點上切斷，從而保證其不被外來噬菌體所感染，而其自身的DNA由于被一種特殊的酶所修飾（甲基化）而得以保護，這種寄主控制的現(xiàn)象叫做限制修飾(簡稱R/M體系)。4. 同裂酶、同尾酶同裂酶（isoschizomer）又稱異源同序酶或異源同工酶。是從不同的原核生物中分離出來的不同的酶，能識別相同序列，在切割DNA時，其切割位點可以是相同的，也可以是不同的。 包括同識同切（如AhaIII&DraI）同識異切（如KpnI&Asp718I）。同尾酶：指來源不同，但識別與切割順序有一定的相關性的一類酶。它們作用后產(chǎn)生相同的粘性末端（如Mbo I&BamH I&Bgl II）。5. 雙酶切策略 選用都合適的Buffer 對鹽濃度要求不同的酶，使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時酶解 低鹽酶先切，然后補加鹽，高鹽酶再切 一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切注意事項 a. 取少量酶 (方法 or 稀釋 ) b. 最后加酶、盡快操作 c. 減少反應體積d. 反應時間的延長 e. 分裝（對于多個反應） 反應溫度 大多數(shù)為37；一部分為50-65 少數(shù)25-30；高溫作用酶于37時活性多數(shù)10-50%反應時間 1hr or more 許多酶延長其反應時間可減少酶的用量 反應終止EDTA 終10mM；加熱（37 酶 65 20min， otherwise 80 20min）6. 星活性、引起星活性的因素星活性（star activity）：在極端非標準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星活性。（非特異性切割）引起星活性的因素 高濃度甘油（5%） 酶過量（100U/mg） 低離子強度（pH8.0) 有機溶劑PMSO(二甲基亞砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）、sulphalane 用其它二價陽離子代替Mg2+ Mn2+，Cu2+，Co2+, Zn2+ 7. 連接酶的使用時的注意事項；DNA 連接酶：能夠將 DNA 鏈上彼此相鄰的 3-OH 和 5-P，在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。而且被連接的 DNA 鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。 兩種DNA連接酶 大腸桿菌連接酶：粘性末端，平末端（效率低） T4噬菌體的連接酶：粘性末端，平末端連接條件 必須是兩條雙鏈DNA。 DNA3端有游離的-OH，5端有一個磷酸基團 （P）。 需要能量：動物或噬菌體中是ATP，大腸桿菌中是NAD+ 。連接反應的溫度：連接缺口的溫度：37C 連接粘性末端的最佳溫度： 415C 實用溫度：一般采用 14-16C影響連接反應的因素：1. 插入片段與載體的濃度比例 310倍，增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。2. 末端種類3. 反應體系 平末端DNA分子的連接反應中，最適12個單位。 粘性末端DNA片斷之間的連接，酶濃度0.1個單位。 ATP的用量10mol1mmol/L之間 8. 粘性末端DNA片段的連接、平末端DNA片段的連接方法；粘性末端DNA片段的連接：待連接的兩個DNA片段的末端如果是用同一種限制性核酸內切酶切割的，連接后仍保留原限制性核酸內切酶的識別序列。如果是用兩種同尾酶切割的，雖然產(chǎn)生相同的互補粘性末端，可以后效的進行連接，但是獲得的重組DNA分子消失了原來用于切割的那兩種限制性內切酶的識別序列。連接過程為：在滅菌的Eppendorf管中依次加入7l ddH2O ,2l T4 DNA 連接酶反應緩沖液或E.coli DNA連接酶反應緩沖液，10l 兩種待連接的DNA片段，最后加入1l T4 DNA 連接酶或E.coli DNA連接酶，總體積為20l。充分混勻后12C放置過夜，然后檢測。平末端DNA片段的連接：待連接的兩個DNA片段的末端如果是用同一種限制性核酸內切酶切割的，連接后仍保留原限制性核酸內切酶的識別序列，有時還出現(xiàn)另一種新的限制性內核酸內切酶識別序列。如果用兩種不同的限制性核酸內切酶切割后產(chǎn)生的平末端DNA片段之間進行連接，連接后的DNA分子失去了那兩種酶是識別序列。具平末端的DNA片段之間連接反應的操作過程基本上同具粘性末端DNA片段之間連接的操作過程，但是一般只用T4 DNA連接酶，且需要加大酶用量。 加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接） 加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會 加入10% PEG8000，促進大分子之間的有效作用 加入單價陽離子（NaCl），最終濃度150-200 mM 9. 大腸桿菌DNA聚合酶、Klenow fragment、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、修飾過的T7 DNA聚合酶、逆轉錄酶、Taq DNA 聚合酶主要應用以上七種都屬于DNA聚合酶：把脫氧核糖核苷酸連續(xù)加到雙鏈DNA分子引物鏈的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離。大腸桿菌DNA聚合酶： 性質 一條單鏈多肽 (109kDa) 53外切酶活性位于N端。 53 DNA 聚合酶活性 35 核酸外切酶活性 用途 主要用來制備帶放射性標記的DNA探針。 方法：切口平移法標記DNA (nick translation )Klenow fragment：性質：DNA聚合酶I的酶解片段 具有53 DNA 聚合酶活性和35 核酸外切酶活性（弱），失去了53外切酶活性。用途：3端補平；DNA 3末端標記；cDNA第二條鏈的合成。T4 DNA聚合酶 性質 來源：T4噬菌體感染的大腸桿菌細胞 114kD 酶活性：有53聚合酶活性和35外切酶活性 （降解單鏈更快） 用途 補平3隱蔽末端 DNA 3末端標記T7 DNA聚合酶來源 T7噬菌體感染的大腸桿菌細胞，由兩個亞基組成： 大亞基：有53聚合酶和35外切酶活性； 小亞基：硫氧還蛋白，可增加大亞基對模板的親 和性。用途 長模板的引物延伸 進行末端標記：取代合成法標記3末端。 與T4 DNA聚合酶相同。 補平隱蔽末端：合成補平3隱蔽末端； 水解修平3突出末端。修飾過的T7 DNA聚合酶 T7DNA聚合酶的化學修飾 去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提 高了3倍。 修飾后的T7 DNA聚合酶的用途 DNA測序：雙脫氧法。 標記DNA 3隱蔽末端 更有效地補平末端逆轉錄酶依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導的DNA聚合酶）。來源：RNA腫瘤病毒，普遍使用的是鳥類骨髓母細胞瘤病毒（AMV）用途：合成cDNA:以oligo dT為引物（與mRNA的polyA尾互補結合）Taq DNA 聚合酶：是從Thermss aquaticas 菌提取的熱穩(wěn)定性酶，分子量大約為94KDa，這種酶的天然形式可在74C復制DNA，在95C的半衰期為40分鐘。Taq DNA 聚合酶在鎂離子存在的條件下可催化核苷酸沿5-3方向發(fā)生聚合反應，形成雙鏈DNA，同時還有5-3外切酶活性?？捎糜赑CR反應，和較高溫度條件下的引物延伸反應。10末端脫氧核苷酰轉移酶、T4磷酸激酶、堿性磷酸酶、DNA及RNA的修飾酶主要應用。末端脫氧核苷酰轉移酶（TdT） 來源：小牛胸腺。 功能：在二價陽離子存在下， 53DNA聚合酶活性。 T, C 首選 Co2+ A, G首選Mg2+ 特點： 需要3OH 不需要模板 底物可以是單鏈DNA、3-OH突出的雙鏈DNA、 平末端在Co2+代替Mg2+下也可以 隨機添加dNTPs，如果只有一種dNTP，就添加 上同聚物用于：在3末端添加同聚物，形成粘性末端，用于DNA連接T4磷酸激酶來源：T4感染大腸桿菌細胞，多種哺乳動物細胞中也發(fā)現(xiàn) 這種酶。功能： g 磷酸從ATP轉給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5-OH端，不 論5-OH端突出與否。 如果ATP的 g 磷酸帶有32P標記，就會被轉移到DNA的5端。*：高濃度ATP發(fā)揮最佳活性，NH4+強烈抑制劑用途； DNA 5-OH端磷酸化、標記DNA的5端。5凸出單鏈效率高堿性磷酸酶 種類（1）細菌性堿性磷酸酶 Bacterial alkaline phosphatase， BAP 從大腸桿菌中分離出來，具有抗熱性。（2）小牛腸堿性磷酸酶 Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP 從小牛腸中純化出來，SDS中加熱68可完全失活或 通過酚抽提而并行失活。 CIP比BAP更常用，活性比BAP高10-20倍 功能 催化脫掉DNA（或RNA）5端的磷酸根防止單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接的現(xiàn)象。核酸外切酶包括單鏈DNA外切酶 ，雙鏈核酸外切酶雙鏈核酸外切酶（1） 核酸外切酶III：在DNA雙鏈的末端產(chǎn)生出單鏈區(qū)域（2） 核酸外切酶：使DNA雙鏈變成單鏈（短）。單鏈DNA內切酶A.S1核酸酶（1）定位RNA。 （2）用mRNA測定基因中的外顯子序列（3）降解限制酶切形成的單鏈突出端 （4）切掉雙鏈核酸中的單鏈區(qū)BBal 31核酸酶降解雙鏈DNA或其上的單鏈缺口、未配對的單鏈區(qū)域。C 綠豆核酸酶與Sl nuclease 相似,但比Sl更溫和，在大切口上才切割,可使DNA突出端變成平端 D 核糖核酸酶A(RNase A) 除去DNA樣品中的RNA；除去DNA:RNA中未雜交的RNA區(qū)確定雜交體DNA的RNA中單突變的位置E 核糖核酸酶H(RNase H) 在cDNA克隆，合成第二鍵之前去除RNA；用脫氧核苷酸指導在特異位點切割RNA分析體外多聚腺嘌呤反應的產(chǎn)物，在與Olig(T) or ploy (dT)雜交后，去掉poly(A)尾 F DNase I 切口平移標記，在dsDNA上隨機產(chǎn)生切口；在閉環(huán)DNA上引入單切口以使分子截短（在亞硫酸氧鹽介導 的誘變前）；建立隨機克隆，以便安插在M13 phage上測序分析 ；蛋白:DNA復合物（DNA酶足跡法）；除去RNA樣品中的DNA（RNase-free）RNA聚合酶(RNA polymerase) 體外： 將這些RNA聚合酶特異性的啟動子安裝在載體,如pGEM-3Z載體(2.74kb,p13)中，用于體外轉錄（合成）與外源DNA同源的RNA， 從而用作雜交探針，體外翻譯系統(tǒng)中的mRNA，體外剪接反應的底物 體內：用于表達外源基因 第四章 基因克隆的載體1.載體的概念在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進入受體細胞的DNA分子叫載體2. 理想載體至少必備的條件能在宿主細胞中自主復制 容易進入宿主細胞 容易插入外來核酸片段 容易從宿主細胞中分離純化，便于重組操作 具有合適的篩選標記具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）3. 目前的主要載體種類質粒（Plasmid）、單鏈DNA噬菌體M13、 l噬菌體的衍生物 、柯斯質粒（Cosmid）動物病毒（virus）、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC) 4. 質粒Plasmid 獨立于細菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。5. 質粒的生物學基本特性（1）自主復制性 ：攜帶有自己的復制起始區(qū)（ori）它能獨立于宿主細胞的染色體DNA而自主復制。（2）生物不相容性（ Incompatibility ）：有時不同的質?？赏瑫r共存在于一個細菌內，但同群質粒（不同的，但親緣性高）不能共存于同一細胞，這種現(xiàn)象稱為質粒的不相容性。（3）可轉移性 部分質粒含有tra基因，指令宿主細胞產(chǎn)生菌毛，合成細胞表面物質，促使宿主細胞與受體細胞接合，導致遺傳物質從一細胞轉移至另一細胞中。（4）穩(wěn)定性 質粒在宿主細胞中保持著一定的拷貝數(shù)。（5）寄生性 質粒只能在宿主的細胞內復制（6）表現(xiàn)型 不同的質粒有不同的表型，如對抗生素的抗性等（7）可擴增性（8）攜帶特殊的遺傳標記 野生型的質粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀6. 質粒類型（1）按轉移性分革蘭氏陰性菌的質?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|粒 能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉移到另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質粒等 非接合型質粒 非接合型質粒不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用。（2）按復制機理分：嚴緊控制型質粒，松弛控制型質粒。嚴緊型復制質粒（stringent plasmid）嚴緊型質粒的復制受到宿主細胞蛋白質合成的嚴格控制，復制隨細菌染色體的復制同步進行。松弛型復制質粒（relaxed plasmid）松弛型質粒的復制不受宿主細胞蛋白質合成的嚴格控制，獨立于細菌細胞而自主復制。一般作為載體的質粒應該是松弛型的（3）按功能分：F質粒、R質粒、Col（colicin）質粒（可產(chǎn)生大腸桿菌素）、Ent質粒（可產(chǎn)生腸毒素）。7. 質粒載體中pBR322、 pUC18/19等常見的載體的構建及特點（1）加入合適的選擇標記基因，通常是抗生素基因。（2）增加或減少合適的酶切位點，便于重組。（3）縮短長度，切去不必要的片段，增加裝載量。（4）改變復制子，由嚴緊變?yōu)樗沙谛?，以增加拷貝?shù)。（5） 加裝特殊的基因元件。 pBR322特點：4.3kb ；松弛型內含一個（Ori)、一個抗氨芐青霉素（Ampr）和一個抗四環(huán)素（Tetr）標記基因，在Ampr中有兩個內切酶位點（PstI、PvuI)，在Tetr中有三個內切酶位點（EcoRV、BamHI、SalI)?？截悢?shù)50-100 / cell；用于基因克隆pUC18/19特點： 復制起點：pBR322的 ori Ampr 基因：pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位點。 lacZ基因：大腸桿菌lacZ的a-肽鏈序列， 是LacZ 的氨基端片斷。在lacZ 基因中有一段人工合成的含多種內切酶的單一切點，在此位點上插入外源DNA都能滅活下游lacZ基因。用于基因克隆和測序藍白斑篩選的原理：受體菌lacZ突變：缺失肽。載體lacZ的互補：質粒載體上的lacZ編碼肽，與這個缺失突變的-半乳糖苷酶“互補”，使它能形成4聚體，又能分解Xgal，產(chǎn)生藍色物質。IPTG誘導結果：MCS無插入時，互補，藍菌斑；MCS有插入時，不互補，白菌斑。挑選有外緣DNA插入的質粒轉化的受體菌。8. 單鏈DNA噬菌體的特點 +DNA（ssDNA）。 復制型（RF）是雙鏈環(huán)狀DNA。 RF DNA和ssDNA都能轉染感受態(tài)大腸桿菌，并產(chǎn)生噬菌斑。 包裝容量較大。 可產(chǎn)生大量的含有外源DNA插入片斷的單鏈分子，便于作探針或測序。9. M13系列載體的優(yōu)點（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段（2）M13重組分子篩選簡便被M13噬菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大。（3）Xgal顯色反應，可供直接選擇（4）克隆能力大（5） 可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈。子代M13噬菌體中包含的是單連+DNA。10. T載體特點（1）MCS的中部已經(jīng)被切開，各有一個3端突出的T。（2）PCR產(chǎn)物往往在3端突出一個A，所以能與這個載體直接連接。（3）克隆的PCR產(chǎn)物能被兩側的EcoRI切下來回收。（4）含有G418抗性，可在真核生物中表達。（5）T載體的克隆過程簡便。11. 噬菌體的生物學性質，插入型載體和置換型載體，噬菌體的體外包裝。噬菌體的生物學性質：生物結構（1） 噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體（2） 噬菌體由外殼包裝蛋白和-DNA組成（3）-DNA為線狀雙鏈DNA分子，全長48502個核苷酸，兩端各有一個12核苷酸的互補單鏈，稱為cos區(qū)。（4）-DNA上至少有61個基因，左邊是外殼蛋白的基因，右邊是負責裂解宿主細胞、DNA自主復制以及調控基因，中間是負責與宿主染色體DNA遺傳重組整合的基因。人工構建的噬菌體載體有兩種類型：（1） 插入型載體：插入位點位于載體合成活性阻遏物區(qū)域（cl基因）內。插入型載體長度36.4kb,插入片段長度0-14.5kb。選擇標記：插入導致載體不能合成阻遏物，載體DNA不能進入溶原期，受體菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑，沒有外緣DNA插入的載體感染受體菌形成混濁噬菌斑。-半乳糖苷酶失活型載體：在基因組中引入了LacZ序列，采用藍白斑篩選。（2） 替換型載體：兩個多克隆位點區(qū)以方向重復形式分別位于DNA的非必須區(qū)兩端。用酶切后，可以將中間的區(qū)段切下來，與用同樣酶切成的外緣DNA片段置換。載體長度26kb，插入片段長度10.4-24.9kb.噬菌體的體外包裝 -DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導入受體細胞 用于體外包裝的蛋白質可直接從感染了噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補的兩部分： 一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時，當且僅當這兩部分包裝蛋白與重組-DNA分子混合后，包裝才能有效進行，任何一種蛋白包裝液被重組-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設計的。12. 粘粒即cos 質粒的生物學性質具有l(wèi)噬菌體的特性 在寄主細胞內形成環(huán)化DNA 不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌 克隆后可以體外包裝成噬菌體顆粒。具有質粒載體的特性 能象質粒一樣復制。方便的選擇 有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位點。高容量的克隆能力 45kb （最少不能低于30kb）。 51kb-5kb=45kb13. BAC、YAC主要元件YAC載體應含有下列元件：酵母染色體的端粒序列(TEL)；酵母染色體的復制子（ARS）；酵母染色體的中心粒序列(CEN)；酵母系統(tǒng)的選擇標記；大腸桿菌的復制子；大腸桿菌的選擇標記；YAC載體的裝載量為350-400kbBAC主要元件：細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質粒的基礎上構建的，包括大腸桿菌的復制子，大腸桿菌的選擇標記14. 動物病毒載體（反轉錄病毒、腺病毒）特點反轉錄病毒:（1）屬于正鏈RNA病毒，顯著的特點是具有2倍體基因組。（2）病毒RNA經(jīng)反轉錄產(chǎn)生雙鏈DNA分子，可整合到染色體DNA上成為原病毒，隨染色體DNA進行復制、轉錄和翻譯。優(yōu)點：（1）可將DNA插入宿主基因組的隨機位點上。（2）侵染范圍廣、感染率高，幾乎大100%。（3）整合的原病毒在宿主基因中比較穩(wěn)定，拷貝數(shù)目較低，一般只有一個拷貝。（4）包裝的外源DNA可達10Kb。（5）反轉錄病毒感染哺乳動物細胞，對宿主細胞沒有毒性。一般只感染處于分裂狀態(tài)的細胞。腺病毒： 線狀雙鏈DNA病毒，基因組中有14個基因。 共同特點是都帶有倒置的末端重復序列（ITR），在病毒的復制過程中起非常重要的作用。優(yōu)點：（1）比較安全，無致病、致癌、致畸作用。 （2）宿主范圍廣,不僅能感染有分裂能力的細胞，也能感染不能分裂的細胞（如神經(jīng)細胞）。 （3）可以在呼吸道和腸道中繁殖，可以通過口服或噴霧的方式感染。（4）載體中的插入片斷可達7.5kb （有包裝容量限制）。 （5）腺病毒容易制備、純化。 （6）基因組結構和功能了解得清楚。 15. 打靶載體篩選原理基因打靶載體中含有抗G418的基因，胸腺激酶基因（tk1&tk2），TK能把9-鳥嘌呤轉化成有毒的化合物，從而殺死宿主細胞。在載體整合過程中，非特異整合時，兩個tk基因至少有一個可能整合到基因組里，細胞被tk基因殺死。當特異位點整合時，只有目的基因和抗G418基因整合進去，tk基因不會整合，細胞在G418中存活。正選擇（positive selection），用G418進行選擇。 沒有整合進neor基因的細胞都被殺死。負選擇（negative selection），用9-鳥嘌呤（ganciclovir，GCV）。表達胸苷激酶（Tk）的細胞都被殺死第五章 目的基因的克隆與基因文庫的構建1.目的基因：欲分離、改造、擴增或表達的基因。2.化學法合成目的基因a.小片段粘接法 根據(jù)目的基因全序列，將目的基因分成若干12-15堿基長的小片斷，兩條互補鏈分別設計成交錯覆蓋的兩套小片斷。容易在退火時發(fā)生錯配b.補釘延長法將目的基因的一條鏈分成若干40-50堿基的片斷，另一條設計成與之交錯互補的c.大片段酶促法根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈DNA片段，拼接模塊數(shù)大幅度減少，適合較大的基因合成。3.PCR技術在基因克隆方面的應用：（1）目的基因的直接克隆適合擴增原核生物基因。真核生物基因組含有內含子（2）通過RT-PCR進行cDNA的克隆適合擴增真核生物基因（原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾）。（3）制備DNA探針，進行分子檢測等。4.RT-PCRmRNA差異顯示PCR：（1）3端的錨定引物：Oligo（dT）引物的3端加兩個核苷酸（NM,N:A/G/T/C,M:A/G/C），擴增第一鏈。（2）5端的隨即引物：10個核苷酸，擴增第二鏈。（3）隨機引物與錨定引物成對擴增引物組合：12種錨定引物，若與20種隨機引物，可組成240組引物。實驗結果：在測序膠上，每組擴出50-100條長度為100-500bp的帶。 240組則能分出20000多條帶！如果每條帶相當于一種mRNA，20000 mRNA基本上反映了一種特定細胞中全部的mRNA。（4）隨機-錨定引物PCR的產(chǎn)物電泳比較不同組織的240組引物組合PCR產(chǎn)物在測序膠中電泳，選擇有差異的帶，進一步PCR作探針。5.基因文庫構建的基本程序基因文庫：將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當?shù)妮d體連接，引入相應的宿主細胞中保存和擴增。 理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫。程序：（1） 染色體DNA大片段的制備 斷點完全隨機，片斷長度合適于載體連接。不能用一般的限制性內切酶消化法。 物理切割法：超聲波（300bp）或機械攪拌（8kb）。 酶切法：內切酶Sau3A進行局部消化?？傻玫?0-30kb的隨機片斷。（2）載體與基因組DNA大片段的連接 直接連接、人工接頭或同聚物加尾。 粘性末端直接連接：載體與外源DNA大片段的兩個末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。 人工接頭法（adapter）：人工合成的限制性內切酶粘性末端片斷。各種酶的接頭可以向公司定做或購買。 同聚物加尾（3）將重組子導入到相應的宿主細胞保存和擴增。6.cDNA文庫構建的基本程序，基因文庫的類別cDNA文庫：利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉入細菌細胞中進行保存和擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信