三點測交、伴性遺傳、雙因子雜交綜合大實驗.doc

山東大學(xué)實驗報告 2013年 05 月 08 日姓 名 班 級 同組人 科 目 遺傳學(xué)實驗 題 目 雙因子雜交、伴性遺傳和三點測交 組 別 第五組 一、研究背景 果蠅（Drossphila）是遺傳學(xué)試驗中最常用的多年生物之一。屬昆蟲綱，雙翅目，果蠅科，果蠅屬。果蠅的染色體數(shù)目少（僅四對，2n=8），具有許多自然的或誘發(fā)的可遺傳突變性狀，世代周期短（25下1012天一代，個體小易于飼養(yǎng)，培養(yǎng)費用低廉，繁殖能力強，后代數(shù)目繁多，故被作為遺傳學(xué)實驗的典型模式生物。后續(xù)實驗要作果蠅的雜交實驗，需要大量的果蠅，本次實驗可以學(xué)會識別果蠅的各種形狀、區(qū)分果蠅的性別以及基本的飼養(yǎng)方法，為后續(xù)的實驗打下基礎(chǔ)。 黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)，果蠅科(Drosophilidae)果蠅屬(Drosophila)昆蟲。因其生活史短（在25左右溫度下十天左右繁殖一代），繁殖力強（雌性可一次產(chǎn)下400個0.5毫米大小的卵），相對性狀明顯且可遺傳，易于培養(yǎng)，培養(yǎng)成本低（酵母和細(xì)菌，腐爛水果），符合上述遺傳學(xué)實驗研究要求，同時因其染色體僅4對，基因組僅約165Mb，并且基因組超過60%的片段同人類疾病基因相似。故已將其作為一種常見的模式生物(model organism）大量使用在遺傳學(xué)(genetics)和發(fā)育生物學(xué)(developmental biology)的研究。2、 研究目的1、通過對果蠅的雜交實驗，正確理解分離定律的實質(zhì)，并驗證與加深理解三個的遺傳規(guī)律。2、認(rèn)識伴性遺傳的正、反交差別，掌握伴性遺傳的特點。3、掌握繪制遺傳學(xué)圖的原理和方法，加深對重組值、遺傳學(xué)圖、雙交換、并發(fā)率和干涉等概念的理解。4、掌握果蠅的雜交技術(shù)，并學(xué)會記錄交配結(jié)果和掌握統(tǒng)計處理的方法。5、嘗試設(shè)計實驗，驗證缺刻翅的遺傳型三、實驗原理 本次設(shè)計實驗就是利用果蠅進(jìn)行一系列的遺傳學(xué)驗證實驗和染色體基因相對順序和距離的測定，下面簡要介紹關(guān)于雙因子雜交、伴性遺傳和三點測交的基本原理。1、雙因子雜交（dual factors hybridize）：果蠅的灰體基因（E）與黑檀體基因（e）為一對相對性狀，位于R70.7位置，而長翅（Vg）與殘翅（vg）為另一對相對性狀，位于R67.0位置。這兩對基因是沒有連鎖關(guān)系的，位于不同染色體上的非等位基因。 因此非同源染色體的這兩對非等位基因可以很好的驗證自由組合定律。自由組合規(guī)律：位于非同源染色體上的兩對非等位基因，其雜合體在形成配子時，等位基因彼此分離，非等位基因可自由組合進(jìn)入同一配子，結(jié)果產(chǎn)生4種比例相等的配子。若顯性完全，F(xiàn)1自交產(chǎn)生F2代表現(xiàn)出4種表型，比例為9：3：3：1。雙因子雜交的遺傳規(guī)律： 雙因子雜交正交 雙因子雜交反交 18 14 14 18灰長 黑殘灰長 黑殘F1 灰長 F2: 灰長：灰殘：黑長：黑殘=9：3：3：1F1 灰長 F2: 灰長：灰殘：黑長：黑殘=9：3：3：1 2、伴性遺傳（sex-linked inheritance）：位于性染色體上的基因叫作伴性基因，其遺傳方式與位于常染色體上的基因有一定差別，它在親代與子代之間的傳遞方式與雌雄性別有關(guān)，伴性基因的這種遺傳方式稱為伴性遺傳。果蠅的紅眼與白眼是一對相對性狀，由單基因控制，位于X染色體上，基因之間的關(guān)系為紅眼對白眼完全顯性。當(dāng)紅眼果蠅（）和白眼果蠅（）雜交，F(xiàn)1代中的果蠅均為紅眼，F(xiàn)2代中紅眼果蠅白眼果蠅=31，但在雌果蠅中全為紅眼，在雄果蠅中紅眼果蠅白眼果蠅=11。當(dāng)反交時，F(xiàn)1代中的雌果蠅為紅眼，雄果蠅卻為白眼。F2代中紅眼果蠅白眼果蠅=11，在雌果蠅或雄果蠅中紅眼果蠅與白眼果蠅的比例均為11。 伴性遺傳的遺傳規(guī)律： 伴性遺傳正交 伴性遺傳反交 XwXw 白眼 紅眼 X+YX+X+ 紅眼 白眼 XwY 18 w w 18 F1: X+ Xw Xw Y 紅眼 白眼F1: X+ Xw X+ Y 紅眼 紅眼 F2: X+Xw Xw Xw X+ Y Xw Y 紅眼 白眼 紅眼 白眼 1 ： 1 ： 1 ： 1F2: X+ X+ X+Xw X+ Y Xw Y 紅眼 紅眼 紅眼 白眼 1 ： 1 ： 1 ： 13、三點測交位于同一條染色體上的基因是連鎖的，而同源染色體上的基因之間會發(fā)生一定頻率的交換，使子代中出現(xiàn)一定數(shù)量的重組型。重組型出現(xiàn)的多少反映出基因間發(fā)生交換的頻率的高低。而根據(jù)基因在染色體上直線排列的原理，基因交換頻率的高低與基因間的距離有一定的對應(yīng)關(guān)系?；驁D距就是通過基因間重組值的測定而得到的。如果基因座位相距很近，重組率與交換率的值相等，直接將重組值作為基因圖距；如果基因間相距較遠(yuǎn)，兩個基因間往往發(fā)生兩次以上的交換，必須進(jìn)行校正，來求出基因圖距。三點測交：用野生型純合體與三隱性個體雜交，獲得三因子雜種（F1），再使F1與三隱性基因純合體測交，通過對測交后（Ft）代表現(xiàn)型及其數(shù)目的分析，分別計算三個連鎖基因之間的交換值，從而確定這三個基因在同一染色體上的順序和距離。通過一次三點測驗可以同時確定三個連鎖基因的位置，即相當(dāng)于進(jìn)行三次兩點測驗，而且能在試驗中檢測到所發(fā)生的雙交換。如果兩個基因間的單交換并不影響鄰近兩個基因的單交換，那么預(yù)期的雙交換頻率應(yīng)當(dāng)?shù)扔趦蓚€單交換頻率的乘積，但實際上觀察到的雙交換值往往低于預(yù)期值，因為每一次發(fā)生單交換，它鄰近也發(fā)生一次交換的機會就減少，這叫干涉。一般用并發(fā)率表示干涉的大小。 三點測交（一次雜交，一次測交） 6號（wsnm/wsnm） 18號(+/Y) 白卷小 紅直長 F1: (+/wsnm) (wsnm/Y) 紅直長 白卷小 統(tǒng)計F2代各類型及數(shù)目填入統(tǒng)計表4、 缺刻翅驗證 書上所說，缺刻翅具有雄性致死的特征但是作為實驗室長期保存的缺刻翅品種而言，在缺刻翅培養(yǎng)基內(nèi)不存在野生型，那么雄性也應(yīng)為缺刻翅。與書上的結(jié)論矛盾，因此缺刻翅的遺傳需進(jìn)一步驗證采用缺刻雌與18號雄雜交，統(tǒng)計其F1代表型特征四、實驗器材1、材料： 18號果蠅（野生型）及三種突變體果蠅即14號果蠅（黒身殘翅）、w號果蠅（白眼）和6號果蠅（白眼卷剛毛小翅）、缺刻翅果蠅2、試劑：乙醇、乙醚、果蠅培養(yǎng)基等3、器具：麻醉瓶、酒精燈、白瓷板、毛筆、鑷子、培養(yǎng)管、棉球等五、實驗步驟第一周（4月1日 周一）：雙因子正交18 14姓名:日期: 1.準(zhǔn)備工作： 將麻醉瓶和器具（白瓷板、毛筆等）進(jìn)行消毒滅菌，放涼。領(lǐng)取培養(yǎng)管6支，填寫標(biāo)簽并貼在培養(yǎng)管上。 標(biāo)簽寫法舉例如右：選處女蠅: 共有4種果蠅品系，安排6個大桌分別負(fù)責(zé) 18號、14號、W號、6號果蠅的麻醉和雌雄分選2.雜交組合設(shè)計:雙因子正交：18 14雙因子反交: 14 18 伴性正交: 18 W伴性反交: W 186個雜交三點測交：6 18三點測交：6 183、培養(yǎng)：按照設(shè)計的組合將處女蠅和雄蠅分裝在各個培養(yǎng)管中，每管中35對即可。用毛筆輕掃進(jìn)培養(yǎng)管的管壁上，塞上棉塞后平放桌上。待管中果蠅都蘇醒并活動自如以后，再將培養(yǎng)管豎著放進(jìn)培養(yǎng)盒里。放25培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。第二周（4月7日 周日）：4、倒掉親本果蠅并處死第三周（4月15日 周五）：5、觀察F1代是否符合應(yīng)該的表型，選擇生活狀態(tài)良好的F1互交，35對即可，放入新的培養(yǎng)管中置25培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。第四周（4月22日 周五）6、清除培養(yǎng)瓶中所有的F1親本第五周（4月29日 周五 以及4月31日 周日）：7、觀察F2，統(tǒng)計F2，處理數(shù)據(jù)。（統(tǒng)計過的果蠅放入酒精瓶中，殺死）六、實驗數(shù)據(jù)表1 雙因子雜交的實驗數(shù)據(jù)雙因子正交（1814）雙因子反交（1418）組別灰 長灰 殘黑 長黑 殘灰 長灰 殘黑 長黑 殘本組4261215031第一組186934060第二組1052122440第四組3215104225123第五組168343000第六組31101123213123第七組17722無無無無全體1665749178822377表2 伴性遺傳的實驗數(shù)據(jù)伴性遺傳正交（18W）伴性遺傳反交（W18）組別白 紅 白 紅 白 紅 白 紅 本組360138745第一組81203612121414第二組1312018無無無無第四組252205121131318第五組02002114252321第六組3120197787第七組59085625全體5793016667706470表3 三點測交的實驗數(shù)據(jù)三點測交（618）組別紅直長+白卷小wsnm紅直小+m白卷長wsn+紅卷小+snm白直長w+白直小w+m紅卷長+sn+本組188201210第一組185300300第二組174901230第四組222121310第五組1321133500第六組3112132710第七組2113540101全體14046321282361表4 缺刻翅驗證的實驗數(shù)據(jù)本組缺刻翅18缺刻18缺刻18F14402對F1自交F28142118二組缺刻翅18，F(xiàn)1代四種表型都有F1中缺刻18F281066F1中1818F2無19無17注：本組為第三組：柏捷銘&吳曉璇 第一組：自振濤&劉雅真 第二組：李鈺茜&徐霖 第四組：吳顯偉&劉馨德 第五組：吳宏宇&石文昊 第六組：張振宇&楊金才 第七組：殷軍&翟貞文由于某些小組未長出F2代，因而數(shù)據(jù)為無。7、 數(shù)據(jù)分析由于單個小組的實驗數(shù)據(jù)有限（我們組為第三組），在統(tǒng)計上需要大量的數(shù)據(jù)作為基礎(chǔ)，因此實驗數(shù)據(jù)的分析過程中的觀察值和預(yù)期值都是基于全班實驗結(jié)果的總計數(shù)據(jù)。對單個小組進(jìn)行數(shù)據(jù)分析意義不大。1、雙因子雜交的實驗數(shù)據(jù)分析（1）預(yù)期F2的表型與比例： 灰長：灰殘：黑長：黑殘=9：3：3：1（2）正交的子二代的數(shù)量明顯比反交的子二代的數(shù)量多這與求偶行為有一定的關(guān)系。（3）將F2中相同表型的個體疊加起來，作為這種表型的觀察值，進(jìn)行2測驗。表4 雙因子雜交的2測驗灰長灰殘黑長黑殘總計觀察值（O）254798624443預(yù)期值（E）249838328443偏差O-E5-43-4（O-E）2/E0.100.190.110.572=0.97df=4-1=3；=0.05；2=7.81結(jié)論：22；實驗值與預(yù)期值有顯著性差異，不符合紅：白=3:1的分離比（2）伴性遺傳反交：df=4-1=3；=0.05；2=7.81因而反22；觀察值和預(yù)期值之間的差異不顯著，實驗結(jié)果符合反交1：1：1：1的分離比3、三點測交的實驗數(shù)據(jù)分析：表6 三點實驗F2果蠅的性狀查看與統(tǒng)計表型實得數(shù)比例重組發(fā)生在wsnsnmwm+ + +14069.4%w sn m46+ + m3216.4%w sn +12+ sn m811.6%w + +23w + m62.6%+ sn +1合計268100%14.2%19.0%28.0%兩端的基因間距離進(jìn)行校正：28.0%+22.6%=33.2%據(jù)本次實驗結(jié)果算出的三個基因的相對順序和距離19.014.2 w sn m33.2 圖1 w-sn-m三個基因的遺傳學(xué)圖單交換率分別為14.2%和19.0%；雙交換率為2.6%并發(fā)率=2.6%(14.2%19.0%)=0.96，干擾=1-0.96=-0.04；說明一次交換后會干擾它的臨近再發(fā)生一次交換。因此w-sn-m三個基因之間存在著正干擾。與理論基本相符。4、缺刻翅驗證實驗數(shù)據(jù)分析本組缺刻翅18缺刻18缺刻18F14402對F1自交F28142118二組缺刻翅18，F(xiàn)1代除缺刻雄都有F1中缺刻（雜合）18F281066F1中1818F2無19無17綜合兩組實驗的F1代分析，都未見到缺刻雄性，貌似如同書上猜測具有雄性致死的特點從本組的F2代進(jìn)行分析又見到了缺刻雄，因而書上的說法存在疑問。從F1代數(shù)據(jù)分析，否定了常染色體顯隱性，X染色體顯隱性的可能。而從二組的F1中1818自交而言更加印證缺刻基因非隱性基因。綜上所述：判斷缺刻翅不是普通的遺傳類型。顯然缺刻雄確有一定的雄性缺失性，但是在嘗試通過多種致死模型來驗證時，發(fā)現(xiàn)都不符合規(guī)律。且缺刻翅雄蠅消失的情況僅出現(xiàn)在F1代，甚至有可能是缺刻雄蠅生存率低，且出的慢造成的，可能在篩選F1時，缺刻雄仍然為幼蟲。另一種可能為果蠅具有某些選擇性（如同人類的計劃生育），在基數(shù)小的情況下，選擇性表達(dá)出具有快速繁殖能力的18野生雄果蠅（后代數(shù)量由雌性保證，因而繁衍后代的質(zhì)量由雄性來表現(xiàn)，因為雄性交配，成本極低），當(dāng)培養(yǎng)基中果蠅數(shù)量較多密度較大，選擇占空間小，所需營養(yǎng)少，且繁衍周期長（猜測）的缺刻翅型。因而后代才出現(xiàn)缺刻雄性八、思考與討論1、在雙因子雜交實驗中，觀察到反交的F2代數(shù)量明顯比正交的F2代少，而且在F2代計數(shù)時發(fā)現(xiàn)反交的后代出來的慢，因而猜測反交的后代出生率低并且生長周期長，還有可能是14的生殖過程較長，或者由于求偶行為造成的2、對于紅白眼伴性遺傳正交的實驗結(jié)果存在的顯著性差異，差異主要存在于白眼數(shù)量較少導(dǎo)致的顯著性差異。班中有一組同學(xué)做了白眼紅眼存活率的實驗（其他組因為種種原因無幼蟲出現(xiàn)），將紅眼白眼自交，同樣的雌雄個數(shù)，同樣的天數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)，其結(jié)果為紅眼F1代38只，白眼F1代27只，樣本量不多，但具有一定傾向表明：白眼存活率比紅眼存活率低。從生物進(jìn)化上客觀上講，野生型紅眼果蠅本應(yīng)具有較高的存活率，與實驗結(jié)果相符。另一種可能為白眼從蛹中孵化較慢，每個組都減少了一些于是導(dǎo)致整體白眼數(shù)量偏低。3、若在伴性遺傳的正交的實驗結(jié)果中出現(xiàn)一只白眼雌果蠅，這個例外個體產(chǎn)生，是由于在減數(shù)分裂的過程中兩條姐妹染色單體不分離造成的，F(xiàn)2中出現(xiàn)了不應(yīng)該出現(xiàn)的性白眼，但這種情況極為罕見，約幾千個體中有一個。不分離現(xiàn)象解釋如下圖所示：F1 X+Xw X+YX+配子 X+ X+ Xw Xw 0 X+ Y F2