專家講解如何分析測序數(shù)據(jù)(下).doc

專家講解如何分析測序數(shù)據(jù)(下)測序確實是越來越快，也越來越便宜了。隨著個人型測序儀的不斷上市，許多實驗室也躍躍欲試，準備開展這方面的研究。然而，前輩告訴我們，測序并不難，真正困難的工作是數(shù)據(jù)分析。目前有不少用于基因組裝配和比對的程序和算法，但是該選哪一個呢？許多序列分析的專家認為，這取決于基因組的大小、讀取有多長，以及采用的是哪種測序技術(shù)。通常，軟件還需要優(yōu)化，以滿足每個實驗室的獨特需求。為了讓大家更好地開展數(shù)據(jù)分析，Genome Technology雜志特邀了一些這方面的專家，與大家分享他們在數(shù)據(jù)分析方面的經(jīng)驗。通過他們的一問一答，希望您也能從中受益。Q1：您使用哪個基因組裝配或比對軟件，為什么？Q2：您采用哪種方法進行多個序列比對？詳見專家講解如何分析測序數(shù)據(jù)(上)Q3：您如何優(yōu)化原始數(shù)據(jù)，以便獲得最佳的裝配或比對結(jié)果？Inna Dubchak（美國能源部聯(lián)合基因組研究所）我們的比對方法最適合裝配好的數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)最好由局部比對程序來處理。Li-jun Ma（馬薩諸塞大學(xué)）質(zhì)量過濾是關(guān)鍵的一步。我們總是過濾原始讀取，除去低質(zhì)量的讀取，修剪接頭序列，并除去修剪后非常短的讀取。Bud Mishra（紐約大學(xué)）TotalReCaller使用原始強度測序數(shù)據(jù)和參考序列來改善堿基檢出，并優(yōu)化比對結(jié)果。既然它使用參考序列，那么似乎不適合de novo序列裝配；然而，在近期Giuseppe Narzisi的博士論文中，作者表明通過boot-strap方法，TotalReCaller和SUTTA聯(lián)合可顯著改善裝配質(zhì)量。Mihai Pop（馬里蘭大學(xué)）我主要依靠錯誤修剪工具，如fastx toolkit。有時我也使用錯誤糾正工具，但我擔心在某些情況下，這些工具可能引入錯誤。我個人傾向于拋棄可疑的序列，即便它們占據(jù)了相當?shù)谋壤?，而不是試圖糾正錯誤。例如，在16S研究中，我拋棄那些有一個含糊代碼或者太短的序列，通常我會拋棄25-30%的數(shù)據(jù)。測序成本正變得足夠低，且通量足夠高，我們可以承受這些浪費。Steven Salzberg（約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院）我們經(jīng)?；ㄙM大量精力來修剪載體和低質(zhì)量序列，這取決于任務(wù)。對于全基因組測序項目，我們運行錯誤糾正軟件（如Quake）來修復(fù)錯誤的堿基檢出。一些基因組裝配工具干得很好，自己能除去低質(zhì)量的數(shù)據(jù)或糾正錯誤，但另一些不行。如果讀取是配對的，且片段足夠短，配對讀取能夠重疊，那么我們運行另一個程序，在裝配之前將這些配對片段融合成更長的序列。Robert Settlage（弗吉尼亞生物信息學(xué)研究所）我們的首選方法是猛烈的修剪。如果它看似個接頭，去掉。如果它質(zhì)量有疑問，去掉。通常我們有足夠的讀取，因此最好猛烈一點。我們之后常將數(shù)據(jù)補回，看它是否分辨了一些模棱兩可。Q4：確認裝配或比對準確性的最佳方法是什么？Inna Dubchak（美國能源部聯(lián)合基因組研究所）這是個很難的問題。通常我們使用基因組覆蓋度統(tǒng)計數(shù)字，并與其他確立的比對方法比較。Jim Kent（加州大學(xué)圣克魯茲分校）對于裝配：與已知參考基因組比較（如果有的話），檢查mRNA/基因組比對，或檢查配對讀取相對基因組的比對。Ian Korf（加州大學(xué)戴維斯分校）這是個很難的問題。我們通常不知道正確的答案。對基因組的一部分測序可能非常有用。另一個有用的方法是尋找如高度保守的基因或長轉(zhuǎn)錄本。對于序列比對，它取決于你所作的搜索類型。主要有兩種搜索，我稱之為定位（mapping）和探索（exploring）。在定位序列時，一條序列與另一條序列是相同，或幾乎相同的。例如，開展ChIP-seq分析，你需要將讀取定位回參考序列。你希望比對是相同的，但如果它們有一些錯誤或多態(tài)性也能接受。如果有一些完美比對，你認為比對是準確的。在探索遠親關(guān)系時，比如尋找蛋白的同源物，錯配和缺口是意料之中的。如果你的序列是已知蛋白家族的一部分，你的確認策略應(yīng)當包括，比對與家族的其他成員相符合，也就是說，該家族的保守部分在兩兩比對中也同樣保守。Li-jun Ma（馬薩諸塞大學(xué)）確認裝配準確性的方法包括：1）將裝配定位到染色體或連鎖圖上；2）將裝配與任何已知序列比較，如PCR產(chǎn)物、基因、粘粒、BAC或質(zhì)粒的序列；3）如有必要，PCR擴增你有疑問的基因組區(qū)域，以確認裝配的準確性。Bud Mishra（紐約大學(xué)）由于SUTTA是為自我確認而設(shè)計的，它在裝配過程中不斷驗證。我們也開發(fā)了一種新的度量辦法，稱為Feature-Response Curve，它能捕獲contig覆蓋之間的交換，以及不同的準確性特征。最近，我們還設(shè)計了新的統(tǒng)計學(xué)分析工具，能更好地了解各個傳統(tǒng)特征之間的關(guān)系，并捕獲這些特征的核心結(jié)構(gòu)。Steven Salzberg（約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院）準確性有很多內(nèi)部和外部的測定。如果使用的話，外部測定非常有用，我指的是與真正的基因組比較。有時這不可能，但對于已知物種如人的重裝配，我們還是能夠檢查。內(nèi)部測定包括mate-pair距離、配對讀取的方向，和覆蓋深度。我們檢查這些參數(shù)。我的同事A