半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)

半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù) 目錄抗原與半抗原偶聯(lián)蛋白人工抗原合成的方法影響人工抗原質(zhì)量的因素人工抗原的質(zhì)量評定 抗原與半抗原 抗原 抗原 能與淋巴細(xì)胞抗原受體 TCR BCR 特異性結(jié)合 刺激機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答 并與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物 指抗體或致敏淋巴細(xì)胞 在體內(nèi) 外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì) 抗原的分類天然抗原如 細(xì)菌 病毒 真菌 寄生蟲等 人工抗原如 人工結(jié)合抗原 人工合成抗原 基因工程抗原 常見的天然抗原 細(xì)菌 鏈球菌 痢疾桿菌 霍亂弧菌 傷寒桿菌 常見的天然抗原 病毒 狂犬病病毒 腺病毒 口蹄疫病毒 流感病毒 常見的其他天然抗原 真菌 白色念珠菌 1 000Xoil 瘧原蟲 常見的其他天然抗原 異種動物血清異嗜性抗原血型抗原主要組織相容性抗原腫瘤抗原超抗原 人工抗原 人工結(jié)合抗原 將無免疫原性的簡單化學(xué)基團(tuán)與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián) 或?qū)o免疫原性的有機分子與蛋白質(zhì)載體結(jié)合 形成載體 半抗原結(jié)合物 均屬人工結(jié)合抗原 人工抗原 人工合成抗原 用化學(xué)方法將活化氨基酸聚合 使之成為合成多肽 應(yīng)用這種人工合成多肽可研究氨基酸種類 序列與蛋白質(zhì)抗原性及免疫原性的關(guān)系 人工抗原 基因工程抗原 通過基因重組 再表達(dá)制備的抗原物質(zhì) 如 目的基因 編碼抗原 載體 質(zhì)粒等 重組DNA 細(xì)胞 真核或原核 表達(dá) 純化 基因工程疫苗 抗原的性質(zhì) 1 免疫原性 抗原刺激機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答 誘生相應(yīng)抗體和效應(yīng)淋巴細(xì)胞的能力 2 抗原性 抗原可在體內(nèi) 外與相應(yīng)的抗體 效應(yīng)淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合 產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特性 抗原 按照免疫原性及免疫反應(yīng)性 分類 1 完全抗原 既有免疫原性又有抗原性的物質(zhì) 如多數(shù)蛋白質(zhì)分子 2 半抗原 又稱不完全抗原 單獨存在時只具有抗原性而無免疫原性的物質(zhì) 如二硝基酚 青霉素 完全抗原 半抗原與載體結(jié)合后可使其具有免疫原性 半抗原 載體完全抗原 半抗原 載體 抗體 完全抗原 常見的偶聯(lián)蛋白 常見的偶聯(lián)蛋白 常用來作為合成人工抗原的載體蛋白質(zhì)有 牛血清白蛋白 BSA 卵清蛋白 OA 鑰孔血藍(lán)蛋白 KLH 人血清白蛋白 HSA 人工合成的多聚賴氨酸 PLL 等 常見的偶聯(lián)蛋白 牛血清白蛋白 BSA 包含583個氨基酸殘基 分子量為66 43kDa 等電點為4 7 BSA結(jié)構(gòu) 常見的偶聯(lián)蛋白 卵清蛋ovalbvmin是一種糖蛋白 含有微量的磷 是卵清中蛋白質(zhì)的主要成分 約占65 雞的卵清蛋白分子量約45kDa a 牛血清白蛋白b 磷酸酪氨酸血清白蛋白c 卵清蛋白d 磷酸酪氨酸卵清蛋白 常見的偶聯(lián)蛋白 鑰孔血藍(lán)蛋白 KLH 由于KLH質(zhì)量大 復(fù)雜性高 與其他載體蛋白相比KLH會引起更強的免疫應(yīng)答 來源于軟體動物 它在系統(tǒng)發(fā)生上遠(yuǎn)離哺乳動物物種 在測定過程中產(chǎn)生會與典型靶點樣品發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體的可能性較小 常見的偶聯(lián)蛋白 人血清白蛋白 簡稱HSA 是人血漿中的蛋白質(zhì) 其非糖基化的單鏈多肽包含585個氨基酸 分子量為66kD 在血漿中其濃度為42g L 約占血漿總蛋白的60 常見的偶聯(lián)蛋白 多聚賴氨酸是目前天然防腐劑中具有優(yōu)良防腐性能的微生物類食品防腐劑 它是由25 30賴氨酸殘基聚合而成 具有強烈的抑菌能力 可以作為防腐劑用于食品的保鮮 偶聯(lián)蛋白的性質(zhì) 載體表面應(yīng)首先應(yīng)具有化學(xué)活性基團(tuán) 這些基團(tuán)可以直接與抗生素或農(nóng)藥分子偶聯(lián) 這是化學(xué)偶聯(lián)制備抗原的前提 其次 載體應(yīng)具備一定的容量 可以偶聯(lián)足夠的分子 載體還應(yīng)該是惰性的 不應(yīng)干擾偶聯(lián)分子的功能 而且載體應(yīng)具有足夠的穩(wěn)定性 且應(yīng)該是廉價易得的 人工抗原合成方法 人工抗原合成方法 小分子半抗原與載體蛋白偶聯(lián)效果會受到偶聯(lián)物的濃度及其相對比例 偶聯(lián)劑的有效濃度及其相對量 緩沖液成分及其純度和離子強度 pH以及半抗原的穩(wěn)定性 可溶性和理化特性等因素的影響 一般是由半抗原上的活性基團(tuán)決定偶聯(lián)合成的方法 半抗原上的活性基團(tuán) 人工抗原合成方法 1 分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶聯(lián)A 混合酸酐法 B 碳化二亞胺法 C N 羥琥珀酰亞胺酯法 混合酸酐法交聯(lián)原理 混合酸酐法交聯(lián)原理 碳化二亞胺法交聯(lián)原理 碳化二亞胺法交聯(lián)原理 碳化二亞胺法交聯(lián)原理 人工抗原合成方法 2 含有氨基或可還原硝基半抗原的偶聯(lián)1 戊二醛法 雙功能試劑戊二醛的兩個醛基分別與半抗原和蛋白質(zhì)上的氨基形成schiff鍵 N C 在半抗原和蛋白質(zhì)間引入一個5碳橋 這一反應(yīng)條件溫和 可在4 40 及pH6 0 8 0內(nèi)進(jìn)行 操作亦簡便 因此應(yīng)用廣泛 2 重氮化法 用于活性基團(tuán)是芳香胺基的半抗原 芳香胺基與NaNO2和HCl反應(yīng)得到一個重氮鹽 它可直接接到蛋白質(zhì)酪氨酸羧基的鄰位上 形成一個偶氮化合物 戊二醛法合成人工抗原的原理 鹽酸克倫特羅重氮化反應(yīng)原理 人工抗原合成方法 3 含羥基半抗原的偶聯(lián)1 琥珀酸酐法 2 羰基二咪唑法 人工抗原合成方法 4 含巰基半抗原的偶聯(lián)1 馬來酰亞胺法 2 將載體蛋白與半抗原在pH4 0的醋酸緩沖液中 通過過氧化氫的作用形成二硫鍵 也可以將半抗原連接到蛋白質(zhì)分子上 影響人工抗原質(zhì)量的因素 影響人工抗原質(zhì)量的因素 偶聯(lián)比過去人們認(rèn)為 聯(lián)接到蛋白質(zhì)分子上的半抗原數(shù)目要盡可能多 但實驗證明 過多的半抗原并不能得到預(yù)期的結(jié)果 這是因為載體上覆蓋的半抗原分子過多時 可能不利于載體與淋巴細(xì)胞表面結(jié)合 不能使載體引起免疫反應(yīng) 研究發(fā)現(xiàn)各種載體的分子量不論是否接近 最佳結(jié)合比都不盡相同 并建議為了取得最佳免疫效果 應(yīng)逐個確定各種載體的最佳結(jié)合比 影響人工抗原質(zhì)量的因素 偶聯(lián)橋有研究者認(rèn)為 一定長度的手臂的介入 有助于半抗原暴露在外面 利于所產(chǎn)生抗體專一性的增強 但也有一些研究者發(fā)現(xiàn) 手臂結(jié)構(gòu)對免疫檢測經(jīng)常有不利的影響 有時產(chǎn)生的抗體對手臂結(jié)構(gòu)親和力特別強 對待測小分子親和力卻很弱 因此造成對特異性抗體檢測的干擾 可以采取兩種方法來避免因偶聯(lián)橋而造成的不足 一是半抗原上相同位點結(jié)合蛋白質(zhì) 但免疫原和包被抗原用不同的偶聯(lián)橋 二是免疫原和包被抗原用相同的偶聯(lián)橋 但與不同半抗原位點結(jié)合 最好的偶聯(lián)橋是3 6個直鏈的碳原子結(jié)構(gòu) 影響人工抗原質(zhì)量的因素 半抗原的分子空間結(jié)構(gòu)用來作半抗原的分子最好有分支結(jié)構(gòu) 直鏈分子難以產(chǎn)生抗體 此外 有些抗生素或農(nóng)藥有多個可供蛋白質(zhì)偶聯(lián)的位點 但據(jù)研究報道 不同位點與蛋白質(zhì)結(jié)合制備的人工抗原產(chǎn)生的抗體效價及親合力都有差別 這可能是因為不同位點結(jié)合導(dǎo)致半抗原呈現(xiàn)的空間結(jié)構(gòu)不一樣的原因 因此 如果一個分子內(nèi)有多個不同的結(jié)合位點時 最好盡可能利用不同位點都合成出人工抗原 然后 通過比較 篩選出最好的人工抗原用于制備抗體作為檢測 半抗原的分子空間結(jié)構(gòu) 半抗原的分子空間結(jié)構(gòu) 半抗原的分子空間結(jié)構(gòu) 人工抗原的質(zhì)量評定 人工抗原的質(zhì)量評定 合成成功鑒定鑒定農(nóng)藥人工抗原最常用的方法是紫外光譜掃描法 如果人工抗原的紫外吸收圖譜不同于原載體蛋白和半抗原的紫外掃描圖譜 則可初步證明人工抗原合成成功 紫外分光光度法測定人工抗原偶聯(lián)質(zhì)量 人工抗原的質(zhì)量評定 濃度測定人工抗原的絕對含量常以蛋白質(zhì)的相對濃度表示 如每ml抗原溶液中含有蛋白質(zhì)多少mg 因此測定人工抗原的濃度與測定人工抗原溶液中蛋白質(zhì)的相對含量 mg ml 是一致的 常用的方法有紫外吸收法 Folin 酚法 雙縮脲法 微量凱式定量法 染色結(jié)合法和熒光法等 人工抗原的質(zhì)量評定 純度鑒定利用吸附與分配層析和電泳技術(shù)可鑒定人工抗原的偶聯(lián)的純度 如果電泳圖譜上只出現(xiàn)一條電泳帶 則表明人工抗原達(dá)到電泳純 否則說明人工抗原中含有未偶聯(lián)的物質(zhì) 利用電泳技術(shù)鑒定人工抗原偶聯(lián)的純度 人工抗原的質(zhì)量評定 偶聯(lián)比的測定分光光度法如果半抗原的紫外最大吸收大于220nm 蛋白質(zhì)在220nm以下會產(chǎn)生肽的強紫外吸收 如果半抗原的紫外最大吸收少于220nm 則與蛋白質(zhì)肽的吸收發(fā)生重疊 則可根據(jù)蛋白質(zhì)及其半抗原特定的吸收峰的光密度值和各自的摩爾