（有機化學專業(yè)論文）優(yōu)化大觀霉素提取工藝.pdf

山東人學碩l 學位論文 u m l m p a m o i l m 3 h 符號說明 效價 含量 壓力 濃度 流量 i i i 附件一 原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明 所呈交的學位論文 是本人在導師的指導下 獨立進 行研究所取得的成果 除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外 本論文不包含任何 其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果 對本文的研究作出重要貢 獻的個人和集體 均已在文中以明確方式標明 本聲明的法律責任由本人 承擔 論文作者簽名 蟬日期 嗶 關于學位論文使用授權的聲明 本人完全了解山東大學有關保留 使用學位論文的規(guī)定 同意學校保 留或向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版 允許論文被查閱 和借閱 本人授權山東大學可以將本學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關 數(shù)據(jù)庫進行檢索 可以采用影印 縮印或其他復制手段保存論文和匯編本 學位論文 保密論文在解密后應遵守此規(guī)定 論文作者簽名 乏拉導師簽名 繼日期 之乏 竺 山東人學碩十學位論文 摘要 大觀霉素 s p e c t i n o m y c i n 又稱奇放線菌素或壯觀菌素 a c t i n o s p e c t a c i n 是一種堿性水溶性抗生素 這是一族由氨基環(huán)醇 為主體和氨基糖甙類以甙鍵結合而成的抗生素 大觀霉素是一種廣譜抗生素 對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌均有 抗菌作用 l 臨床上它專門治療奈瑟氏林球菌 n e i s s e r i ag o n o r r h o e a e 引發(fā)的感染 目前大觀霉素以代替青霉素作為治療急性淋病的首選藥 物 此外 大觀霉素的抗菌譜廣和低毒性也使它作為飼料添加劑 以 提高農(nóng)作物產(chǎn)量或促進牲畜生長 近年來 由于性傳播疾病在我國呈上升趨勢 其中以淋病的發(fā) 病率最高 相對于渠道復雜而且價格昂貴的同類藥品 大觀霉素更具 有安全和價格優(yōu)勢 因而國內(nèi)臨床上的需求量不斷增加 雖然大觀霉 素以實現(xiàn)了國產(chǎn)化 但基礎理論研究和生產(chǎn)水平與國外還存在差距 要開拓市場 實現(xiàn)大觀霉素走性國際化 除了加快國外的g m p 和f d a 認證步伐外 還需要提高產(chǎn)品自身的質(zhì)量 綜上 本文在提高大觀霉素提取過程中的產(chǎn)品質(zhì)量和收率方面 作了以下三個方面的工作 一 優(yōu)化了大觀霉素發(fā)酵液的酸化p h 值 使得發(fā)酵液中的蛋 白雜質(zhì)去除更加徹底 而且有利于酸化液過濾 濾餅中的殘留效價進 山東人學壩 學位論文 一步降低 提高了過濾收率和濾液的質(zhì)量 有利于下一步離子交換樹 脂的吸附 二 利用l k 1 2 離子交換樹脂代替l k 1 l 樹脂 提高了樹脂 的吸附容量 解析液效價升高 灰分降低 在提高解析液質(zhì)量的同時 交換收率提高了3 2 三 3 k d 超濾膜的試驗 3 k d 分子量陶瓷膜對大觀霉素中間 體中含有的大分子有機雜質(zhì)去除效果良好 在應用于生產(chǎn)后可大副降 低脫色加碳量 以減少大觀霉素的損失 降低原輔料消耗 去除雜質(zhì) 的效果特別明顯 降低脫色液或濃縮液中的熱原和濁度的效果非常顯 著 可徹底解決原生產(chǎn)工藝難解決的濁度 熱原及成品純度等問題 關鍵詞 大觀霉素 提取 樹脂 結晶 2 山東大學碩i 學位論文 a b s t r a c t s p e c t i n o m y c i n i sak i n d o fa n t i b i o t i c sw i t ha l k a l e s c e n c ea n d w a t e r s o l u b i l i t y i ti sa l s oc a l l e da c t i n o s p e c t a c i n i ti saf a m i l yo f a n t i b i o t i c s w h i c hi s m a d eu po fa m i n o c y c l i t o l t h em a i nb o d y a n d a m i n o s u g a r g l y c o s i d ec l a s s g l y c o s i d eb o n d s p e c t i n o m y c i ni s ab r o a ds p e c t r u ma n t i b i o t i c w h i c hh a sa ne f f e c t o fb e i n g a g a i n s tg r a mn e g a t i v ea n dg r a mp o s i t i v eb a c t e r i u m i t s p e c i a l i z e di nt r e a t i n gi n f l a t i o nc a u s e db yn e i s s e r i ag o n o r r h o e a ei n c l i n i c r i g h tn o ws p e c t i n o m y c i ni st h ef i r s tc h o i c eo ft r e a t i n ga c u t e g o n o r r h e a t a k i n gp l a c eo fp e n i c i l l i n i na d d i t i o n b r o a ds p e c t r u m a n t i b i o t i ce f f e c ta n dl o w t o x i c i t ym a k es p e c t i n o m y c i nb e c o m eaf e e d a d d i t i v e t op r o m p tt h et u r n o u to fc r o pa n dt h eg r o w t ho fl i v e s t o c k i nt h er e c e n ty e a r s t h es e x o r i g i n a t e dd i s e a s ei sr o a r i n g i nw h i c h t h eg o n o r r h e at a k et h eb i g g e s tp a r t c o m p a r i n gw i t ht h es i m i l a rb u t u n c e r t a i na n de x p e n s i v em e d i c a m e n t s p e c t i n o m y c i nh a st h ea d v a n t a g e o fs a f e t ya n db e i n gc h e a p s ot h er e q u i r e m e n to fs p e c t i n o m y c i ni s r i s i n g n o ws p e c t i n o m y c i nc a nb ep r o d u c e dd o m e s t i c a l l y b u tw es t i l l f a l lb e h i n dw i t hf o r e i g n p r o d u c e r si n b a s i ct h e o r yr e s e a r c h i n ga n d p r o d u c t i o nl e v e l i no r d e rt oe x p e n dt h em a r k e ta n dr e a l i z et h e i n t e r n a t i o n a l i z a t i o no fp r o d u c t i o n b e s i d e so fa t t a i n i n gt h ec e r t i f i c a t e o fg m pa n df d ai nf o r e i g nc o u n t r i e s w en e e dt o p r o m p tt h eq u a l i t y o fo u rp r o d u c t s a b o v e t h i sa r t i c l ef o c u s e so nt h r e ep a r t s 1 t oo p t i m i z et h ea c i d i t yo fp ho fs p e c t i n o m y c i n f e r m e n t a t i o nb r o t h i no r d e rt or e m o v et h ep r o t e i ni m p u r i t ym u c hm o r e c o m p l e t e l y i ti sa l s oi nf a v o ro fa c i d i f y i n gt h ef e r m e n t a t i o nb r o t ha n d r e d u c i n gt h et i t e ro fl e f t o v e ro ff i l t e rc a k es oa st op r o m p tt h ey i e l d 2 t o m a k el k 12i o n i ce x c h a n g i n gr e s i nt a k ep l a c eo f l k i1r e s i n i no r d e rt oe n h a n c et h ev o l u m eo fa d s o r p t i o na n dt h et i t e r 山東大學碩十學位論史 o fr e s o l v i n gs o l u t i o na n dr e d u c et h ea s h w h e ne n h a n c i n gt h eq u a l i t y o fr e s o l v i n gs o l u t i o n t h ee x c h a n g i n gy i e l dp r o m p t s3 2 3 3 k du l t r a f i l t r a t i o nf i l mt e s t 3 k dm 0 1 e c u l a rw e i g h t c e r a m i c sf i l mc a nr e d u c et h em a e r o m o l e c u l eo r g a n i ci m p u r i t yo ft h e i n t e r m e d i a t eo fs p e c t i n o m y c i ne f f e c t i v e l y w h e na p p l i e dt op r o d u c t i o n i tc a nr e d u c et h ea m o u n to ft h ec a r b o ni nd e e l o r i n gs o a st or e d u c et h e l o s so fr a wm a t e r i a l sa n ds u p p l e m e n t a r ym a t e r i a l s i th a sad i s t i n c t i v e e f f e c to fr e d u c i n gi m p u r i t ya n dl o w e r i n gt h ep y r o g e na n dt u r b i d i t yo f d e c o l o r i n gs o l u t i o na n dc o n c e n t r a t i n gs o l u t i o n t h e r e b y t h ep r o b l e m s o fp y r o g e n t u r b i d i t y p u r i t yo ff i n i s h e d p r o d u c t s i nt h e o r i g i n a l l y c r a f t so fp r o d u c t i o na r es o l v e dc o m p l e t e l y k e y w o r d s p e c t i n o m y c i n e x t r a c t i o n r e s i n c r y s t a l 4 山東人學碩i 學位論文 第一章前言 一 大觀霉素簡介 大觀霉素 s p e c t i n o m y c i n 又稱奇放線菌素或壯觀菌素 a c t i n o s p e c t a c i n 是一種堿性水溶性抗生素 最初的文獻報道將它 歸屬為氨基壞醇類抗生素 a m i n o c y c l i t 0 1 八十年代后重新劃分為 氨基糖甙類抗生素 a m i n o g l y c o s i d e 這是一族由氨基環(huán)醇為主體和 氨基糖甙類以甙鍵結合而成的抗生素 所以也有學者特別指出該類抗 生素嚴格定義應為 氨基環(huán)醇一氨基糖甙類抗生素 中國藥典2 0 0 0 年版 美國藥典2 4 版均收錄了該藥物 1 9 6 0 年 美國a b b o t t 實驗室和u p j o h n 公司的m a s o n 等人第一 次從大觀鏈霉菌中提取出大觀霉素 大觀霉素肌肉注射吸收快 易于 腸道吸收 一般制成無菌懸浮注射劑 臨床使用采用大觀鹽的形式 最初為硫酸鹽 分子式為c l4 h 2 4 n 2 0 7 h 2 s 0 4 4 h 2 0 七十年代初研制 出更適于懸浮注射的溶解度更大的鹽酸鹽 鹽酸大觀霉素為米白色晶 體 分子式為c 1 4 h 2 4 n 2 0 7 2 h c i 5 h 2 0 分子量為4 9 5 3 5 結構如圖 1 一l 所示 山東大學碩 學位論文 h n o 圖1 1 赫酸大觀霉素結構式 f i 9 1 1 s t r u c t u r eo fs d p c h 3 h 2 h c l 5 h 2 0 大觀霉素是一種廣譜抗生素 對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌均 有抗菌作用 臨床上它專門治療奈瑟氏林球菌 n e i s s e r i a g o n o r r h o e a e 引發(fā)的感染 近年來 由于抗淋病藥物的非正規(guī)使用 及林球菌通過質(zhì)粒和 或 染色體介導的耐藥菌株的同益流行率日趨 增高 以前首選的青霉素因國內(nèi)流行的淋菌株對其耐藥率己達5 3 5 8 l 而被逐漸淘汰 目前大觀霉素以代替青霉素作為治療急性淋病 的首選藥物 此外 大觀霉素的抗菌譜廣和低毒性也使它作為飼料添 加劑應用于農(nóng)藥或獸藥學領域 以提高農(nóng)作物產(chǎn)量或促進牲畜生長 作為氨基糖甙類抗生素的一員 大觀霉素具有這類物質(zhì)的通 性 結構中含有羥基和胺基親水集團 游離堿及其鹽類均易溶于水 難溶于有機溶媒 穩(wěn)定性明顯受水分 p h 值 溫度和雜質(zhì)的影響 6 山東入學壩i 學位論文 在空氣中易潮解 含水量增加后穩(wěn)定性顯著下降 在不同程度的酸性 或堿性條件下發(fā)生降解反應 分子中的許多不對稱碳原子帶來旋光性 等 目前大觀霉素的生產(chǎn)采用微生物法 首先是長生菌的斜面制備 然后以淀粉 葡萄糖等為原料進行發(fā)酵 通過離子交換樹脂提取發(fā)酵 液中的大觀霉素 樹脂經(jīng)酸沈脫 沈脫液濃縮后經(jīng)溶媒結晶得到產(chǎn)品 二 大觀霉素的菌種選育 誘變育種 細胞融合育種和基因工程育種是菌種選育的二條主 要途徑 1 誘變育種這是一種傳統(tǒng)的 非常有效的育種手段 隨著科學技 術的發(fā)展 一些新的誘變手段不斷出現(xiàn) 為這種傳統(tǒng)的育種方法注入 了新的活力 向砥 2 0 1 等通過離子注入法選育高產(chǎn)大觀鏈霉菌 獲得 了大觀霉素效價較出發(fā)菌株提高1 0 2 3 的變異株 王宏斌 1 9 1 等通過 原生質(zhì)體誘變技術使大觀霉素產(chǎn)量提高了1 7 但是 由于誘變的 隨機性 要得到各方面性狀都比較優(yōu)良的菌株難度很大 大多數(shù)情況 下得到的往往是某一個性狀有缺陷的菌株 如大觀霉素發(fā)酵效價高的 菌株其生長速度可能較慢 而生長速度快的突變株發(fā)酵效價可能不很 理想 在這種情況下 對這兩類菌株進行原生質(zhì)體融合將是一種有效 的育種手段 有可能篩選到既有較高發(fā)酵效價 又生長迅速的融合菌 株 馬秀芬f 8 1 等人研究發(fā)現(xiàn)1x1 0 6 和5x1 0 6 的微量稀土元素能夠 7 山東人學碩i 學位論文 明顯促進菌體生長 增加抑菌圈直徑和搖瓶效價 促進抗生素的合成 能力 而且孢子生活力強 4 c 下保存五周和連續(xù)傳至第六代時 生 產(chǎn)能力保持不變 韓香玲 1 1 等利用紫外線照射引起d n a 變化后將其 涂布在含有大觀霉素的培養(yǎng)基上 使i i i 自身產(chǎn)物的突變株得以生產(chǎn) 選育出了具有耐自身產(chǎn)物的高產(chǎn)突變株 王雪榮 2 1 等通過對大觀霉素 生產(chǎn)菌株自然分離 應用紫外線照射和離子束注入等誘變方法 經(jīng)過 抗自身產(chǎn)物積累篩選了高產(chǎn)菌株 發(fā)酵效價比對照提高了6 9 4 原生質(zhì)體融合育種將兩親本菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期 在高滲溶液 中用溶菌酶處理 制備成原生質(zhì)體 然后用聚乙二醇 p e g 等化學觸 合劑或電刺激等物理手段使兩原生質(zhì)體融合 在再生培養(yǎng)基上篩選出 符合要求的融合子 有資料顯示 放線菌的原生質(zhì)體融合頻率可達 l o 2 1 0 因此 既使不對原生質(zhì)體進行了標記 也可方便地篩選 到所需融合子 因為生長迅速的菌株菌落往往較大 發(fā)酵效價高的菌 株一般耐大觀霉素能力強 因此可在大觀霉素梯度平板上篩選得到 2 基因工程育種基因工程育種十一種分子水平上的育種技術 它 可通過定向地增加某些有用基因或敲除某些不利基因來提高抗生素 的表達量 研究發(fā)現(xiàn) 合成大觀霉素的一系列基因通常位于同一基因 串 g e n ee l u s l e r 上 韓國學者利用c o s m i d 質(zhì)粒構建了大觀霉素生物 合成基因的基因文庫 c o s m i dg e n el i b r a r y 發(fā)脫其中有一個c o s m i d 包含了2 1 個完整的開放閱讀框架 o r f 和2 個不完整的丌放閱讀框 8 山東人學頎i 學位論文 架 并推導出大觀霉素生物合成所需的1 6 個蛋白質(zhì) s p e r n t a b c d x e y f g h i j k w a l k e r i 1 發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺 氨基環(huán)醇氮基轉(zhuǎn)移酶 g l u l a m i n e a m i n o e y c l i t o l a m i n o t r a n s t e r a s e 和二氨環(huán)醇氮基轉(zhuǎn)移酶 d i a m i n o e y e l i t o la m i n o l r a n s f e m s e 在大觀霉素合成中有重要作用 j o t l 6 1 等發(fā)現(xiàn)d t d p 葡萄糖合成酶 肌醇單磷酸酶和肌醇脫氫酶參與 的反應是大觀霉素生物合成的早期步驟 h y u n 等 和s o h n g 等還把 編碼d t d p 葡萄糖合成酶和d t d p d 葡萄糖4 6 脫水酶的基因通過 c o s m i d 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中 使相關基因得到表達 因此 如果 能用穿梭質(zhì)粒作為載體 將大觀霉素生物合成基因轉(zhuǎn)化到大觀鏈霉菌 中 有可能使大觀霉素產(chǎn)量大大提高 3 高效篩選菌株的篩選氏菌種選育過程中最為關鍵的步驟 馬秀 芬等通過菌落形態(tài)變異來篩選高產(chǎn)菌株 研究發(fā)現(xiàn)梅花型菌落的抗菌 活性最高 圓形菌落次之 光禿型菌落幾乎沒有抗菌活性 于廣成 1 7 1 等通過產(chǎn)色素變化和自身耐藥濃度的變化來選育高產(chǎn)菌株 菌落形態(tài) 和產(chǎn)色素突變雖是一些比較容易判斷的形態(tài)指標 但這些指標與大觀 霉素產(chǎn)量之間缺乏科學的相關依據(jù) 用大觀霉素梯度平板來篩選自身 耐藥菌株是一個不錯的選擇 因為大觀霉素高產(chǎn)菌株首先必須要耐受 高濃度的大觀霉素 但是 能耐大觀霉素的菌株卻不一定是高產(chǎn)菌株 因為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大脫霉素的抗性與大觀霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 s p e c t i n o m y c i n 9 山東入學壩i 學位論文 p h o s p h o r a n s f e r a s e 等某些大觀霉素抗性酶有關 l y u t z k a n o v a 等還從 大觀霉素產(chǎn)生菌s f l a v o p e r s i c u s 中克隆了大觀霉素的抗性決定子 發(fā)現(xiàn)其含4 個開放閱讀框架 其中的一個與氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶相 似 另一個與鏈霉素生物合成基因串中的調(diào)節(jié)蛋白相似 因此即使用 梯度平板法 大規(guī)模的篩選仍不可避免 研究者曾經(jīng)丌發(fā)過一個用于 微生物菌種選育的高效篩選模型 該模型利用多孔板進行液態(tài)培養(yǎng) 一次可處理幾萬個突變株 濕室培養(yǎng)后可從透光率判斷菌體的生長情 況 將多孔板漫至氯化鈣溶液中 使孔內(nèi)液體固化后 還可直接覆蓋 于涂有指示菌的培養(yǎng)基上 進行抑菌能力的測定 使篩選效率大大提 高 三 大觀霉素的發(fā)酵和提取 l 大觀霉素的發(fā)酵 菌種和發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量是決定發(fā)酵水平的兩個重要因素 優(yōu)良的 菌種可以達到事半功倍的效果 發(fā)酵培養(yǎng)基組分成分復雜 它包括碳 源 氮源 無機鹽 微量元素 前提和促進劑等 發(fā)酵是生物合成大觀霉素的關鍵步驟 在大觀霉素研究初期 m a s o n 等人就強調(diào)了發(fā)酵過程中溫度 p h 值 時間的重要性 美國 a b b o t t 實驗室和u p j o h n 一直從事著它的生產(chǎn)研究工作 1 9 7 2 年 t r o b i c i n 大觀霉素的商品名 中文譯為淋必治 的生產(chǎn)商 美國 o p j o h n 公司在大觀霉素產(chǎn)生菌的培養(yǎng)條件方面已取得顯著成果 確 1 0 山東大學頎 學位論文 定了培養(yǎng)基中碳源 氮源 無機鹽和有機物的組成 探討出了有利于 提高產(chǎn)量的發(fā)酵溫度和時 日j 以及發(fā)酵分離方法 g o m e s 和m e n a w a t 對大觀霉素的發(fā)酵過程進行了系統(tǒng)研究 找出了蔗糖料液的最佳濃度 并提出了 活化一反應一抑制 的合成模式 抗生素是微生物的次級 代謝產(chǎn)物 由于微生物產(chǎn)生抗生素的生化代謝途徑較復雜 通過遺傳 學研究 結合現(xiàn)代生理學研究技術 目前基本搞清了大觀霉素的生物 合成途徑 大觀霉素是由葡萄糖經(jīng)一系列反應生成的放線胺 a c t i r l a i r l i n e 和大觀糖 s p e c t i n o s e 經(jīng)酶促縮合而成的 見圖1 2 葡萄糖盟鱉盒盛墮 青蟹肌糖氨莖壁整墮宣譬肌胺 鏈霉胺 放線胺葡萄糖萄萄糖 6 磷酸 葡萄糖 1 磷酸 葡萄糖合成酶叫 d t d p d 葡萄糖瞪水酶 d t d p 大觀糖 放線胺 d t d p 大觀糖太觀簍蠢金盛醛式觀霉素 圖1 2 大觀霉素生物合成途徑 f i g 1 2t h es y n t h e s i sp a t h w a yo fs p e c t i n o m y c i n 山東人學顧i 學位論文 對大觀霉素這類次生代謝產(chǎn)物來說 其發(fā)酵效價除了與遺傳特性 有關外 還受到環(huán)境條件的影響 于廣成等曾對大觀霉素發(fā)酵培養(yǎng)基 進行過優(yōu)化 探討了碳氮源的種類及配比對發(fā)酵的影響 馬秀芬等就 環(huán)境因子對大觀鏈霉菌發(fā)酵的影響進行過實驗 發(fā)現(xiàn)無機磷酸鹽抑制 大觀霉素的合成 硝酸鹽促進其合成 此外 他們還發(fā)現(xiàn)稀土元素不 但可以促進大觀鏈霉菌的生長 而且發(fā)酵效價也能提高7 8 左 右 但到同前為止 有關酶的誘導 分解代謝產(chǎn)物的解阻遏 能荷的 調(diào)節(jié) 產(chǎn)物的反饋抑制 抗生素的分泌特性等研究尚沒有得到很好地 開展 國外在這方面的工作由于技術保密等原因而少見報道 只有 g o m e s 等對分批培養(yǎng)下大觀霉素的生物合成進行過研究 提出了氧傳 遞速率是限制發(fā)酵效價的關鍵因素這一論斷 微生物在合成次級代謝產(chǎn)物時 一般都同時產(chǎn)生結構上類似的多 種副產(chǎn)物 大觀鏈霉菌也不例外 在合成大觀霉素的同時 也會合成 二氫大觀霉素和二羥大觀霉素等結構類似物因此 如果能從生理上搞 清大觀霉素及其他副產(chǎn)物的合成途徑 就可有的放矢地采取生理和遺 傳的手段抑制代謝旁路的進行 使大觀霉素在發(fā)酵液中得到富集 大觀霉素的分泌特性對發(fā)酵收率也有較大的影響 通過生理或 遺傳學手段改變細胞壁和細胞膜的組分 可加速大觀霉素的分泌 減 少由于大觀霉素積累而造成的反饋抑制 從而提高抗生素的產(chǎn)量 1 2 山東大學碩 學位論文 2 大觀霉素的分離提純 抗生素的分離純化工序是從發(fā)酵液中提取制備符合國家藥典要 求的抗生素成品 大觀霉素能夠解離成陽離子 當它經(jīng)弱酸性陽離子 交換樹脂時將進行選擇性交換 吸附于樹脂 然后用洗脫劑把它沈脫 下來 如此得到的大觀霉素濃縮液帶有許多雜質(zhì) 主要是熱原 無機 鹽和有機物 熱原是發(fā)酵代謝產(chǎn)物 它是一種內(nèi)毒素 注射后會使人 感到惡寒高熱 發(fā)酵時加入的鉀 鈣 鈉 鎂等無機鹽和離子交換樹 脂中的某些不確定的有機雜質(zhì)都將與大觀霉素共存于洗脫液中 從濃 縮液中提取大觀霉素的工藝隨具體情況不同而不同 一種是調(diào)p h 值 到堿性 去除無機物和有機雜質(zhì) 最后回調(diào)p h 值到酸性 結晶大觀 鹽 另一種是控制結晶 步直接得到大觀鹽 1 發(fā)酵液草酸酸化預處理的原理 放罐后的大觀霉素發(fā)酵液中 除了大觀霉素外 還含有大量的菌 絲體 未用完的培養(yǎng)基 各種蛋白質(zhì)膠狀物和色素 重會屬離子及抗 生素產(chǎn)生菌的其他代謝產(chǎn)物等 這些雜質(zhì)有些是可溶的 有些是不可 溶的 為了有效的分離和提取大觀霉素 必須對發(fā)酵也進行預處理 以便通過過濾除去大部分的雜質(zhì) 發(fā)酵液中的雜質(zhì)很多 其中金屬離子和蛋白質(zhì)對提取的影響最 大 金屬離子和蛋白質(zhì)的存在用離子交換法提取時 會影響離子交換 樹脂的吸附量 因此 發(fā)酵預處理的重點是去除會屬離子和蛋白質(zhì)以 山東人學碗i 學位論文 及盡可能使抗生素轉(zhuǎn)入便于以后處理的相中 為了達到以上目的 采用調(diào)節(jié)p h 值至酸性的方法達到 酸化劑 采用草酸 因為草酸酸性溫和 腐蝕性小 并能與發(fā)酵液中的鈣鎂離 子結合 形成不溶性的鹽沉淀析出 同時起釋放抗生素的作用 蛋白質(zhì)的去除 生產(chǎn)中采用等電點法 用草酸做酸化劑 調(diào)節(jié)發(fā) 酵液的p h 值 使其達到蛋白質(zhì)的等電點以沉淀蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)是一 種兩性化合物 在等電點時 由于沒有相同電荷而互相排斥的影響 其顆粒極易相互碰撞凝聚而產(chǎn)生沉淀 因此 蛋白質(zhì)在等電點時 其 溶解度最小 最易形成沉淀 此時其他許多物理性質(zhì) 如粘度 膨脹 度 滲透壓等都變小 而有利于發(fā)酵液的過濾 大觀霉素采用新菌種發(fā)酵后 發(fā)酵液過程中的代謝發(fā)生變化 發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)成分也相應變化 因此 優(yōu)化草酸草酸p h 值 尋 找最合理的p h 值 將發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)大部分除去 以減輕離子交 換樹脂的工作壓力 提高料液質(zhì)量 2 大孔離子交換樹脂的吸附原理 在抗生素的提取分離中 利用離子交換法將抗生素從濾液中有選 擇性的交換到離子交換樹脂上 然后在適宜的條件下將其沈脫下來 這樣能使體積縮小到幾十分之一 從而使抗生素被分離提取 離子交換樹脂是一種具有網(wǎng)狀立體結構的高分子多元酸或多元 堿的聚合物 其結構優(yōu)良部分組成 一部分是網(wǎng)狀結構的高分子基團 1 4 山東人學碩l 學位論殳 性質(zhì)穩(wěn)定 不溶于酸堿和有機溶劑 是樹脂的骨架 另一部分是在網(wǎng) 狀結構骨架上的被溶液中陽離子 陰離子 交換的活性離子 當交換樹脂與溶液接觸時 溶液中的陽離子 陰離子 即與交換 生產(chǎn)的三個階段 成功的將l k 1 2 樹脂用于大觀霉素離子交換 提 高了交換收率和解析液的質(zhì)量 離子交換過程的機理雖然復雜 但可通過以下五個階段來進行 1 a 離子自溶液中擴散到樹脂顆粒表面 2 a 離子透過樹脂表面進入樹脂內(nèi)部的活性中心 3 a 離子與素質(zhì)活性中心r b 上的離子起交換反應 4 交換下來的b 離子自活性中心擴散到樹脂表面 5 b 離子再從樹脂表面擴散到溶液中 現(xiàn)在大觀霉素提取用的是l k 一1 l 樹脂 是一種弱酸型陽離子大 孔交換樹脂 樹脂柱采用固定式 每支樹脂柱中裝入4 0 4 5 噸的 樹脂 采用正吸附的方式 大觀霉素離子交換樹脂的優(yōu)化選型 是為了尋找一種更適于大 觀霉素吸附 而且吸附容量大 樹脂強度高的新型離子交換樹脂 樹 脂分廠生產(chǎn)的l k 1 2 樹脂為我們提供了選擇 l k 1 2 樹脂的選型我們 經(jīng)歷了小試 中試 上生產(chǎn)三個階段 山東人學瑣卜學位論文 四 大觀霉素的檢測方法 大觀霉素極性強 紫外最大吸收波長在1 9 0 r i m 附近 屬于末端 吸收區(qū) 加之結構中4 少位置的礦一酮一半縮酮非常不穩(wěn)定 容易降解 使大觀霉素的含量分析較為棘手 國內(nèi)鹽酸大觀霉素的檢測方法有以 下幾種 管碟法 生物效價法 萃取光度法 旋光法 高效毛細管 電泳法 高效液相法 高效液相色譜一蒸發(fā)光散射檢測法 電化學法 等 管碟法 生物效價法 使用肺炎球菌 k 7 1 為試驗菌 p h 7 0 磷酸鹽緩沖液為稀釋液 但此菌種不穩(wěn)定 使用時須轉(zhuǎn)種2 3 代的 新鮮培養(yǎng)物 菌液保存時間不能超過3 天 而且此菌的存活溫度低 檢測時加菌量多 不易掌握 檢測周期長 含量檢測誤差較大 黃莉 1 9 1 王艷秋f 8 l 等 采用藤黃八疊球菌代替肺炎球菌 以p h 7 8 磷酸鹽 緩沖液為稀釋液 得出的抑菌圈清晰 直徑大小符合藥典要求 效價 結果準確 而且克服了肺炎球菌的菌種缺陷 但此方法也存在檢測周 期長的缺點 車寶泉 l 包麗穎 引等采用高效毛細管電泳法 h p c e 毛細 管柱 5 0 m x5 4 6c m 有效長度為5 0c m 可變波長紫外檢測器 1 0m m o l l 的硼砂 p h 9 3 溶峰 并以0 4 5p m 的微孔濾膜過濾 操作電壓1 8k v 檢測波長1 9 2n m 此法不需要有機溶劑 排除了試 劑的干擾 出峰時f 日j 短 5 分鐘 該法的重現(xiàn)性和回收率較好 測 1 6 山東人學壩l 學位論文 定結果可靠 而且檢測的成本低 萃取光度法 7 是簡單的一種含量測定方法 萃取溶劑 二硫化碳 吡啶 異丙醇 3 0 2 0 5 0 顯色劑 水 吡啶 1 5 l 并加入0 0 0 2 m o l l 氯化銅配制 在7 2 1 分光光度計上于4 7 0n m 處測量鹽酸大觀 霉素的吸光度 該法操作雖然快速 簡便 但特異性不強 測定誤差 大 在實際工作中很少采用 旋光法ho l 使用w z z i s 數(shù)字式自動旋光儀 測定鹽酸大觀霉素含 量較穩(wěn)定 附加劑 溫度 時間及酸度等因素對旋光度測定基本沒有 影響 操作簡便 快速 重現(xiàn)性好 適用于醫(yī)院 制藥企業(yè)進行批量 生產(chǎn)時質(zhì)量控制和快速分析 吳燕 l 等采用高效液相色譜一蒸發(fā)光散射檢測法 h p l c e l s d 引入蒸發(fā)光散射檢測器作為檢測手段 同時在流動 相中添加了離子對試劑 選用三氟醋酸 t f a 水溶液與一定比例的 乙腈作為流動相 乙腈作為改性劑的加入 由于其較強的溶劑化作用 在適當?shù)谋壤龡l件下 可縮短藥物的分析時間 而且不影響色譜的分 離效果 該法操作簡便 省時 克服了微生物檢驗周期長 結果波動 性大的不足 可測定赫酸大觀霉素的準確含量 結果重現(xiàn)性好 可有 效的監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量 高效液相色譜 h p l c 法 是近年來大觀霉素的一種理想的檢測 方法 結果準確 檢測周期短 大約9 分鐘出峰 可用于大觀霉素生 1 7 山東大學碩士學位論文 分大于n 分時稱為a 行為 當n 分大于a 分時稱為n 行為 當n 分等于a 分時稱 為m 行為 5 家庭環(huán)境量表中文版 f e s c v 1 4 9 1 該量表由m o s s 于1 9 8 1 年編制 引進我國后進行了三次修改 具有較好的效 度和信度 該量表廣泛用于描述不同類型正常家庭的特征和危機狀態(tài)下的家庭狀況 評 價家庭干預下的家庭環(huán)境變化 以及對家庭環(huán)境與家庭生活的其它方面進行比 較 該量表分為1 0 個分量表 分別評價1 0 個不同的家庭特征 所評價的家庭特 征包括 1 親密度 即家庭成員之間相互承諾 幫助 支持的程度 2 情感 表達 鼓勵家庭成員公開活動 直接表達其情感的程度 3 矛盾性 家庭成員 之間公開表示憤怒 攻擊和矛盾的程度 4 獨立性 家庭成員的自尊 自信和 自主的程度 5 成功性 指將一般的活動變成成就性或競爭性活動的程度 6 知識性 指對政治 社會 智力 文化活動的興趣大小 7 娛樂性 即參加社 交和娛樂活動的程度 8 道德宗教觀 指對倫理 宗教和價值的重視程度 9 組織性 指安排家庭活動和責任時有明確的組織和結構的程度 1 0 控制性 使用固定家規(guī)和程序來安排家庭生活的程度 該量表所有的項目按選擇的答案進行評分 答 是 評 1 分 答 否 評 2 分 統(tǒng)計計分歸納為各量表得分以評價家庭特征 三 研究過程 調(diào)查時以班為單位 向家長說明此次調(diào)查的目地和意義及問卷的填寫方法 所有問卷和量表采用統(tǒng)一的指導語 由班主任發(fā)給學生家長或直接撫養(yǎng)人填寫 填好后當堂收回 確認每份問卷有效后 將問卷輸入一i l 理軟件 統(tǒng)計分析 將調(diào)查問卷統(tǒng)一整理 編碼后 將o d d 診斷篩查量表 r u t t e r c b c l f e s c v 量表數(shù)據(jù)輸入社會科學統(tǒng)計軟件 s p s s l 3 0 數(shù)據(jù)庫 得出各個 量表的數(shù)據(jù) 將所得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理 篩查出o d d 兒童并將o d d 兒童與正 常兒童進行對照 以探尋對立違抗性障礙的心理行為特征及發(fā)生的危險因素 分 析方法包括一般描述性分析 t 檢驗 x 2 檢驗 以下是自制兒童基本情況調(diào)查表各項指標數(shù)量化的方法 見表1 山東大學碩十學位論文 表1 各指標數(shù)量化方法 項目數(shù)量化方法 性別 年齡 民族 身高 體重 父親收入 母親收入 家庭人均收入 父親文化程度 母親文化程度 父親健康 母親健康 父親性格 母親性格 父親嗜好 母親嗜好 家庭經(jīng)濟狀況 對孩花的時間金錢 家族精神病史 家庭結構 家庭成員之間關系 父親與孩關系 母親與孩關系 其他家庭成員與孩關系 父親對孩未來期望 母親對孩未來期望 其他成員對孩未來期望 父親主要教養(yǎng)方式 母親主要教養(yǎng)方式 其他成員主要教養(yǎng)方式 家庭成員教養(yǎng)態(tài)度 孩對父親態(tài)度 孩對母親態(tài)度 孩對其他成員態(tài)度 孩入學年齡 班干部 孩身體健康狀況 個性特征 生活自理能力 適應能力 自信心 自尊心 男 l 女 2 實際值 漢 1 其他 2 實際值 實際值 實際值 實際值 實際值 初中以下 i 高中中專 2 大專 3 本科及以上 4 初中以下 i 高中中專 2 大專 3 本科及以上 4 健康 l 一般 2 體弱多病 3 健康 l 一般 2 體弱多病 3 外向 1 中間 2 內(nèi)向 3 外向 l 中間 2 內(nèi)向 3 吸煙 l 喝酒 2 吸煙喝酒 3 都不 4 吸煙 l 喝酒 2 吸煙喝酒 3 都不 4 富裕 i 中等 2 差 3 少 i 一般 2 較多 3 非常多 4 有 1 無 2 主干家庭 1 核心家庭 2 單親家庭 3 寄養(yǎng)家庭 4 融洽 1 一般 2 不融洽 3 親切 i 一般 2 疏遠 3 親切 l 一般 2 疏遠 3 親切 1 一般 2 疏遠 3 非常高 1 高 2 一般 3 低 4 非常高 i 高 2 低 3 非常高 1 高 2 一般 3 低 4 盡量滿足 1 耐心開導 2 嚴厲粗暴 3 盡量滿足 l 耐心開導 2 嚴厲粗暴 3 盡量滿足 l 耐心開導 2 嚴厲粗暴 3 一致 l 有時不一致 2 經(jīng)常不一致 3 信任 i 一般 2 不信任 3 信任 l 一般 2 不信任 3 信任 i 一般 2 不信任 3 實際值 是 1 否 2 健康 i 般 2 體弱多病 3 外向 1 中問 2 內(nèi)向 3 強 l 較強 2 一般 3 較差 4 很差 5 強 1 較強 2 一般 3 較差 4 很差 5 強 1 較強 2 一般 3 較差 4 很差 5 強 l 較強 2 一般 3 較差 4 很差 5 1 9 山東大學碩十學位論文 觀霉素泡騰片的報道外 還沒有其它劑型的相關報道 其次 加快大觀霉素工藝革新 在大觀霉素的生產(chǎn)工藝中 還 有許多可塑之處 需要科技人員去發(fā)現(xiàn) 優(yōu)化工藝 降低成本 提高 提取收率 另外 由于大觀霉素的微生物含量分析方法滯后生產(chǎn) 不能很 好的指導生產(chǎn) 高效液相分析方法雖然較微生物法簡單快捷 但由于 其分析步驟繁多 作樣價格偏高 生產(chǎn)過程中還不能普遍使用 因此 加大大觀霉素的提取工藝改進和分析方法的改進 是近 一段時間大觀霉素生產(chǎn)的關鍵 山東人學碗j 學位論文 第二章優(yōu)化發(fā)酵液預處理酸化p h 值 一 優(yōu)化發(fā)酵液酸化p h 值的試驗 2 1 1 試驗儀器 1 0 0 0m l 玻璃燒杯 攪拌棒 草酸 p h 試紙 酸度計 氫氧化鈉溶液 秒表 濾紙 漏斗 1 0 0m l 量桶 2 i 2 試驗方案 1 準備好4 個1 0 0 0m l 的燒杯 2 各取發(fā)酵放罐液5 0 0m l 3 邊攪拌邊加入草酸 并不斷用p h 試紙檢測p h 值 分別將分發(fā)酵液 酸化到2 o o 2 5 0 3 o o 3 5 0 最終酸化p h 值以酸度計檢測為 準 4 將濾紙折好 放在漏斗上面 漏斗下面接到l o om l 的量桶 5 分別過濾4 種酸化液 記錄到達2 0m l 濾液所需的時 日j 和2 分鐘時的 濾液體積 濾液送化驗室檢測微生物效價 6 將濾液分別用氫氧化鈉溶液將p h 值調(diào)到9 0 0 和1 0 0 0 沉淀2 小時 比較濾液中的沉淀數(shù)量 2 1 3實驗數(shù)據(jù) 2 l 山東人學壩i 學位論文 批號 酸化2 分鐘的2 0 m l 所 p h 9 0p h l 0 微生物 p h 值濾液m l 需的時的沉淀0 的沉效價 間s 淀 u m l 0 3 52 0 6172 2 55 66 43 8 9 7 2 5 32 11 5 04 25 34 0 2 4 3 o l 1 92 1 04 55 23 9 5 6 3 5 8 l82 455 06 13 9 1 9 0 3 62 0 32 1 51 5 0 5 6 5 94 0 4 6 2 5 42 21 5 05 25 64 l2 8 3 0 92 2 51 4 55 4 5 8 4 1 9 5 3 5 2 1 9 2 1 0 5 3 6 14 0 6 2 0 3 72 0 9172 3 05 15 93 8 9 3 2 5 21 9 51 5 54 95 44 0 1 2 3 0 3 1 81 5 04 85 53 9 7 6 3 5 71 7 52 155 25 73 9 2 4 0 3 82 0 22 01 4 54 86 04 2 1 0 2 5 8 2 3 5 1 4 0 4 5 5 64 2 9 4 3 0 3 2 2 1 4 5 4 9 5 64 2 3 5 3 5 22 12 1 04 85 84 1 7 8 2 1 4 實驗結果討論 表2 1酸化試驗數(shù)據(jù)表 從以上的酸化試驗結果可以看出 酸化p h 值在2 5 0 時 酸化液過 濾速度最快 酸化液的堿性蛋白沉淀量較少 而且酸化液的效價較高 說明在此酸化條件下 發(fā)酵液中的蛋白能有效去除 而且有利于發(fā)酵 液的過濾 山東人學碩j 學位論文 二 生產(chǎn)中優(yōu)化酸化p h 值試驗 優(yōu)化酸化p h 值試驗完成以后 對實驗結果分析發(fā)現(xiàn) 酸化 p h 值在2 5 左右時 濾液質(zhì)量情況較好 而且此p h 值下的濾速較快 微生物效價較高 說明對大觀霉素破壞較少 在生產(chǎn)中 將酸化p h 值調(diào)到2 5 左右 進行了大生產(chǎn)試驗 2 1 生產(chǎn)程序 1 發(fā)酵液放完罐后 與發(fā)酵放罐人員交接完體積后 打開酸化池攪 拌 邊攪拌邊加入草酸 并用p h 試紙檢測 待接近3 0 時 改用化驗 室酸度計檢測 最終p h 值控制在2 5 左右 2 酸化液繼續(xù)攪拌5 1 0 分鐘后即可通過轉(zhuǎn)鼓過濾 2 2 生產(chǎn)數(shù)據(jù)如下 山東人學碩卜學位論文 過濾濾餅所 日罐號 批放罐十 頂水 無菌 濾餅 時間含效價收率 期 號億m 3 h ht l m l 3 83 0 3 0 55 一 l3 8 6 4 5 干8 o914 58 9 5 2 3 9 3 0 8 0 5 6 一 l3 0 2 4 6濕6 o8l0 98 0 6 0 3 1 03 0 4 0 57 一 l3 9 4 l3 干5 09l2 18 8 2 5 3 1 l3 0 i 0 58 一 l3 6 9 4 4干6 08 5l l69 0 0 5 3 123 0 6 0 5 9 一 l2 9 58 7干6 08 l2 39 2 13 濕 3 133 0 2 0 6 0 一 l35 455 6 o8l0 79 8 2 2 粘 3 1 43 0 7 0 6 l 一 l3 7 3 0 l 濕6 o8 5l3 89 0 8 l 3 153 05 0 6 2 一 l3 6 8 8 9干6 091 2 4 8 0 13 3 163 0 3 0 6 3 一 l4 0 2 67干6 o8l3 09 2 5 9 濕 3 173 0 4 0 6 4 一 133 5 8 66 o9l l49 8 4 0 粘 3 183 0 l 0 6 5 一 l35 3 l2濕6 o8 51 l59 6 2 0 濕 3 1 93 0 2 0 6 6 一 13 9 4 l86 o8 1 0 69 1 0 6 粘 3 2 03 0 5 0 6 7 一 138 4 0 2 干 6 o7 12 29 3 58 濕 3 2 l 3 0 3 0 6 8 一 l3 9 5 lo6 08 5l2 09 0 3 l 粘 濕 3 2 2 3 0 4 0 6 9 一 l33 75 26 07 5l l8 8 7 7 4 粘 濕 3 2 33 0 i 0 7 0 一 l3 2 5 5 05 ol2l2 89 2 4 l 粘 表2 2 酸化試驗批次過濾數(shù)據(jù)表 t a b 2 2f i l t e rd a t a0 fa c idt e s tb a t c h es 山東大學碩 1 學位論文 2 3 結果分析 調(diào)整酸化p h 值生產(chǎn) 轉(zhuǎn)鼓過濾情況良好 濾餅中所含效價比試驗 前降低了3 i 過濾收率提高了2 4 2 7 山東人學碩i 學位論義 第三章離子交換樹脂的選型 一 l k 12 樹脂的選型的小試 實驗共分二個階段進行 第一階段 魯抗樹脂分廠生產(chǎn)的新型1 群 2 群樹脂與生產(chǎn)中在用的l k 1 1 樹 脂的吸附解析對照試驗 比較3 種樹脂的質(zhì)量指標 尋找更適合大 觀霉素生產(chǎn)的新型樹脂 3 1 1實驗儀器及試劑 三支小型的試驗樹脂柱 膠皮管 塑料桶 燒杯 2m o i l 的鹽酸 氫氧化鈉溶液 0 6m o i l 的鹽酸溶液 純化水 3 1 2 試驗過程 l 各取1 0 0m l 的三種樹脂 分別裝入樹脂柱 2 分剔用三倍樹脂體積的2 m o i l 的鹽酸和氧氧化鈉溶液處理2 遍 3 吸附大約4 0 倍樹脂體積的濾液 4 用0 6m o l l 的赫酸做解析劑進行解析 3 1 3 實驗數(shù)據(jù) 山東人學碩f 學位論文 序樹脂解析液解析液解折液解析液的 收率 號的效價的體積的灰分 色濁 u m lm l 色濁 1 群l6 2 4 92 7 52 9 4 2 l 9 7 9 7 l 2 撐l45 2827 53 4 4 2 l8 7 5 9 l k 1ll7 6 732 4 52 97 22 9 4 9 3 l 群2 0 7 952 2 82 98227 0 9 6 22 撐18 0 78 25 23