酵母表面展示技術(shù)簡介.doc

淺談酵母表面展示技術(shù)摘 要：酵母表達(dá)體系同時(shí)具有真核細(xì)胞翻譯后蛋白加工修飾的過程與原核表達(dá)體系的特點(diǎn)，因此，以酵母為基礎(chǔ)的表面展示體系在諸多展示系統(tǒng)中有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本文主要對(duì)酵母細(xì)胞展示的理論基礎(chǔ)、展示體系類型及應(yīng)用研究的進(jìn)展等進(jìn)行了初步探討。關(guān)鍵字：酵母、表面展示、凝聚素、GPIScott 和Smith 在1985年通過發(fā)現(xiàn)短肽鏈可以融合到絲狀噬菌體的錨定蛋白上，卻不影響其感染大腸桿菌的能力，最早提出表面展示技術(shù)，促進(jìn)了噬菌體表面展示系統(tǒng)的發(fā)展 1 。自從絲狀噬菌體表面展示技術(shù)創(chuàng)立以來， 表面展示技術(shù)在很短的一段時(shí)間內(nèi)得到快速發(fā)展，不同的實(shí)驗(yàn)室又分別發(fā)展T4 噬菌體、T7噬菌體、細(xì)菌、桿狀病毒、酵母等表面展示系統(tǒng)。微生物細(xì)胞表面展示是通過將靶蛋白基因序列與特定的載體蛋白基因序列融合后導(dǎo)入微生物宿主細(xì)胞，靶蛋白在載體蛋白的引導(dǎo)下表達(dá)并定位于微生物細(xì)胞表面，保持相對(duì)獨(dú)立的空間構(gòu)象和原有的生物學(xué)活性。微生物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)包括細(xì)菌展示系統(tǒng)、噬菌體展示系統(tǒng)以及酵母展示系統(tǒng)。最早研究且比較成熟的系統(tǒng)是噬菌體展示系統(tǒng)，它是將外源的多肽與絲狀噬菌體的次要外殼蛋白融合并展示在外殼表面，噬菌體展示系統(tǒng)目前主要用于從復(fù)雜的文庫中分離特異性的配體、抗原、抗體，由于噬菌體顆粒較小，展示蛋白的大小和數(shù)量均有限。原核蛋白主要用細(xì)菌展示系統(tǒng)展示，革蘭氏陰性菌外表面有外膜，外源蛋白與暴露在細(xì)胞表面的外膜蛋白、脂蛋白、菌毛蛋白或鞭毛蛋白的末端融合后得到展示 2。酵母展示系統(tǒng)是比較理想的、應(yīng)用最廣泛的展示系統(tǒng)，其優(yōu)勢(shì)在于：遺傳操作方便；能對(duì)表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行折疊、糖基化等翻譯后修飾，因而適宜表達(dá)真核蛋白；另外，酵母可以在廉價(jià)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)達(dá)到很高的細(xì)胞密度。1 酵母表面展示系統(tǒng)原理細(xì)胞表面是細(xì)胞內(nèi)外的功能界面。一些表面蛋白橫穿過質(zhì)膜，另一些以共價(jià)或非共價(jià)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞表面復(fù)合物結(jié)合一起。細(xì)胞能夠錨定特定的表面蛋白，并且能將其限制在細(xì)胞表面的特定區(qū)域。在生物技術(shù)中，細(xì)胞表面通常用于研究蛋白跨膜的機(jī)理。酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)是近年來發(fā)展較快的一種真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其基本原理是將外源靶蛋白基因(外源蛋白)與特定的載體基因序列融合后導(dǎo)入酵母細(xì)胞，利用酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到膜表面的機(jī)制使靶蛋白固定化表達(dá)在酵母細(xì)胞表面，在醫(yī)藥、食品、生物燃料等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景3。2 酵母表面展示系統(tǒng)基本組成2.1 宿主細(xì)胞釀酒酵母一直被認(rèn)為是安全的模式生物（GRAS）而廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)，也是目前常見的用于酵母表面展示的宿主細(xì)胞。除釀酒酵母外，近年來酵母展示平臺(tái)已被拓展至某些能利用甲醇作為單一碳源和能量來源的細(xì)胞株，如巴斯德畢赤酵母、漢遜酵母。與釀酒酵母相比，嗜甲醇酵母細(xì)胞株具有更優(yōu)越的發(fā)酵特性，如能夠在廉價(jià)的碳源中生長和更高的細(xì)胞培養(yǎng)密度，這些特性使其在需要大規(guī)模發(fā)酵的應(yīng)用中更具優(yōu)勢(shì)，例如展示異源酶作為全細(xì)胞催化劑4。另外，畢赤酵母對(duì)外源蛋白的 O-糖基化程度更高，因而對(duì)展示的外源酶具有更好的穩(wěn)定效果。2.2 載體蛋白酵母細(xì)胞表面包被著一層堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，由內(nèi)層的葡聚糖骨架和外層的甘露糖蛋白構(gòu)成。甘露糖蛋白主要包括兩類蛋白質(zhì)：一種以非共價(jià)方式松散地結(jié)合于細(xì)胞壁，可以用SDS 抽提；另一類蛋白必需以 -1,3 或-1,6 葡聚糖酶消化細(xì)胞壁后才能抽提，這類蛋白常含有 GPI 錨定區(qū)域。-凝集素和絮凝素以及細(xì)胞壁蛋白如Cwp1p，Cwp2p，Tip1p 等都屬于 GPI 家族蛋白，外源蛋白與它們?nèi)诤虾罂杀还矁r(jià)錨定于細(xì)胞表面，這些蛋白是常用的酵母表面展示載體蛋白。2.3 外源蛋白酵母表面展示系統(tǒng)適合展示各種真核蛋白，包括酶、細(xì)胞識(shí)別因子、受體、抗體、抗原等，被廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)工程、全細(xì)胞催化、生物轉(zhuǎn)化、細(xì)胞吸附、分子識(shí)別、生物治療、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物傳感器和疫苗等領(lǐng)域。外源蛋白與載體蛋白的融合方式有 C 末端融合、N 末端融合、插入融合。對(duì)某些外源蛋白，選擇恰當(dāng)?shù)娜诤戏绞娇梢悦黠@改善展示效果或蛋白的功能特性，如 Aga2p 蛋白有良好的柔性，外源蛋白可以以 N 末端或 C 末端兩種方式與其融合。研究表明抗 CD3單鏈抗體融合于Aga2p 蛋白C末端時(shí)，其親和力較天然蛋白降低 30100倍5，而融合于N末端時(shí)活性得以恢復(fù)。3 酵母表面展示系統(tǒng)的類型目前，最常見的酵母表面展示表達(dá)系統(tǒng)包括: 凝集素展示表達(dá)和絮凝素展示表達(dá)6。凝集素展示表達(dá)系統(tǒng)是將外源基因與酵母編碼凝集素C端編碼序列(含GPI錨定信號(hào)序列)連接后插入質(zhì)粒載體的信號(hào)肽下游， 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后， 信號(hào)肽引導(dǎo)嵌合蛋白向細(xì)胞外分泌， 由于融合蛋白C末端存在含GPI錨定信號(hào)的凝集素多肽序列，可將蛋白錨定在酵母細(xì)胞壁中，從而將蛋白分子展示表達(dá)在酵母細(xì)胞表面。絮凝素展示表達(dá)系統(tǒng)利用絮凝素基因與外源蛋白融合，并將融合蛋白展露表達(dá)在細(xì)胞表面，此系統(tǒng)又包括兩個(gè)子系統(tǒng): GPI錨定系統(tǒng)和絮凝結(jié)構(gòu)域錨定系統(tǒng)。GPI錨定系統(tǒng)是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信號(hào)錨定外源蛋白，此系統(tǒng)與凝集素展示相似; 絮凝結(jié)構(gòu)域錨定系統(tǒng)是利用Flo1p的中間絮凝功能結(jié)構(gòu)域與外源蛋白融合，通過絮凝功能結(jié)構(gòu)域識(shí)別酵母細(xì)胞壁中的甘露聚糖鏈并非共價(jià)作用誘導(dǎo)細(xì)胞粘附、聚集成可逆性絮狀物。4 酵母表面展示系統(tǒng)的應(yīng)用4.1 酵母表面展示與酒精發(fā)酵傳統(tǒng)的酒精發(fā)酵是以淀粉質(zhì)谷物或糖蜜為原料。隨著燃料酒精需求的日益增長，以天然纖維素類資源生產(chǎn)酒精的研究也日益受到人們重視。由于纖維素類物質(zhì)是自然界中一種潛在的可再生資源，對(duì)解決未來能源問題有著巨大的潛力，因此，天然纖維素酒精發(fā)酵具有重要意7。Fujita 等8成功地將三種纖維素水解酶同時(shí)展示在釀酒酵母表面，從而構(gòu)建了能夠增效和按順序降解纖維素的全細(xì)胞生物催化劑。4.2 酵母表面展示系統(tǒng)與新藥篩選將未知功能的目的基因產(chǎn)物或特定病理過程相關(guān)蛋白產(chǎn)物展示在酵母表面，對(duì)cDNA 表達(dá)文庫或突變體庫進(jìn)行篩選，能發(fā)現(xiàn)與這些未知功能的基因產(chǎn)物或病理過程相關(guān)產(chǎn)物發(fā)生相互作用的物質(zhì)，有助于對(duì)未知基因功能的研究，并能發(fā)現(xiàn)一些藥物作用的新靶點(diǎn)，或篩選到治療疾病的新藥先導(dǎo)化合物9 。Visintin 等10將酵母表面展示技術(shù)與酵母雙雜交技術(shù)相結(jié)合，將抗體的scFv 片斷連接到轉(zhuǎn)錄因子VP16 的激活結(jié)構(gòu)域( AD) 上， 將抗原連接到LexA的結(jié)合結(jié)構(gòu)域( DB) 上，以His3 和LacZ 為報(bào)告基因， 建立抗原抗體相互作用的展示方法。當(dāng)抗原- 抗體發(fā)生相互作用時(shí)，AD 和DB 的結(jié)合將啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，可通過營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)。這種方法從scFv 突變體展示庫中將有可能篩選到抗原特異的抗體，為疫苗及抗體類藥物的研制提供良好的平臺(tái)。4.3 酵母細(xì)胞表面展示與生物吸附環(huán)境污染物的生物修復(fù)是以酶促降解或生物吸附為基礎(chǔ)的，例如微生物對(duì)重金屬的吸附就包括兩種途徑: ( 1) 與細(xì)胞表面復(fù)合物結(jié)合，( 2) 逐漸吸收在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行消化。然而通過胞內(nèi)消化降解有毒物質(zhì)必須使細(xì)胞內(nèi)酶，蛋白質(zhì)或污染物跨越細(xì)胞膜這一屏障，比較緩慢及效率低而且不可重復(fù)利用。利用表面展示技術(shù)能較好地解決這一問題，吸附蛋白直接展示在細(xì)胞表面，不僅使吸附過程快捷高效還可以利用回復(fù)劑如EDTA 對(duì)其進(jìn)行處理使之不斷重復(fù)利用。4.4 酵母表面展示與酶技術(shù)酶的固定化是指借助物理或者化學(xué)方法將酶固定于特殊的相，使得酶與整體流體分開，但是仍然能夠進(jìn)行底物和效應(yīng)物分子交換并發(fā)揮其催化效能的一種技術(shù)。與游離酶相比，固定化酶提高了酶的穩(wěn)定性，并使酶能夠反復(fù)回收利用。但是，傳統(tǒng)的固定化方法也會(huì)產(chǎn)生一些不利因素，例如由于增加固定化操作，導(dǎo)致酶固定化過程中的活性收率損失；另外由于固定化操作需用載體，因而增加了載體成本費(fèi)和固定化操作費(fèi)用11利用表面展示技術(shù)將具有催化活性的酶展示于酵母等微生物細(xì)胞表面就形成了全細(xì)胞催化劑，與傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)酶和外分泌酶不同，表面展示的酶以共價(jià)或非共價(jià)方式固定于細(xì)胞外表面，這種獨(dú)特的空間定位使其相對(duì)自由酶而言有許多優(yōu)良的特性，如溫度、有機(jī)溶劑穩(wěn)定性、可多次重復(fù)使用等，這些特點(diǎn)與傳統(tǒng)的固定化酶技術(shù)相似，但無需額外的蛋白純化和固定的操作，有著良好的應(yīng)用前景。Katsumi 12利用凝集素系統(tǒng)將來源于產(chǎn)黃菌屬的 OPH 展示于酵母細(xì)胞表面，細(xì)胞熒光強(qiáng)度測(cè)量表明每個(gè)細(xì)胞表面可以展示 1.410 4 個(gè) OPH 分子，酵母展示系統(tǒng)OPH酶活性較大腸桿菌冰晶核蛋白展示的酶活性更高，為有機(jī)磷化合物的脫毒提供了一種有效的生物催化劑。5 結(jié)語近十年來酵母表面工程技術(shù)在生物技術(shù)領(lǐng)域得到迅速發(fā)展，酵母表面展示系統(tǒng)不僅能展示單個(gè)亞單位蛋白，而且能展示異源寡聚體多亞單位蛋白。酵母是真核生物，利用酵母為宿主展示表達(dá)的各種蛋白為人們研究和操作復(fù)雜真核蛋白成為可能。另外，細(xì)胞代謝工程技術(shù)的進(jìn)步使人們有能力通過增加或刪除細(xì)胞內(nèi)一些酶進(jìn)而改變某些代謝途徑某或創(chuàng)造新的代謝途徑，該技術(shù)與細(xì)胞表面工程技術(shù)相結(jié)合，使表面工程酶細(xì)胞不僅僅作為單步反應(yīng)的催化劑，而且可能被改造成為能催化多步反應(yīng)、適合廣泛用途的“細(xì)胞工廠”?？傊?，隨著更多展示載體蛋白及宿主細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，高效展示文庫篩選方法的建立以及人們對(duì)表面展示技術(shù)認(rèn)識(shí)的不斷深化，酵母表面展示技術(shù)必將在生物質(zhì)能源、生物化工、環(huán)境污染治理等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。參考文獻(xiàn)1 A. Kondo, M. Udea. Yeast cell surface display applications of molecular display. Appl Microbiol Biotechnol , 2004, 64: 28 -402 郭波，謝佩蓉等.酵母表面展示系統(tǒng)研究進(jìn)展.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2002, 29(1) : 9- 223 ShibasakiS, M aedaH, U edaM Ana lSci 2009, 25 ( 1 ): 41 494 Kato M, Fuchimoto J, Tanino T, et al. Preparation of a whole-cell biocatalyst of mutated Candida antarctica lipase B(m CALB) by a yeast molecular display system and its practical properties J. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 75(3): 549-5555 Wang Z, Mathias A, Stavrou S, et al. A new yeast display vector permitting free scFv amino termini can augment ligand bindingaffinities J. Protein Eng Des Sel, 2005, 18(7): 337-3436 葉波，林影，韓雙艷.工業(yè)微生物，2007，37( 6 ): 53587 伍世文. 天然纖維素類物質(zhì)的糖化及轉(zhuǎn)化為酒精的研究。西部糧油科技， 2000,25(3) : 46 488 Yasuya Fujita, Junji Ito et al. Synergistic Saccharification andDirect Fermentation to Ethanol of Amorphous Cellulose by Use of an Engineered Yeast Strain Codisplaying Three Types of Cellulolytic Enzyme. Appl Environ Microbio, Feb. 2004: 1207 -12129 Kieke MC, Cho BK, Boder ET , et al. Isolation of anti T cell receptor scFv mutants by yeast surface display J. Protein Eng,1997, 10: 1303- 131010 Visintin M , Tse E, Axelson H, et al. Selection of antibodies for intra cellular function using a two hybrid in vivo system J, Proc NatlA cad Sci USA, 1999, 96: 11723- 1172811 Roessl U,